CC BY
45
Neurobiology. 1268:16. 2013.
4. Luijtelaar G., Sitnikova E. Global and focal aspects of absence epilepsy: The contribution of genetic models. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 30: 9831003. 2006.
5. Steinlein O.K. Genetic mechanisms that underlie epilepsy. Nature Reviews Neuroscience. 5(5): 400-408. 2004.
6. Журавин И.А., Дубровская Н.М., Туманова Н.Л. Постнатальное физиологическое развитие крыс после острой пренатальной гипоксии. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. 89 (5):522-532. 2003.
7. Отеллин В.А., Хожай Л.И., Ордян Н.Э. Пренатальные стресорные воздействия и развивающийся головной мозг. СПб. Десятка. 2007.
Ключевые слова: мозг, патология, животные модели, гипоксические повреждения. Keywords: brain, pathology, animal models, hypoxic injury.
УДК 619
Козлова Д.И.,. ВасильевД.С, Журавин И.А.
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ АМИЛОИД-ДЕГРАДИРУЮЩЕЙ ПРОТЕАЗЫ НЕПРИЛИЗИН В ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС, ПЕРЕНЕСШИХ ПРЕНАТАЛЬНУЮ ГИПОКСИЮ12
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург, darushka87@gmail. com
Введение. Амилоид-деградирующие ферменты (Ар-ДФ), присутствующие в ткани головного мозга, способны осуществлять протеалитическое расщепление Р-амилоидного пептида (АР) в различных его участках как in vitro, так и in vivo [1], с образованием коротких нетоксичных фрагментов, тем самым регулировать его содержание. Одним из основных Ар-ДФ является цинк-зависимая
12 Kozlova D.I., Vasiliev D.S., Zorawina I.A., The changes in the expression of different form of the neprilysin. Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry. IM Sechenov Academy of Sciences, St. Petersburg, darushkaH7@gmail.com
130
металлопептидаза - неприлизин (НЕП). В настоящее время активно исследуются молекулярные механизмы регуляции экспрессии НЕП. Недавно было показано, что в нервных клетках существует механизм регуляции экспрессии НЕП (по принципу обратной связи) [2]. В результате расщепления белка предшественника амилоидного пептида (АРР) альфа- и бета-секретазами наравне с Ар образуется короткий фрагмент - внутриклеточный домен APP - AICD (APP intracellular domain). AICD в комплексе с другими факторами, повышающими его стабильность, обладает транскрипционной активностью и способен селективно связываться с промотором гена НЕП, обеспечивая тем самым его активацию и повышая экспрессию НЕП. Тем не менее, в литературе редко встречаются данные об исследованиях изменения содержания НЕП и его гомолога (NEP-like protease в) на различных экспериментальных моделях. Исследование особенностей экспрессии различных форм НЕП при моделировании патологий когнитивных функций представляет практический интерес, поскольку регуляция активности и экспрессии основной формы НЕП и её гомолога может быть положена в основу медикаментозного метода коррекции когнитивных нарушений у человека при болезни Альцгеймера, вызванной, в том числе, образованием избыточного количества Ар. В настоящем исследовании используется модель пренатальной гипоксии у крыс, поскольку в ранее проведенных исследованиях было выявлено снижение активности НЕП в корковых структурах мозга у таких животных [3].
елью данной работы является исследование в постнатальном онтогенезе сравнительного содержания основной формы НЕП и её гомолога, а также их общей активности в ткани мозга крыс с нормальным развитием и крыс, перенесших гипоксию на 14 день эмбриогенеза.
Методы исследования. Для создания гипоксических условий самок крыс линии Вистар на 14 день беременности подвергали действию гипоксии (7% О2, 3 ч). Контрольных животных содержали в аналогичных условиях при нормальном содержании кислорода.
Исследование активности НЕП проводили на потомстве контрольных и перенесших гипоксию самок, по достижении крысятами возраста 4 месяцев (N контрольных = 5; N перенесших гипоксию = 7). При декапитации собирали кровь, отбирали плазму и использовали ее для дальнейшего исследования. Ткань теменной коры и гиппокампа одного из полушарий мозга гомогенизировали в 50
мМ HEPES-буфере(pH7.2) при температуре 4°С. Затем, полученный гомогенат центрифугировали 20 минут при 20000 g. Образующийся осадок ресуспендировали в HEPES-буфере (50мМ, рН7.2). Полученные мембранные фракции использовали для определения активности неприлизина. Количество белка в пробе определяли по методу М.М. Брэдфорд [4]. Активность неприлизина определяли с помощью флуоресцентного метода с использованием синтетического флуорогенного субстрата сукцинил-аланил-фенилаланил-амидо-3 метилкумарин (Sigma, США). Реакцию инициировали добавлением аликвоты проб, полученных мембранных фракций теменной коры, гиппокампа или плазмы крови. Активность неприлизина определяли по разности флуоресценции, полученной при инкубации проб в присутствии селективного ингибитора неприлизина - тиорфана (10 мкМ). Линейность образования флуорогенного продукта была достигнута путем добавления избыточных количеств лейцинаминопептидазы, необходимой для образования флуорогенного продукта (LAP). Реакцию проводили при комнатной температуре. Регистрация квантов флуорогенного продукта, образовавшегося в ходе ферментативной реакции, проводилась с помощью флуориметра "Ascent Fluoroscan" (Thermo Scientific, Финляндия) при возбуждении длиной волны 380 нм и эмиссии 460 нм (Fisk et al, 2007).
Иммуноблотинг. Крыс декапитировали, и получали гомогенат ткани. Белки денатурировали и загружали в лунки SDS-полиакриламидного геля (8%), проводили электрофорез, белки переносили на PVDF мембрану, блокировали в 5%-ном растворе сухого молока на 0,1% растворе Tween20 в течение часа при +4оС Использовали первичные антитела к НЕП (Anti- CD10 antibody [EPR5904], Abcam ab 126593; 1:10000) и к гомологу основной формы НЕП (Anti- Neprilysin-like Protease beta antibody, Abcam ab81688; 1:10000), выработанные в кролике. Инкубация с первичными антителами производилась в течение 20 часов при +4о C. Визуализацию осуществляли с помощью HRP-конъюгированных моноклональных вторичных антител против IgG кролика (Abcam, разведение 1:4000). Для визуализации бэндов использовали Optiblot ECL Ultra Detect Kit (1.2pg-2ng) (Abcam, ab 133409) согласно рекомендованному производителю протоколу. Для каждого образца вычисляли отношение оптической плотности полосы НЕП или
его гомолога к оптической плотности полосы актина. Для статистической обработки данных, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.
Результаты исследования. В ходе исследования активности неприлизина в теменной коре, гиппокампе и плазме крови взрослых крыс (4 месяца), перенесших гипоксию на 14 сутки эмбрионального развития, были получены данные, которые свидетельствовали о том, что пренатальная гипоксия отражается на активность и содержание этого фермента. Активность неприлизина в теменной коре и гиппокампе мозга крыс, перенесших пренатальную гипоксию, была снижена по сравнению с активностью данного фермента у контрольной группы животных в 1,2 раза, как в теменной коре, так и в гиппокампе. В плазме крови активность неприлизина у крыс, перенесших пренатальную гипоксию, была повышена в 2 раза по сравнению с активностью данного фермента у контрольной группы животных. Полученные результаты о разнонаправленных изменениях активности неприлизина в ткани мозга и плазме крови животных могут свидетельствовать о различиях в соотношении неприлизина и его гомолога (NEP-like protease в), обладающих разной активностью, в мозге и периферических органах и тканях. Результаты иммуноблотинга показали, что содержание основной формы неприлизина в ткани головного мозга значительно превосходит его содержание в плазме крови. Напротив, содержание гомолога основной формы неприлизина в крови животных выше, чем в ткани мозга. Сравнение животных с нормальным и нарушенным эмбриональным развитием показало, что содержание основной формы неприлизина у крыс, перенесших пренатальную гипоксию на Е14, было снижено относительно контроля, как в новой коре (64,2±6,1% от значения у контроля), так и в гиппокампе (82,0±5,7% от контроля). Содержание гомолога основной формы НЕП в кортикальных отделах головного мозга после пренатальной гипоксии не изменялось относительно контроля. Полученные результаты демонстрируют параллельное снижение содержания основной формы неприлизина в ткани кортикальных отделов мозга у крыс, перенесших гипоксию на Е14, и понижением общей активности основной формы НЕП и её гомолога.
Обсуждение. Данные, полученные в ходе настоящего исследования, свидетельствуют, что снижение общей активности НЕП в ткани кортикальных отделов головного мозга при пренатальной гипоксии происходит за счёт снижения содержания основной формы неприлизина. Эти результаты согласуются с
данными о регуляции экспрессии НЕП, полученными исследователями университета города Лидс (University of Leeds, UK) на клеточных культурах [2, 5, 7]. Однако изучение изменений активности и содержания форм НЕП у животных, перенесших пренатальную гипоксию, до настоящего времени не проводилось и данные о снижении содержания основной нейрональной формы НЕП впервые получены в ходе настоящего исследования. Остаётся нерешённым вопрос о том, насколько велик вклад изменения экспрессии основной формы НЕП в изменение общей ферментативной активности. Несоразмерность величин изменения общей активности и содержания основной формы неприлизина свидетельствует о действии дополнительных факторов, усиливающих снижение активности этой пептидазы после действия пренатальной гипоксии. Следует отметить, что согласно литературным данным, гомолог основной формы неприлизина (NEP-like protease) обнаружен только в ограниченных популяциях нейронов, в спинном мозге, гипофизе и сосудистом сплетении мозга [6]. Возможно по этой причине, в норме гомолог основной формы неприлизина не может вносить значительный вклад в общую активность НЕП, тем не менее, он продолжает представлять определённый интерес в плане поиска стратегий компенсации когнитивного дефицита (см. [8]).
Поддержано: Программой «Фундаментальные науки - медицине», РФФИ 12-0432281, 13-04-00388.
Литература:
1. Leissring M.A., Farris W., Chang A.Y., Walsh D.M., Wu X., Sun X., Frosch M.P., Selkoe D.J. Enhanced proteolysis of P-amyloid in APP transgenic mice prevents plaque formation, secondary pathology, and premature death. Neuron. 2003. Vol. 40. P. 1087-1093.
2. Belyaev, N. D.; Kellett, K. A.; Beckett, C.; Makova, N. Z.; Revett, T. J.; Nalivaeva, N. N.; Hooper, N. M.; Turner, A. J., J. The Transcriptionally Active Amyloid Precursor Protein (APP) Intracellular Domain Is Preferentially Produced from the 695 Isoform of APP in a P-Secretase-dependent Pathway. Biol Chem 2010. 285, 4144341454
3. Журавин И.А., Васильев Д.С., Дубровская Н.М., Багрова Д.И., Кочкина Е.Г., Плеснева С.А., Туманова Н.Л., Наливаева Н.Н. Когнитивные расстройства в
онтогенезе млекопитающих при нарушении пренатального развития. Журнал «Психиатрия». 2010. № 4, с.36-43
4. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
5. Pardossi-Piquard & Checler, The physiology of the в-amyloid precursor protein intracellular domain AICD. J Neurochem, 2012. 120,Suppl 1:109-124
6. Facchinetti P. Ontogeny, regional and cellular distribution of the novel metalloprotease neprilysin 2 in the rat: a comparison with neprilysin and endothelin-converting enzyme-1. Neuroscience 2003. 118: 627-639.
7. Fisk, L., Nalivaeva, N. N., Boyle, J. P., Peers, C. S., and Turner, A. J. Effects of hypoxia and oxidative stress on expression of neprilysin in human neuroblastoma cells and rat cortical neurones and astrocytes. Neurochem. Res. 2007. 32, 1741 -1748. doi: 10.1007/s 11064-007-9349-2.
8. Marr R.A., Hafez D.M. Amyloid-beta and Alzheimer's disease: the role of neprilysin-2 in amyloid-beta clearance. Front. Aging Neurosci. 2014. 6, 187.
Ключевые слова: пренатальная гипоксия, новая кора, неприлизин, крыса.
Keywords: prenatal hypoxia, neocortex, neprilysin, rat.
