CC BY
172
426
Вопросы клинической и экспериментальной медицины
А. А. Марченков, Е. В. Коледаева, Е. М. Репнякова, В. А. Козвонин
Изменение показателей периферической крови крыс с хроническим гепатитом при трансплантации мезенхимальных
стволовых клеток
ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия»
Минздрава России
Введение: В последнее время ведутся активные работы по и зучению способов восстановления печени - клеточной терапии с использованием различных типов стволовых клеток (СК): мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Показано, что трансплантируемые клетки трансдифференцируются в гепато-циты реципиента, замещая при этом пораженные участки органа, и способствуют формированию пула свежих прогениторных клеток. На сегодняшний день изучены далеко не все аспекты трансплантации клеток, малое внимание уделяется показателям системного ответа на трансплантацию (показатели периферической крови).
Цель работы: оценить показатели периферической крови на фоне регионарного введения клеточного препарата ММСК крысам с экспериментальным хроническим гепатитом.
Материалы и методы работы: Эксперимент проведен на 50 крысах линии Вистар, хронический токсический гепатит (ХГ) вызывали введением 66% масляного раствора четыреххлористого углерода в дозе 0,1 мл на 100 г массы животного, 18 инъекций на курс. ММСК получали из жировой ткани животных -доноров по методу Zuc с коллагеназой. Для этого биоптат жировой ткани измельчали, отмывали от крови в буфере DPBS, подвергали ферментативной обработке в 0,075% растворе коллаге-назы. Клетки культивировали в среде а-МЕМ, дополненной 10% фетальной сывороткой и антибиотиками. В работу брались клетки не старше 5-6 пассажа (рисунок).
Изменение показателей периферической крови крыс с хроническим ...
427
Животных выводили из эксперимента на 3, 7 и 15 сутки. Группы распределились следующим образом: контроль (интактные животные), группы с введением клеток (ММСК), группы токсического гепатита (ХГ 3, 7, 15 сут.), а также группы с лечением (ХГ 3-15 сутки + ММСК). Введение клеток проводили интрао-перационно в воротную вену в физиологическом растворе с гепарином (1 ЕД/мл) в количестве 1х106 жизнеспособных клеток на животное. Для оценки лейкоформулы получали периферическую капиллярную кровь из кончика хвоста крыс. Мазок крови готовили по стандартной методике, высушивали и окрашивали по Май-Грюнвальд - Гимзе. В мазке подсчитывали лейкоцитарную формулу, а также оценивали показатели анизоцитоза и гипохромии эритроцитов в баллах. Статистическую обработку данных проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.
Рисунок - Микроскопия трансплантируемых клеток: Монослой ММСК, 3 сутки культивирования, 5 пассаж, фазово-контрастная микроскопия, ув. х 200.
Результаты и обсуждение. Лейкоцитарная формула интактных животных не отличалась от значений нормы в литературе. Лейкоформула животных, получавших только ММСК, статистически не отличались от таковой для группы контроля (таблица).
Лейкоформула животных, получавших четыреххлористый углерод, сильно отклонялась от нормальных значений. Для животных с гепатитом было характерно развитие моноцитоза с пиком на 7 сутки. Известно, что тканевые макрофаги являются регуляторами функций в патологически измененной печени, управляют процессами резорбции соединительной ткани. Поэтому моноцитоз в периферической крови крыс с гепатитом можно объяснить как реакцию организма на повреждение, по-
428
Вопросы клинической и экспериментальной медицины
скольку именно моноциты являются предшественниками тканевых макрофагов. Токсическое поражение печени отражалось также и на содержании нейтрофильных гранулоцитов: в целом для гепатитных животных была характерна нейтропения со сдвигом влево. Данный факт можно расценить как проявление гематотоксического влияния четыреххлористого углерода. В данном случае угнетение миелопоэза приводило к дефициту зрелых элементов (сегментоядерных нейтрофилов) с появлением в периферической крови менее зрелых форм (палочкоядерные гранулоциты). Сдвиг влево также был обусловлен реакцией костного мозга на воспалительный процесс в печени. Показатели красной крови гепатитных животных также были значительно ниже нормы. Так, интегральный балл «анизоцитоз+гипохромия» был наиболее высок в группе животных на 7 сутки эксперимента, что говорит о выраженной анемии у животных в группах хронического гепатита, нараставшей весь период эксперимента.
Таблица - Влияние ММСК на показатели ^ лейкоформулы крыс
Группа Нейтрофильные гранулоциты Эозино- филы Базо- филы Моно- циты Лимфо- циты
Палочко- ядерные Сегменто- ядерные
Без введения клеток
Без гепатита 0,14 ±0,14 17,57 ±3,77 1,14 ±0,46 - 7,14 ±0,51 74,14 ±3,28
ХГ3 3,40 ±1,12 8,20 ±1,20 0,40 ±0,40 0,60 ±0,40 13,20 ±1,66 74,00 ±3,03
ХГ7 2,67 ±0,67 6,67 ±3,28 0,67 ±0,33 - 16,33 ±0,88 73,00 ±3,61
ХГ15 1,75 ±1,11 11,25 ±3,20 1,00 ±0,41 - 8,50 ±1,76 78,00 ±5,12
Введение ММСК
Без гепатита 0,20 ±0,20 11,40 ±1,44 0,80 ±0,37 - 6,40 ±1,17 81,00 ±1,84
ХГ3 0,50 ±0,45 13,50 ±2,50 0,25 ±0,25 - 8,25 ±0,85 77,75 ±1,11
ХГ7 - 7,50 ±0,87 0,75 ±0,25 - 7,25 ±1,31 84,50 ±1,71
ХГ15 0,20 ±0,20 19,60 ±4,08 0,80 ±0,37 - 9,20 ±1,46 70,40 ±5,16
Изменение показателей периферической крови крыс с хроническим ...
429
Таким образом, индукция токсического гепатита в организме крыс Вистар приводит к системному ответу, который характеризуется не только изменением лейкоформулы, но и прогрессирующей анемией.
При введении ММСК нормализуется содержание нейтрофилов, как палочкоядерных, так и сегментоядерных, при этом доля палочкоядерных нейтрофилов снижается, а доля зрелых форм увеличивается, ликвидируется «сдвиг влево».
Нормализуется также содержание моноцитов, что свидетельствует о снижении системной реакции и воспалительного ответа.
Введение животным ММСК приводило к нормализации как белого, так и красного ростков крови. У крыс, получавших ММСК, отмечалось снижение суммы баллов показателей анизоцитоза и гипохромии, что говорит о восстановлении эритропоэза и снижении тяжести анемии.
Выводы: Таким образом, введение ММСК здоровым животным не отражается на лейкоформуле периферической крови крыс. Введение ММСК крысам с гепатитом приводит к нормализации лейкоформулы, ликвидации сдвига влево, моноцитоза, а также снижению тяжести анемии и восстановлению эритропоэза.
