Изменение восстановительных и генопротекторных свойств солей фенозана под действием хлебопекарных дрожжей Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 644

Е. В. Никитина, О. В. Старовойтова, З. Ш. Мингалеева,

О. А. Решетник

ИЗМЕНЕНИЕ ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ И ГЕНОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ СОЛЕЙ ФЕНОЗАНА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ХЛЕБОПЕКАРНЫХ ДРОЖЖЕЙ

Исследование солей фенозана натрия и калия выявило их высокую восстановительную силу как исходных веществ, так и после воздействия на них в ростовых условиях 8ассИаготусе8 сегеу1,^а, при чем изменения антиоксидант-ных свойств имели характер немонотонный и нелинейный понижению концентрации солей. Исходные соли феназанов и возможные продукты их кометабо-лизма не проявляли генотоксических эффектов, а напротив продемонстрировали генопротекторные свойства против химического агента.

В связи с развитием технологий хлебопечения, а также с повышением требований к качеству готовой продукции возрастает потребность данной отрасли в пекарских дрожжах. Совершенствование технологии производства хлебобулочных изделий путём улучшения технологических показателей качества дрожжей наиболее эффективна на фоне необратимого ухудшения качества муки и молочных продуктов.

Путем направленного корректирования технологии производства хлеба введением активных дрожжевых клеток в тесто можно получать хлеб, удовлетворяющий потребностям рынка. Штаммы БассЬагошусев сегеу1в1а являются промышленно ценными микроорганизмами, область применения которых огромнейшая. Важнейшим условием получения высококачественной продукции является использование дрожжей, обладающих высокой ферментативной активностью.

Расы дрожжей, применяемых в промышленных условиях, не всегда отличаются высокой эффективностью, для повышения этого показателя может быть использовано обогащение питательных сред для ферментации закваски, но это экономически не выгодно.

В настоящее время разработаны различные физико-химические методы интенсификации процессов выращивания микроорганизмов и повышения их физиологической активности. Среди наиболее эффективных методов - применение биостимуляторов. Данный способ позволяет увеличить продуктивность промышленных процессов культивирования микроорганизмов, а также повысить качественные характеристики получаемого продукта без значительных дополнительных затрат. Поэтому исследования в области интенсификации при получении хлебопекарных дрожжей и повышение их качества являются актуальными. Перспективным направлением исследований является поиск высокоэффективных нетоксичных стимуляторов и стабилизаторов для промышленного применения. Интерес представляют данные о влиянии таких веществ на микробную клетку, знания о механизме действия добавок позволит повысить эффективность их использования в промышленных процессах выращивания микроорганизмов.

К новым веществам, проявляющим свои свойства в малых дозах, можно отнести фенозаны калия и натрия (натриевая (калиевая) соль 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпропиловой кислоты). Первоначально фенозан был получен в водонерастворимой форме, что ограничивало сферы его применения [1].

Этот синтетический антиоксидант активно исследуется применительно для разработки новых лекарств сверхнизких доз [2]. Фенозан является не только антиоксидантом [2], но в малых дозах способен активировать протеинкиназы [3], альдолазу, лактатдегидро-геназу [4]. По данных ряда авторов фенозан калия способен облегчать полимерные трансформации липидов, увеличивать беспорядочность липидного бислоя, причем эффекты зависели от качественного состава фосфолипидов [5].

Целью работы было оценить восстановительные и генопротекторные свойства синтезированного водорастворимого производного фенозана (солей К и Ыа), проследить изменения этих показателей при культивировании хлебопекарных дрожжей вместе с добавками для прогнозирования возможного использования в целях стимулирования функциональной активности промышленно значимых рас сахаромицет.

Результаты исследований и обсуждение

Восстановительная сила. Исследования восстановительной силы солей фенозана показало, что на порядок большей активностью обладала натриевая соль фенозана по сравнению с калиевой. В случае фенозана натрия наибольшая активность зафиксирована при концентрации 0,01 г/л, а в случае фенозана натрия - 0,1 г/л. Причем величина восстановительной активности не зависела прямо пропорционально от используемых концентраций и проявляла волнообразный характер, что характерно для веществ, физиологическая активность которых проявляется в малых и сверхмалых дозах [5].

Восстановительный потенциал культуральной жидкости с добавлением фенозанов после культивирования с сахаромицетами на синтетической среде возрастал в случае натриевой соли и мало изменялся в случае калиевой по сравнению с индивидуальными веществами. Прямой дозозависимый эффект наблюдали в обоих случаях.

После культивирования дрожжей на богатой органическими веществами среде с мелассой было выявлено снижение восстановительной силы натриевой добавки, и возрастание - калиевой. Снижение восстановительной активности может быть следствием более быстрых метаболических изменений натриевой соли в реакциях кометаболизма с органическими субстратами ввиду своей большей реакционноспособности. В случае фенозана калия возможно проявление синергических эффектов компонентов питательной среды.

Повышенный восстановительный потенциал культуральных жидкостей видимо отражает также присутствие в среде продуктов метаболизма пекарских дрожжей, в том числе и антиоксидантного характера [6]. Увеличение восстанавливающей способности культуральной жидкости в случае внесения фенозанов косвенно может свидетельствовать о повышении продуктивности 8асскаготусе8 сетеу1$1ае.

ДНК-повреждающее и протективное действие. Исследование фенозана натрия не выявили ДНК-повеждающего действия ни на один из используемых тест-штаммов Е.соН (рис.1 а). Незначительное понижение индекса выживаемости наблюдали только при тестировании штамма Е.соН ЫугЛ". Калиевая добавка проявила ДНК-повреждающую активность в концентрации 0.1 г/л по отношению ко всем тест штаммам (рис. 1 б).

Высокие дозы фенозана Ыа и К мало эффективными в отношении защиты ДНК от химических агентов (рис. 2). Натриевая соль проявляла ДНК-протективную активность в случае действия низких доз фенозана натрия (0.0001 и 0.000001 г/л), что выражалось в полном элиминировании ДНК-повреждающего действия фурацилина и достижении 100 % индекса выживания. Аналогичная тенденция характерна и для калиевой соли, однако полное снятие ДНК-повреждающего действие фурацилина было выявлено только для штаммов Е.соН КееЛ" и Ро!Л".

Рис. 1 - ДНК-повреждающее действие фенозана натрия (а) и фенозана калия (б)

Л

120

S0

40

■ Fd/V

□ FfecAr

□ іугА

І

ЕЛ

Рис. 2 - ДНК-протективное действие фенозана натрия (а) и фенозана калия (б)

Ввиду высокого содержания органических веществ в питательной среде с мелассой, исследование ДНК-повреждающего действия представлялось невозможным. Поэтому изменение силы ДНК-повреждающего и протективного действия исследуемых добавок тестировали после культивирования на синтетической среде (рис. 3). Культуральные жидкости как с внесением разных доз исследуемых добавок, так и без них не проявляли отрицательных качеств. Это доказывает, что в процессе культивирования дрожжей с солями фе-нозана не происходило образование опасных продуктов метаболизма, в том числе промежуточных метаболитов фенозанов.

вв

Рис. 3 - ДНК-повреждающее действие культуральной жидкости с добавлением фе-нозана натрия (а) и фенозана калия (б) после культивирования дрожжей на синтетической среде

ДНК-протективные свойства культуральной жидкости менее выражены, чем у индивидуальных веществ (рис. 4), возможно, это связано с частичной трансформацией исходных веществ в форму с меньшей активностью. Наблюдалась тенденция, проявляющаяся в большей эффективности элиминировать ДНК-повреждающий эффект фурацилина в случае использования малых доз тестируемых препаратов (0.000001 г/л). Как и в случае восстановительной силы наблюдали нелинейный и немонотонный в зависимости от дозы характер изменения ДНК-протективной силы, подобное поведение является особенностью веществ, действующих в малых и сверхмалых дозах [2]. В некоторых случаях эта зависимость бимодальная: эффект возрастает при сверхмалых дозах препаратов, затем по мере увеличения дозы уменьшается, сменяясь «мертвой зоной» и вновь усиливаясь. В нашем случае не была достигнута «мертвая зона», однако наблюдали аналогичный тренд колебаний восстановительной и протективной силы.

б

Рис. 4 - ДНК-протективное действие культуральной жидкости с добавлением фенозана натрия (а) и фенозана калия (б) после культивирования дрожжей на синтетической среде

Проявление солями фенозана генопротекторных свойств может быть следствием наличия антиоксидантной активности, а так же способности фенозана выступать в роли активатора ферментов, не проявляя свойств ингибитора [2]. Динамика антиоксидантной силы фенозанов натрия и калия в процессе воздействия сахаромицет не коррелировала с изменением генопротекторной активности. Под действие исследуемых веществ, возможно, происходила активация неповрежденных ферментативных репарационных систем в случае использования того или иного штамма E.coli с дефектом одной из систем восстановления структуры ДНК, таким образом проявлялись компенсаторные реакции мутантных бактериальных клеток.

Полученные результаты свидетельствуют о более высокой восстановительной активности фенозана натрия по сравнению с калиевой солью как индивидуальные вещества, так и в составе культуральной жидкости после культивирования хлебопекарских дрожжей. Исследуемые вещества не проявляли ДНК-повреждающих свойств, а напротив, оказались ДНК-протекторами против химических генотоксикантов. Это согласуется с данными о роли фенозана калия в защите от активных форм излучения [5], причем наибольшей биологической активностью обладали наименьшие концентрации исследуемых веществ - натриевая и калиевая соли 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпропионовой кислоты.

Экспериментальная часть

Исследуемые вещества. Соли натрия и калия фенозана были синтезированы на кафедре синтетического каучука в Казанском государственном технологическом университете. Представляют собой порошок белого цвета, растворимый в воде. В работе использовали концентрации солей 0.1, 0.01, 0.0001, 0.000001 г/л.

Культивирование дрожжей. Saccharomyces cerevisia LV-7 проводили на среде с мелассой (%): меласса - 12, KCl - 0.1; (NH4)2HPO4 - 0.12; (NH4)2SO4 - 0.24, биотин - 0.005, водопроводная вода - 87.535, и на минеральной среде (на г/л дистиллированной воды): (NH4)2SO4 - 1.0, MgSO47H2O - 0.25, KH2PO4 - 3.0, Na2HPO412H2O - 4.5, дрожжевой экстракт - 0.05, рН среды 6,5. В опытные образцы добавляли натриевую или калиевую соль 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпропионовой кислоты (фенозан натрия или калия) в исследуемых концентрациях (0.1, 0.01, 0.0001, 0.000001 г/л). Выращивание культуры дрожжей проводили в течение 24 ч при 30 0С. Культуральную жидкость подвергали тестированию.

Восстановительная сила. Определение восстановительной силы проводили, согласно Lertittikul с соавторами (2005) [7]. Один мл исследуемого вещества или культуральной жидкости смешивали с 1 мл 0,2 М калий-натриевого фосфатного буфера (рН 6,5) и 1 мл 1% феррицианида калия. Реакционную смесь инкубировали 20 мин при 50 0С, после чего добавляли 1 мл 10% трихло-руксусной кислоты. Смесь центрифугировали при 750 g 10 мин при комнатной температуре. К супернатанту (1 мл) добавляли 1 мл дистилированной воды и 200 мкл 0,1 % FeCl3. Контроль готовили аналогично, только заменяли 1% феррицианида калия на дистиллированную воду. Абсорбцию реакционной смеси измеряли при 700 нм. Редуцирующую силу выражали как увеличение абсорбции при 700 нм относительно контроля.

ДНК-повреждающий тест. В исследованиях использовали штаммы Escherichia соИ: Wp - дикий тип (работают все системы репарации);

Pol А" - polA" 1 (нарушен синтез ДНК-полимеразы 1);

Uvr A" - uvrA" 155 (нарушена эксцизионная репарация);

Rec A" - recA" (нарушена пострепликативная репарация, общая рекомбинация).

Принцип метода заключается в селективном ингибировании роста мутантных штаммов по сравнению с диким типом.

За 12-15 часов до проведения эксперимента культуру тестерного штамма переносили стерильно со скошенного агара в пробирки с 5 мл мясо-пептонного бульона (МПБ) для получения «ночной культуры». Культивировали при 37°С.

Ночную культуру переносили в колбы с МПБ и разливали суспензию по 4-5 мл в пробирки стерильно. В негативных контрольных вариантах в колбочки добавляли только культуру и контроль (растворитель, культуральную жидкость). В опытные колбочки добавляли и исследуемый раствор (культуральную жидкость), так чтобы конечная концентрация фенозана соответствовала исследуемой. Измеряли начальную относительную плотность по поглощению при 600 нм. Затем смесь инкубировали в течение 5-6 ч при температуре 37°С. После чего измеряли плотность суспензии (Дкон) и определяли интенсивность роста культуры в каждом варианте опыта ДД.

В экспериментах параллельно с мутантными штаммами обязательно засевали дикий тип ^р). Итого, при проверке вещества в одной концентрации на одном дефектном штамме необходимы следующие варианты опыта:

Wp - контроль (К), т.е. культура микроорганизмов и растворитель;

Wp - опыт (О), т.е. культура микроорганизмов и исследуемое вещество; иУГ А - контроль (К), т.е. культура микроорганизмов и растворитель; иУГ А - опыт (О), т.е. культура микроорганизмов и исследуемое вещество.

Для определения силы влияния вещества на мутантный штамм использовали формулу:

где О(Деф) - ДД дефектного штамма в опыте; 0(дик) - ДД дикого штамма в опыте; К(дик) - ДД дикого штамма в негативном контроле; К(деф) - ДД дефектного штамма в негативном контроле.

Процент выживаемости 96-100% указывал на отсутствие ДНК-повреждающей активности, 86-96% - активность слабая, менее 85%-наличие ДНК-повреждающего действия. В качестве позитивного контроля и для проверки генопротекторной силы использовали раствор фурацилина (500 мкг/мл) в воде.

1. Химические добавки к полимерам (справочник). М.: Химия, 1981. 264 с.

2. Бурлакова Е.Б.. Особенности действия сверхмалых доз биологически активных веществ и физических факторов низкой интенсивности// Российский химический журнал. 1999. Т.43. №5. С.3-11.

3. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б. Natural (a-tocopherol) and synthetic (phenozan po-

мембраны. 1998. Т.15. № 2. С.199-212.

4. Трещенкова Ю.А., Голощапов А.Н., Бурлакова Е.Б. Влияние низких доз фенозана на лактатде-гидрогеназу и микровязкость микросомальных мембран клеток мозга мышей// Радиац. биол. ра-диоэкол. 2003. V.43. N.3. С.320-322.

5. Burlakova E.B., Goloshchapov A.N., Konradov A.A., Molochkina E.M., Treshchenkova Yu.A., Shishkina L.N. Antioxidants as radioprotecting agents for low-level irradiation// Inter. Congress Series. 2002. V.1236. P.387-390.

6. Santiago L., Mori A. Antioxidant defenses of baker's yeast against free radicals and lipid peroxides in rat brain// Arch. Biochem Biophys. 1993. V.306. №.1. P.16-21.

7. Lertittikul W., Benjakul S., Tanaka M. Characteristics and antioxidative activity of Maillard reaction products from a porcine plasma protein-glucose model system as influence by pH// Food Chemistry. 2007. V.100. P.669-677.

© Е. В. Никитина - канд. биол. наук, доц. каф. технологии пищевых производств КГТУ;

О. В. Старовойтова - асп. той же кафедры; З. Ш. Мингалеева - канд. техн. наук, доц. той же кафедры; О. А. Решетник - д-р техн. наук, проф. каф. технологии пищевых производств КГТУ.

ДД = Д кон - Днач

Литература

tassium salt) antioxidants. protein kinase C activity in a broad concentration range (10-4-10-20 M)// Ehoh.