CC BY
25
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11 2008 Прил. к вып. 1
ВНУТРЕННИЕ БОЛЕЗНИ
УДК 616.132.2-004.6
Л. В. Васина, Г. А. Иванов, А. В. Луговая, Л. Ю. Морозова
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ СБ 59-«ПОЗИТИВНЫХ» КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ОСТРОМ КОРОНАРНОМ СИНДРОМЕ
Клиническая больница № 122 им. Л. Г. Соколова ФМБА России, Санкт-Петербург
В большинстве стран мира ишемическая болезнь сердца занимает первое место среди всех причин смертности и инвалидизации населения. Наиболее значимое и опасное проявление ИБС—острый коронарный синдром (ОКС). Он преобладает и в структуре смертности от всех сердечно-сосудистых заболеваний, и в структуре частоты госпитализаций, связанных с ИБС. Первичным механизмом развития острого коронарного синдрома является разрыв атеросклеротической бляшки с последующим тромбозом коронарной артерии. В настоящее время атеросклероз рассматривается как хронический воспалительный процесс в артериальной стенке, развивающийся в ответ на триггерные факторы, приводящие к дисфункции эндотелия, аккумуляции липидов внутри интимы, привлечению лейкоцитов и гладкомышечных клеток к интиме сосуда и отложению внеклеточного матрикса [1].
Согласно современным представлениям, «ранимая» бляшка содержит большое количество макрофагов и Т-лимфоцитов, которые секретируют медиаторы воспаления и ферменты, разрушающие фиброзную покрышку, делая её более подверженной разрыву.
Циркулирующие активированные мононуклеарные фагоциты, продуцируя провос-палительные цитокины ИЛ-1Р и ФНО-а, способствуют увеличению экспрессии на эндотелиальных клетках ряда адгезивных молекул, секреции эндотелием ИЛ-6 и металлопротеи-наз, а также изменяют сократимость гладкомышечных клеток сосудов, результатом чего является продукция белков острой фазы, компонентов комплемента и фибриногена [2].
Исследования последних лет показали, что активация системы комплемента значительно увеличивает ишемическое повреждение тканей при экспериментальном инфаркте миокарда в результате прямого действия на кардиомиоциты комплекса, лизи-рующего мембрану [3-6]. Ингибитор данного комплекса протектин (СБ 59) значительно экспрессирован в норме на мембране кардиомиоцитов, но его содержание снижается в зоне инфаркта, в результате чего сердечная ткань становится чувствительной к эффектам мембранолитического комплекса [7-11]. При этом экспрессия протектина на эндотелиальных клетках в зоне инфаркта миокарда не изменяется, что свидетельствует о способности эндотелия регулировать количество данного рецептора на мембране в ответ на различные стимулы. Считается, что протектин может быть «израсходован» в результате защитной реакции, направленной на сохранение целостности клеточной мембраны кардиомиоцитов, поскольку данный рецептор элиминируется с поверхности клетки вместе с комплексом, лизирующим мембрану. Полагают, что только повреждённые
© Л. В. Васина, Г. А. Иванов, А. В. Луговая, Л. Ю. Морозова, 2008
кардиомиоциты благодаря воздействию лизирующего комплекса в зоне инфаркта миокарда подвергаются утилизации фагоцитами, тем самым ограничивая область повреждения от жизнеспособных тканей [12-14]. Данные литературы, касающиеся идентификации в периферической крови клеток с противовоспалительным фенотипом, несущих рецепторы CD 59 (ингибитора ли-зирующего мембрану комплекса) и их роли в развитии атеросклероза, противоречивы. Целью данной работы является количественная оценка клеток с противовоспалительным фенотипом, экспрессирующих на своей поверхности антигены CD 59, для уточнения их роли в патогенезе заболевания.
Материалы и методы. Для решения поставленных задач было обследовано 83 человека (21 женщина и 62 мужчины в возрасте от 49 до 72 лет), поступивших в стационар по поводу различных форм ишемической болезни сердца. Все обследованные были разделены на 3 группы: в первую группу вошли 67 пациентов, поступивших по поводу нестабильной стенокардии, во вторую —16 больных с острым инфарктом миокарда (из них у 6 был острый инфаркт миокарда с зубцом Q, у 1Q на ЭКГ регистрировались изменения в виде депрессии сегмента ST). В третью — (контрольную) группу вошли 14 практически здоровых мужчин в возрасте 49-56 лет. Диагноз нестабильной стенокардии и острого инфаркта миокарда основывался на результатах клинического обследования, изменениях ЭКГ, лабораторных показателях и данных эхокардиографии. У всех больных определяли содержание в сыворотке крови липидов и аполипопротеинов. Уровень общего холестерина, триглицеридов и холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) у больных измеряли на биохимическом анализаторе Spectrum (США). Содержание аполипопротеинов А-1, В и липопротеина (а) определяли с помощью иммунологического турбидиметрического метода.
Определение количества CD 59-«позитивнъгх» клеток в периферической крови больнъх остръм коронарнът синдромом
Оценку уровня экспрессии CD 59 антигена проводили в цельной гепаринизированной крови с использованием моноклональных антител фирмы Caltag Laboratories: anti-CD 59, конъюгированных с флуоресцеинизотиоционатом (FITC) (mouse IgG2a isotype) и соответствующих изотипических контролей.
Во всех случаях объем вносимых антител определялся инструкциями, соответствуя соотношению 1 мкг антител на 1Q6 клеток. Для каждой пробы использовали 1QQ мкл цельной гепаринизированной крови. Эритроциты цельной крови лизировали раствором OptiLyseC (Coulter Corp., USA) в течение 1Q минут при 18-25°, после добавления фосфатно-солевого буфера пробы выдерживали в течение 5 минут и анализировали на цитометре.
Цитометрический анализ лимфоцитов, и моноцитов и гранулоцитов проводили на проточном цитофлуориметре Partec Pas (Германия). Накопление производили до 5QQQ событий в лимфоцитарной, моноцитарной и гранулоцитарной областях. Данные анализировали с помощью программы FloMax.
Результаты исследования. Содержание липидов, аполипопротеинов А-1, В и липопротеина (а) представлены в табл. 1.
Таблица 1
Показатели липидного обмена у больных c острым коронарным синдромом
Показатель Контроль (N = 14) Больные с нестабильной стенокардией (N=67) Больные с острым инфарктом миокарда (N = 16)
Общий холестерин (ммоль/л) Триглицериды (ммоль/л) а-холестерин (ЛПВП) (ммоль/л) Аполипопротеин А1 (ммоль/л) Аполипопротеин В (ммоль/л) Липопротеин (а), Ьр(а) (ммоль/л) 3,72 і 1,22 Q,96 і Q,21 1,52 і Q,22 2,93 і Q,91 1,99 і Q,42 14,1 і 2,1 5,97 і 1,19* 2,51 і Q,14* Q,71 і Q,ll* 2,41 і 1,Q9 3,18 і 1,Q2* 22,5 і 2,61* 6,59 і 1,96* 3,Q3 і Q,19** Q,57 і Q,16* 2,37 і Q,15 3,99 і Q,93* 23,7 і 2,92*
* Результат статистически достоверно отличается от нормы (р < 0,05) ** Статистически достоверные различия между группами (р < 0,05).
Как видно из данных, представленных в табл. 1, у больных с острым коронарным синдромом отмечались определённые нарушения липидного обмена, степень выраженности которых увеличивалась по мере нарастания тяжести заболевания. Обращало на себя внимание повышение в крови больных общего холестерина, триглицеридов, аполипопротеина В и липопротеина (а) (р < 0,05 по сравнению с контролем). Следует отметить достоверное по сравнению с контрольной группой снижение в крови больных с острым коронарным синдромом содержания холестерина ЛПВП (а-холестерина) (р < 0,05). Проведённое обследование показало, что уровень аполипопротеина А-1 у больных с острым коронарным синдромом практически не отличался от контрольной группы.
Использование моноклональных антител к различным рецепторам позволяет ко -личественно оценить их распределение на клетках и выявить усиление или подавление экспрессии при различных заболеваниях. С целью изучения противовоспалительных механизмов нами проводилось определение количества СЭ 59-«позитивных» клеток в периферической крови больных с острым коронарным синдромом.
На рис. 1 приведен пример исследования экспрессии антигена СЭ 59 (протектин) клетками периферической крови у больных острым коронарным синдромом и в контрольной группе.
А 50
40
30-
со
о 20
10
0
Б 250 200 -150 -
сл
13
о 100 о
50
0
1000
10
БЫ СБ59 БІТС
10
БЫ СБ59 ИТС
1000
Рис. 1. Содержание иммунокомпетентных СБ 59-«позитивных» клеток периферической крови при остром коронарном синдроме и в контрольной группе
А — контрольная группа, Б—больные с острым коронарным синдромом. Обозначения: слева—по оси абсцисс (БЫ) — интенсивность флуоресценции клеток (в условных единицах); по оси ординат — число клеток с данным уровнем флуоресценции. ЯШ — зона накопления СБ59-«позитивных» клеток. Справа: по оси абсцисс (БЫ) — интенсивность зелёной флуоресценции клеток (окрашиваемость аи1;і-СБ59 — БІТС — МКАТ). В квадранте РАЗ — количество СБ 59-«негатитивных» клеток, в квадранте РА4 — количество СБ 59-«позитивных» клеток.
Как видно из представленных данных, у больных с острым коронарным синдромом отмечается значительное по сравнению с контролем увеличение в крови клеток, экспрессирующих рецептор СБ 59 (в представленном выше примере исследования 66,87 % клеток несли на своей мембране антиген СБ 59, в контроле процент клеток, имеющих на своей поверхности данный антиген, составил 2,51 %). Также выявлено достоверное (р < 0,05) увеличение относительного количества СБ 59-«позитивных» клеток в группе больных с острым инфарктом миокарда по сравнению с группой больных с нестабильной стенокардией (относительное содержание СБ 59-«позитивных» клеток в группе больных с нестабильной стенокардией составило 41,8 ± 9,4 %, а в группе больных с острым инфарктом миокарда — 60,6 ± 8,4 %). Нами установлена обратная корреляция между содержанием холестерина ЛПВП и количеством СБ 59-«позитивных» клеток периферической крови (г=-0,62, р < 0,05) и прямая—с уровнем липопротеина (а) (г = 0,59, р < 0,05).
Обсуждение результатов. В результате проведённых исследований у больных ишемической болезнью сердца выявлены свойственные атеросклерозу специфические нарушения липидного обмена, характеризующиеся повышением уровня общего холестерина, триглицеридов, аполипопротеина В и липопротеина (а). При этом у всех больных отмечался низкий уровень холестерина липопротеинов высокой плотности. Поскольку атерогенные классы липопротеинов (хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности и особенно липопротеины низкой плотности) являются потенциально провоспалительными факторами, можно предположить, что воспалительный процесс при атеросклерозе является следствием универсальной ответной реакции эндотелия на повреждающее действие модифицированых липопротеинов низкой плотности [15, 16]. Окисленные ЛПНП действуют как хемоаттрактанты для Т-лимфоцитов и моноцитов, иммобилизируют макрофаги в стенке артерии, повышают захват ХС ЛПНП макрофагами. Кроме того, они оказывают прямое токсическое влияние на эндотелиальные клетки, субэндотелий и гладкомышечные клетки. В воспалительный процесс вовлекается несколько типов иммунокомпетентных клеток: прежде всего, это моноциты, активированные Т- и В-лимфоциты и, возможно, тучные клетки [17-19].
Последующее течение воспалительного процесса опосредуется межклеточным взаимодействием моноцитов и эндотелиоцитов, а кульминацией становится интенсификация апоптоза [17, 20]. Важно отметить, что мембранные везикулы погибших клеток содержат анионные фосфолипиды, которые, в свою очередь, дополнительно индуцируют адгезию моноцитов к эндотелию [21]. Таким образом, формируется порочный круг, приводящий в конечном итоге к усугублению первичного повреждения.
Активация апоптоза приводит к увеличению продукции мононуклеарными фагоцитами, эндотелиальными клетками, фибробластами, активированными лимфоцитами и другими иммунокомпетентными клетками провоспалительных цитокинов, белков острой фазы, компонентов комплемента и фибриногена [22, 23]. Отложение холестерина в сосудистой стенке также способствует активации системы комплемента.
Антиген СБ 59 (протектин, заякоренный гликофосфолипидной «ножкой» в клеточной мембране белок) представлен на многих клетках периферической крови (Т- и В-лим-фоцитах, моноцитах, макрофагах, натуральных киллерах, гранулоцитах). Также данный рецептор значительно выражен на эндотелиоцитах [24]. Система комплемента способна повреждать целостность мембраны непосредственно в результате действия комплекса, атакующего мембрану. Гликопротеин СБ 59 осуществляет важную функцию регуляции системы комплемента, ингибируя комплекс компонентов комплемента С8 и С9 путём связывания с С8 в составе комплекса С5Ь-8 и подавления погружения
и развертывания С9 в клеточной мембране [8, 9, 25]. Формирование на поверхности клеток лизирующего комплекса может вызвать везикуляцию протектин-содержащих частиц, тем самым увеличивая повреждающее действие комплекса, атакующего мембрану. Удаление с клеточной поверхности мембраноатакующего комплекса в составе с его ингибитором CD 59 приводит к формированию трансмембранных каналов, притоку Са2++ в клетку, деполяризации мембраны и образованию тромбоксана А2 [26]. Формирование лизирующего мембрану комплекса на эндотелии способствует активации каскада коагуляции в результате повреждения эндотелиальной мембраны [27]. Установлено, что про-тектин, циркулирующий в крови, способен связываться с липопротеинами высокой плотности, которые осуществляют его транспорт между клетками периферической крови и эндотелием. Одним из механизмов противовоспалительного действия холестерина липопротеинов высокой плотности является перенос CD 59 от одного типа клеток к другому, результатом чего является защита от лизирующего мембрану комплекса [28-30].
Как видно из представленных данных, у больных с острым коронарным синдромом отмечается значительное по сравнению с контролем увеличение в периферической крови клеток, экспрессирующих антиген CD 59, нарастающее в зависимости от тяжести заболевания.
Выявленная нами положительная корреляционная связь между количеством клеток с фенотипом CD 59-«позитивные» и содержанием липопротеина (а) и отрицательная с уровнем а-холестерина (холестерина липопротеинов высокой плотности) свидетельствует об активации компенсаторных противовоспалительных механизмов при остром коронарном синдроме.
Таким образом, поскольку гликопротеин CD 59 осуществляет важную функцию регуляции системы комплемента, ингибируя комплекс, атакующий мембрану, увеличение экспрессии данного антигена на клетках периферической крови можно расценивать как активацию противовоспалительных механизмов в ответ на повреждающее действие липопротеинов низкой плотности при остром коронарном синдроме.
Summary
Vasina L. V., Ivanov G. A., Lugovaya A. V., Morozova L. Yu. Change of Content of circulating CDs 59-“positive” cells of peripheral blood at acute coronary syndrome.
It is stated that patients with an acute coronary syndrome indicate significant in comparison with the control one increase in peripheral blood of cells expressing CD 59-“positive” antigen accumulating depending on the seriousness of the disease. Positive correlated connection between the number of cells with CD 59+ phenotype and the content of Lp (a) both negative with a level and HDL-cholesterol is revealed. Thus, as CD 59 carries out the important function of system complement regulation, oppressing the complex attacking a membrane, the increase of given antigen expression on the peripheral blood cells can be regarded as activation of anti-inflammatory mechanisms in response to damaging action of low density lipoproteins at an acute coronary syndrome.
Key words: acute coronary syndrome, CD 59 (protectin), system complement.
Литература
1. Rossen R. D., Michael L. H., Kagiyama A., Savage H. E., Hanson G., ReisbergM. A., Mo-ake J. N., Kim S. H., Self D., Weakley S., Giannini E. and EntmanM. L. Mechanism of complement activation after coronary artery occlusion: evidence that myocardial ischemia in dogs causes release of constituents of myocardial subcellular origin that complex with human C1q in vivo // Circ. Res. 1988. 62. P. 572-584.
2. Geertinger P. and Sorensen H. Complement as a factor in arteriosclerosis // Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. A. 1970. 78. P. 284-290.
3. Arroyave C. and Muller-Eberhard H. J. Interactions between human C5, C6 and C7 and their functional significance in complement-dependent cytolysis // J. Immunol. 1973. 3. P. 536-545.
4. Bhakdi S., Kaflein R., Halstensen T. S, Hugo F., Preissner K. T. and Mollnes T. E. Complement S-protein (vitronectin) is associated with cytolytic membrane bound C5b-9 complexes // Clin. Exp. Immunol. 1988. 74. P. 459-464.
5. Crawford M.H., Grover F. L., Kolb W. P., McMahan C. A., O’Rourke R.A., McManus L.M. and Pinckard R. N. Complement and neutrophil activation in the pathogenesis of ischemic myocardial injury // Circulation. 1988. 78. P. 1449-1458.
6. Earis J. E. and Bernstein A. Complement activation after myocardial infarction // Chest. 1985. 87. P 186-190.
7. Davies A., Simmons D. L., Hale G., Harrison R.A., Tighe H., Lachmann P. J. and Waldmann H. CD 59, an Ly-6 like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells // J. Exp. Med. 1989. 170. P 637-654.
8. Hamilton K. K., Zhao J., Rollins S., Stewart B. H. and Sims P. J. Regulatory control of the terminal complement proteins at the surface of human endothelial cells—neutralization of a C5b-9 inhibitor by antibody to CD59 // Blood. 1990. 76. P. 2572-2577.
9. Lehto T. andMeri S. Interaction of soluble CD 59 with the terminal complement complexes: CD 59 and C9 compete for a nascent epitope on C8 // J. Immunol. 1993. 151. P 4941-4949.
10. Meri S., Morgan B. P., Davies A., Daniels R. H., Olavesen M. G., Waldmann H. and Lachmann P. J. Human protectin (CD 59), an 18,000-20,000 MW complement lysis restricting factor, inhibits C5b-8 catalysed insertion of C9 into lipid bilayers // Immunology. 1990b. 71. P 1-9.
11. Meri S., Vakeva A., Laari T. and Lachmann P. J. Soluble forms of CD 59-antigen: distribution in body fluids and functional activity // Compl. Inflamm. (abstr.). 1991a. 8. P 193.
12. Meri S., Waldmann H., and Lachmann P. J. Distribution of protectin (CD 59), a complement membrane attack inhibitor, in normal human tissues // Lab. Invest. 1991b. 65. P. 532-537.
13. Meri S., MattilaP andRenkonenR. Regulation of CD 59 expression on the human endothelial cell line EA.hy 926 // Eur. J. Immunol. 1993. 23. P. 2511-2516.
14. Meri S. Protectin (CD 59). Complement lysis inhibitor and prototype domain in a new protein superfamily // Immunologist. 1994. 2. P 149-155.
15. Blanche P. J., Gong E. L., Forte T. M. and Nichols A. V. Characterization of human high density lipoproteins by gradient gel electrophoresis // Biochim. Biophys. Acta. 1981. 665. P. 408-419.
16. EntmanM. L., Michael L., Rossen R. D., Dreyer W.J., Anderson D. C., TaylorA.A. and Smith C. W. Inflammation in the course of early myocardial ischemia // FASEB J. 1991. 5. P. 2529-2537.
17. Bjorkerud S., BjorkerudB. Apoptosis is abundant in human atherosclerotic lesions, especially in inflammatory cells (macrophages and T-cells), and may contribute to the accumulation of gruel and plague instability // Am. J. Pathol. 1996. № 149 (2). P. 367-380.
18. Ehnholm C., Bozas S. E., Tenkanen H., Kirszbaum L., Metso J., Murphy B. and Walker I. D. The apolipoprotein A-I binding protein of placenta and the SP-40 protein of human blood are different proteins which both bind to apolipoprotein // A-I. Biochim. Biophys. Acta. 1991. 1086. P. 255-260.
19. Riepponen P., Marniemi J. and Rautaoja T. Determination of apolipoproteins A-I and B in serum // Scand. J. Lab. Invest. 1987. 47. P. 739-745.
20. Iwakura A., FujitaM., Hasegawa K., Sawamura T., Nohara R., Sasayama S., KomedaM. Pericardial fluid from patients with unstable angina induces vascular endothelial cell apoptosis // J. Am. Coll. Cardiol. 2000. Jun. 35 (7). P. 1785-1790.
21. Farber J. L. Membrane injury and calcium homeostasis in the pathogenesis of coagulative necrosis // Lab. Invest. 1982. 47. P. 114-118.
22. Campbell A. K. and Morgan B. P. Monoclonal antibodies demonstrate protection of polymorphonuclear leucocytes against complement attack // Nature. 1985. 317. P 164-166.
23. EsserA. F. The membrane attack pathway of complement // Year Immunol.— 1989. 1990. 90. 6. P. 229-244.
24. Rooney I. A., Atkinson J. P., Krul E. S., Schonfeld G., Polakoski K., Saffitz J. E. and Morgan B. P. Physiologic relevance of the membrane attack complex inhibitory protein CD 59 in human
seminal plasma: CD 59 is present on extracellular organelles (prostasomes), binds cell membranes, and inhibits complement-mediated lysis // J. Exp. Med. 1993. 177. P. 1409-1420.
25. Niculescu F., Rus H. G. and Vlaicu R. Immunohistochemical localization of C5b-9, S-protein, C3d and apolipoprotein B in human arterial tissues in atherosclerosis // Atherosclerosis. 1987b. 65. P 1-11.
26. Ito B. R., Roth D. M. and Engler R. L. Thromboxane A2 and peptidoleukotrienes contribute to the myocardial ischemia and contractile dysfunction in response to intracoronary infusion of complement C5a in pigs // Circ. Res. 1990. 66. P 596-607.
27. Hattori R., Hamilton K. K., McEver R. P. and Sims P. J. Complement proteins C5b-9 induce secretion of high molecular weight multimers of endothelial von Willebrand factor and translocation of granule membrane protein GMP-140 to the cell surface // J. Biol. Chem. 1989. 264. P 9053-9060.
28. JauhiainenM., Metso J., Pahlman R., Blomqvist S., Tol A. van, and Ehnholm C. Human plasma phospholipid transfer protein causes high density lipoprotein conversion // J. Biol. Chem. 1993. 6. P 4032-4036.
29. Jenne D. E., Lowin B., PeitschM. C., Bottcher A., Schmitz G. and Tschopp J. Clusterin (complement lysis inhibitor) forms a high density lipoprotein complex with apolipoprotein A-I in human plasma // J. Biol. Chem. 1991. 266. P 11030-11036.
30. Choi-Miura N. H., Sakamoto T., Tobe T., Nakano Y. and TomitaM. The role of HDL consisting of SP-40,40, apo A-I, and lipids in the formation of SMAC of complement // J. Biochem. 1993. 113. P. 484-487.
