CC BY
72
ПЕРСПЕКТИВЫ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
© В.Н. Коротун, В.В. Лесников, В.И. Витер, 2013 УДК 340.624
В.Н. Коротун1,2, В.В. Лесников1, В.И. Витер3 ИЗМЕНЕНИЕ СИНТЕЗИРОВАННОГО ЭТАНОЛА ПРИ ХРАНЕНИИ ТРУПНОЙ КРОВИ В УСЛОВИЯХ КОМНАТНОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ
ТКУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (начальник - доц. В.Н. Коротун);
2Кафедра судебной медицины (зав. кафедрой - доц. А.В. Светлаков) ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера»;
3Кафедра судебной медицины (зав. кафедрой - проф. В.И. Витер) ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия» Изучена динамика биосинтеза этанола в изолированных образцах трупной крови с консервантом при отсроченных исследованиях и хранении образцов в условиях комнатной температуры. На основании проведенных исследований установлена математическая зависимость динамики уровня синтезированного этанола в крови от длительности хранения ее образцов.
Ключевые слова: трупная кровь, биосинтез этанола, фториды.
CHANGE OF SYNTHESIZED CADAVERIC BLOOD'S ETHANOL STORAGE AT ROOM TEMPERATURE
V.N. Korotun, V.V. Lesnikov, V.I. Viter The dynamics of the biosynthesis of ethanol in isolated cadaveric blood samples with a preservative in deferred research and storage of samples at room temperature. Based on research evidence mathematical relationship dynamics synthesized ethanol levels in the blood on the duration of storage of its samples.
Key words: cadaveric blood, the biosynthesis of ethanol, fluorides.
Вопросы алкогольной интоксикации являются наиболее часто решаемыми при проведении экспертиз трупов. Действующим ведомственным нормативным документом для определения наличия и количественного содержания этанола регламентируется взятие по 10-20 мл крови и мочи в посуду, заполненную под пробку [5]. Последующий химический анализ образцов необходимо проводить в ближайшее время, однако выполнение такого временного требования весьма проблематично при доставке объектов из отдаленных районных филиалов. При исследовании крови через несколько дней после взятия образца возможно получение недостоверных результатов в силу посмертной биотрансформации имеющегося в образце этанола, либо его биосинтеза в случае первоначального его отсутствия.
Изучение причин и условий посмертного синтеза этанола в крови имеет давнюю историю. В настоящее время известно, что биосинтез этанола связан, прежде всего, с деятельностью микроорганизмов, в основном - дрожжевых грибков и молочнокислых бактерий, при этих процессах большое значение имеет уровень содержания в объекте углеводов, являющихся основным субстратом микробного синтеза этанола. [6, 7, 12, 14]. Кроме того, процесс биосинтеза этанола напрямую зависит и от условий отбора и хранения исследуемых образцов крови. Значительная роль при этом отводится температурным условиям, что при прочих равных условиях является
одним из наиболее важных факторов, влияющих на пос-тмортальные биохимические процессы. Проведенными раннее исследованиями было установлено, что в образцах крови, изначально не содержащих этанол, при хранении в чистой нестерильной стеклянной таре даже в условиях общей камеры холодильника происходит биосинтез этанола [9, 10].
Для предотвращения биотрансформации алкоголя и посмертного его синтеза в образцах крови рекомендуется в качестве консерванта добавление фторида натрия (№Б) - ферментного яда, прекращающего метаболизацию глюкозы в крови после ее отбора. В частности, в соответствии с национальным стандартом России (ГОСТ Р 53079.42008), для обеспечения стабильности этанола в пробах крови после их взятия при различных условиях хранения предусмотрено добавление в качестве стабилизатора 10 г/л фторида натрия [4]. Однако имеются данные, что даже добавление в биологические образцы фторидов не всегда препятствует посмертному синтезу этанола [8, 11].
Изложенное свидетельствует, что вопросы биосинтеза этанола в изолированном трупном материале при хранении его в различных температурных условиях изучены явно недостаточно. Именно данный факт, по нашему мнению, является основанием для проведения исследований биосинтеза этанола в изолированных трупных образцах крови с последующей разработкой рекомендаций для ретроспективной оценки наличия и
уровня этанола в премортальный период, что позволит повысить объективность и точность экспертных выводов о факте употребления умершим человеком алкогольных напитков при жизни.
Несмотря на значительное число научных работ, остается открытым вопрос оценки уровня содержания алкоголя в крови трупа даже на начальных этапах посмертных изменений, в связи с чем на сегодняшний день проблема диагностики алкогольной интоксикации требует дальнейшего изучения.
Цель и практическая значимость:
Вышеизложенное определило содержание работы и позволило сформулировать цель исследования - изучение динамики биосинтеза этанола в изолированных образцах трупной крови с консервантом при отсроченных исследованиях и хранении образцов в условиях комнатной температуры.
Материалы и методы:
Отбор образцов.
Исследование проводилось на базе Пермского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы. Объектами исследования были образцы крови от 88 трупов лиц обоего пола в возрасте от 30 до 80 лет, умерших естественной или насильственной смертью, в крови которых изначально отсутствовал алкоголь. Из выборки были исключены случаи смерти от инфекционных заболеваний и смерти в медицинских организациях. Забор образцов крови проводился в ходе секционного исследования из синусов твердой мозговой оболочки от трупов без признаков гнилостных изменений.
Все образцы были разделены на две экспериментальные группы, каждая из которых - на четыре подгруппы для повторного исследования образцов. Первую группу составили образцы крови объемом 10 мл, которые помещались в чистые стеклянные флаконы и герметично укупоривались резиновой пробкой. Вторую группу - образцы крови, отбор которых проводился с соблюдением правил асептики в стерильные вакуумные пробирки Improvacuter® (фирма «Guangzhou Improve Médical Instruments Co., Ltd»).
Стеклянные флаконы в качестве консерванта содержали 1% раствор фторида натрия (NaF), являющегося стабилизатором глюкозы крови. Вакуумные стерильные пробирки с крышкой серого цвета так же содержали фторид натрия.
Длительное хранение образцов крови, изначально не содержащих этиловый алкоголь, осуществлялось в условиях комнатной температуры (+20°С), что моделировало условия хранения образцов при их отсроченном исследовании. Определение видов микроорганизмов в образцах крови не входило в рамки данного исследования.
Подготовка образцов и анализ.
Первичное исследование образцов крови проводилось сразу после аутопсии трупа (без предварительного хранения), а также повторно с недельными интервалами - через 1, 2, 3 и 4 недели.
Анализ образцов проводился методом газожидкостной хроматографии на хроматографе «Кристалл 2000» с пламенно-ионизационным детектором. Количественное определение этанола в пробах проводили с использованием программы «Аналитик» версии 1.21.
Динамика концентрации синтезированного этанола в группах описывалась математически.
Статистика.
Формирование базы данных, процесс их статистической обработки и оформление полученных результатов осуществлялось с помощью программы обработки электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета статистического
анализа «Statistica». Были сформированы таблицы соответственно исследовательским группам. При статистической обработке исследованного материала принят уровень значимости р < 0,05.
Результаты и их обсуждение.
На первом этапе проводили исследования хранившихся во флаконах образцов крови. Полученные результаты показали, что уже в течение первой недели происходит биосинтез этанола с последующим еженедельным изменением его концентрации (табл. 1).
Таблица 1
Показатели динамики синтеза этанола в образцах крови при хранении во флаконах с фторидом натрия
Срок хранения М Ме m n
1 неделя 0,083 0,080 0,014 44
2 неделя 0,114 0,100 0,016 44
3 неделя 0,121 0,110 0,016 44
4 неделя 0,099 0,073 0,017 42
Примечание: М - среднее значение этанола в подгруппе (%о); Ме - медиана; т - стандартная ошибка среднего; п - численность выборки.
Несмотря на относительно небольшую величину средних концентраций этанола в образцах, в ходе проведения судебно-медицинских экспертиз трупов установленное обстоятельство может быть ошибочно трактовано экспертом как факт прижизненного употребления алкоголя. В ряде случаев это может иметь решающее значение для следствия и привести к ошибочному судебному решению.
Данными ряда исследований установлено, что в образцах крови (без консерванта), изначально не содержащих алкоголь, максимальный синтез этанола происходит именно в первые дни недели за счет активной жизнедеятельностью микроорганизмов и ферментацией ими углеводов (прежде всего - глюкозы) крови. Соответственно, в дальнейшем по мере утилизации глюкозы и максимального ее использования, в образцах пропорционально уменьшается и концентрация синтезированного этанола [13].
В наших наблюдениях в первую неделю происходит незначительное образование этанола в образцах крови с фторидом натрия и последующее постепенное его нарастание до конца 4 недели хранения. Установленная динамика уровня этанола в образцах крови подчиняется математической зависимости, наиболее точно описывающим выявленные изменения является полиномиальный тренд с уравнением:
C = -0,017xD 2 + 0,124xD - 0,104
X X x
где Cx - концентрация этанола в образце, %;
Dx - длительность хранения образца, недель.
Установленная математическая зависимость может явиться основой определения исходного состояния объекта путем обратной экстраполяции результатов судебно-химического исследования.
Проведенный первый этап исследования позволяет сделать важный для практики судебно-медицинских экспертиз вывод, что ингибирование глюкозы фторидом эффективно только в первые дни недели и в последующем, по мере освобождения связанной глюкозы, при участии имеющихся в образце микроорганизмов происходит постепенный незначительный синтез этанола.
Кроме того, биосинтез этанола в образцах крови обусловлен рядом факторов, наиболее важнейшим из которых решено считать бактериальный - неизбежная
микробная контаминация из воздуха секционной при отборе образцов. Доказано, что бактериальное обсеменение воздуха секционной обусловлено судебно-медицинским биологическим материалом - микроорганизмами из трупа. В частности, по окончании работы общее микробное число в секционной находится в пределах 1500-2000 микроорганизмов в 1 м3, при этом количество дрожжей и плесневых грибов находится в пределах 3 - 180/м3 [3].
С целью минимизации влияния бактериального фактора во время отбора образцов и подтверждения справедливости выдвинутого суждения было признано необходимым проведение второго этапа исследования, который исключал этап контакта образца с бактериально загрязненным воздухом секционной. Для проверки отмеченной гипотезы проводился отбор образцов крови с соблюдением правил асептики непосредственно из кровеносного русла трупа в стерильные вакуумные пробирки 1тргоуаси1ег®. В последующем исследовался уровень алкоголя в образцах крови при их 4-х недельном хранении.
Проведенными исследованиями было установлено, что при хранении образцов крови в стерильных пробирках через 1 неделю в них обнаруживается незначительное количество этанола в средней концентрации 0,039%о с последующим нарастанием концентрации (табл. 2).
Таблица 2
Показатели динамики синтеза этанола в образцах крови при хранении в стерильных пробирках с фторидом натрия
0 нед
1 нед
2 нед
3 нед
4 нед
Срок хранения М Ме m n
1 неделя 0,039 0,000 0,009 44
2 неделя 0,075 0,055 0,014 44
3 неделя 0,097 0,100 0,013 44
4 неделя 0,096 0,090 0,016 32
Рис. 1. Динамика уровня синтезированного этанола в образцах крови
C = -0,007xD 2 + 0,065xD - 0,061
xxx
где Cx - концентрация этанола в образце, %;
Dx - длительность хранения образца, недель.
Границы доверительного интервала было решено не определять в силу несущественности «разброса» концентраций этанола в изучаемых объектах и высокой степени достоверности вычисленной динамики этанола.
Выводы:
Проведенные исследования позволили прийти к важным для экспертной практики выводам:
1. Для минимизации процессов посмертного синтеза этанола в образцах трупной крови рекомендуется в качестве консерванта добавление фторида натрия (NaF) - ингибитора глюкозы, препятствующего ее метаболи-зации в трупной крови в первые дни после ее отбора. В последующем, по мере освобождения связанной глюкозы, при участии имеющихся в образце микроорганизмов происходит незначительный синтез этанола.
2. При хранении в условиях комнатной температуры в чистых флаконах образцов крови (с консервантом), изначально не содержащих алкоголь, происходит обусловленный жизнедеятельностью микроорганизмов синтез этанола до значений, которые в ходе проведения судебно-медицинских экспертиз могут быть основой ошибочного экспертного вывода о премортальном происхождении алкоголя.
3. При хранении образцов трупной крови в стерильных пробирках с фторидом натрия минимизируется процесс биосинтеза в них этанола. Использование таких пробирок следует считать перспективным в плане «консервации» объекта для сохранения его первоначального статуса, что позволит исключить ошибки определения состояния алкогольного опьянения у субъекта на момент его смерти.
4. Установлена математическая зависимость динамики уровня этанола в крови с консервантом от условий ее хранения, которая может явиться основой определения исходного состояния объекта путем обратной экстраполяции результатов судебно-химического исследования.
Литература:
1. Джуваляков П.Г., Кадочников Д.С. К вопросу о судебно-медицинской оценке прижизненного и посмертного микробного инфицирования тела человека. // Астраханский медицинский журнал, 2011. - т. 6.—№3. — С. 22-24.
2. Джуваляков П.Г., Кадочников Д.С. Микрофлора трупной крови. // Астраханский медицинский журнал, 2010. - Т. 5. - № 3. - С. 129-131.
Кадочников Д.С. Научные основы обеспечения инфекционной безопасности судебно-медицинских секционных исследований. Ав-тореф. дисс... докт. мед. наук. - М., 2010. - 45 с.
Национальный стандарт РФ - ГОСТ Р 53079.4-2008, «Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клиничес-кихлабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа» (введен в действие 01.01.2010 г.). Приказ Минздравсоцразвития России от 12.05.2010 г. № 346н «Обутверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертныхучреждениях РФ».
Blackmore D.J. The bacterialproduction of ethyl alcohol. // J.Forensic Science Soc. 1968. - Vol. 8.-№ 2-3. - P. 73-78. Gittiland M.G.F., Bost R.O. Alcohol in decomposed bodies: postmortem synthesis and distribution. // J. Forensic Sei. 1993. - Vol. 38. -№ 6. -P. 1266-1274.
Hoiseth G., Kristoffersen A., Larssen B. et al. In vitro formation of ethanol in autopsy samples containing fluoride ions. // Int. J. Legal Med. 2008. -№ 1. -P. 63-66.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что достичь абсолютной стерильности при заборе образцов из трупа не удается из-за происходящих в нем аутолити-ческих процессов и наличием в силу этого в крови некоторого количества микроорганизмов, что подтверждается так же исследованиями ряда авторов [1, 2].
Была изучена динамика изменения уровня этанола в образцах крови, хранившихся во флаконах и пробирках, и построены графики с подстановкой линий тренда (рис. 1).
Наиболее точно описывающим изменения явился, как и в экспериментах с образцами крови во флаконах, полиномиальный тренд с высокой достоверностью аппроксимации.
Как следует из графика на рисунке, содержание этанола в образце крови при его хранении в стерильных вакуумных пробирках очень точно математически описывается уравнением:
9. Korotun V.N., Lesnikov V.V. Effect of storage conditions and terms of blood samples for the synthesis of ethanol in them. // "European Applied Sciences: modern approaches in scientific researches": papers of the 1st International Scientific Conference. ORT Publishing, Stuttgart, Germany. 2012. -P. 97-100.
10. Korotun V.N., Lesnikov V.V. Postmortem changes in the concentration of ethanol in the blood under different conditions and shelf life. // "Science, Technology and Higher Education": materials of the international research and practice conference. - Westwood, Canada. 2012.
- Vol. l.-P. 555-559.
11. Lewis R. J., Johnson R. D., Angier M.K., Vu N.T. Ethanol formation in unadulterated postmortem tissues. // For. Sci. Int. 2004. - Vol. 146. -Nel.-P. 17-24.
12. Moriya F., Hashimoto Y. Endogenous ethanol production in trauma victims associated with medical treatment. // Nippon Hoigaku Zasshi.
- 1996. -№ 50. - P. 263-267.
13. Petkovic S.M., Simic M.A., Vujic D.N. Postmortem production of ethanol in different tissues under controlled experimental conditions. // J. ForensicSci. 2004, - Vol. 146. -N. 1. -P. 17-24.
14. Yajimaa D., Motania H., Kameib K. et al. Ethanolproduction by Candida ablicans inpostmortem human blood samples: Effects of blood glucose level and dilution. // For. Sci. Int. - 2006. - Vol. 164. —№ 2-3. -P. 116-121.
© Т.В. Найденова, А.Ю. Вавилов, 2013 УДК 340.624
Т.В. Найденова1, А.Ю. Вавилов2 ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПРИЖИЗНЕННОСТИ И ДАВНОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ПЯТЕН КРОВИ НА ТЕКСТИЛЬНЫХ ПРЕДМЕТАХ-НОСИТЕЛЯХ
1БУЗ УР «Бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ УР» (начальник - к.м.н. В.И. Жихорев); 2Кафедра судебной медицины (зав. кафедрой - проф. В.И. Витер) ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия» Представлены результаты авторских исследований оптической плотности вытяжек из пятен сухой крови различной давности, расположенных на текстильных предметах-носителях. Полученные результаты объективизируют диагностику давности пятна крови и факта формирования его кровью живого человека или трупа.
Ключевые слова: пятно крови, давность образования, оптическая плотность, текстильный предмет-носитель, живой человек, труп.
PHOTOCOLORIMETRIC'S DIAGNOSTICS AT VITALITY AND PRESCRIPTION OF FORMATION OF STAINS OF BLOOD ON TEXTILE SUBJECTS-CARRIERS T.V. Naidyonova, A.Ju.Vavilov The paper presents the results of original research of the optical density of extracts from dried blood spots of different periods, located in the textile carrier subject. The results objectifies diagnosis of old blood stains and the fact of formation of the blood of a living person or a corpse.
Key words: blood spot, prescription of formation, optical density, textile subject carrier, live person, dead corpse.
Среди всех биологических объектов, изымаемых работниками правоохранительных органов с мест происшествий в качестве вещественных доказательств и присылаемых для изучения в Бюро судебно-медицинской экспертизы, кровь занимает ведущее место, как по количеству исследований, так и по значимости получаемых результатов для следствия и суда [3].
Кроме вопросов о видовой и групповой принадлежности, работника следствия часто интересует, как давно сформировалось изъятое им сухое пятно, а так же сформировано оно кровью живого человека, или трупа?
Для решения последних вопросов отечественными и зарубежными учеными было предложено множество методов, нашедших ограниченное применение в силу их трудоемкости, дороговизны или малой информативности. Однако, по нашему мнению, потенциал средств, уже имеющихся на вооружении медицинских учреждений, не до конца исчерпан. Так, высокой чувствительностью, возможностью объективной регистрации и оценки результатов, при определенной простоте и удобстве использования, обладают биофизические методы [1, 2], одним из которых является фотоколориметрия, уже давно использующаяся в судебной медицине [4, 7]. Именно ее и было решено применить для повышения качества диагностики давности образования пятен крови на текстильных предметах-носителях, с разработкой критериев определения факта формирования пятна кровью живого лица, либо трупа, по величине оптической плотности вытяжки из сухого пятна крови.
Пятна крови на текстильных материалах (хлопчатобумажная, шерстяная, джинсовая ткани и трикотаж) были сформированы кровью от трупов с давностью смерти, не превышающей одних суток, а так же от живых лиц, и в последующем, после высушивания, хранились в различных температурных условиях внешней среды (комнатная температура, тепло, холод). Из высушенных образцов крови и контрольных предметов носителей с помощью дистиллированной воды готовились вытяжки по способу, представленному нами ранее [5]. Оптическая плотность измерялась с помощью фотоколориметра КФК-3 и двух стандартных кварцевых кювет 1,040 в диапазоне длин волн от 330 до 500 нм с интервалом 10 нм. В течение первого месяца показатели оптической плотности фиксировались через каждую неделю, в последующем через каждые четыре недели.
Построение спектров оптической плотности вытяжек из сухих пятен крови различной давности и температурных условий их хранения и проведение множественных парных сравнений средних величин групп, сформированных по признаку длины волны, позволило прийти к заключению, что выбранный диапазон длин волн (330-500 нм) позволяет получить вполне достоверную информацию об изучаемом объекте (Рис. 1).
Для всех трех групп температурных условий хранения материала, представленных на рисунке, характерен пик на длине волны 390 нм, который с течением времени начинает постепенно снижаться. В этом плане выделяется группа «тепло», где значение оптической плотности на
