CC BY
53
—--------- —
EFFECTS OF TRANSPLANTATION OF MMSC AND HSC IN PERIPHERAL BLOOD AND HAEMOSTASIS OF RATS WITH EXPERIMENTALLY CHRONIC HEPATITIS
Kosikh1 A.A., Marchenkov1 A.A., Seleznyov1 M.R., Osipov1 A. V.,
Vazhenina1 V.S., Kozvonin1 V.A., Polushin2 A.V.
1Kirov State Medical Academy, the Department of Biology 2Military hospital of Ministry of Home Affairs of Russia
The influence of multipotent stromal stem cells (MSSC) and hematopoietic stem cells (HSC), transplanted to portal vein of Vistar line rats on the peripheral blood indices (differential blood cell count, anisocytosis and hypochromia of erythrocytes) normally and during chronic hepatitis. The obtained results speak for normalization of differential blood cell count, reduction of anemia severity and rise of fibrinogen content in blood plasma.
Key words: MMSCs, HSCs, transplantation, hepatitis, leukogram.
ВЛИЯНИЕ ММСК И ГСК НА ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И ГЕМОСТАЗА У КРЫС С ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ
Косых1 А.А., Марченков1 А.А., Селезнев1 М.К., Осипов1 А.В.,
Важенина1 М. С., Козвонин1 В.А., Полушин2 А.В.
1ГБОУ ВПО Кировская ГМА МЗ РФ 2Госпиталь ВВ МВД
Исследовано влияние мультипотентных стромальных стволовых клеток (ММСК) и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), трансплантированных в воротную вену крыс линии Вистар, на показатели периферической крови (лейкоформула, анизоцитоз и гипохромия эритроцитов) в норме и при хроническом гепатите. Полученные результаты свидетельствуют о нормализации лейкоформулы, снижению тяжести анемии и повышению содержания фибриногена в плазме крови.
Ключевые слова: ММСК, ККМ, трансплантация, гепатит, лейкоформула.
Введение. Известно, что различные варианты терапии заболеваний печени стволовыми клетками (СК) приводят к восстановлению функций органа [1—3, 7]. Показано, что в качестве клеточных препаратов могут быть использованы мультипо-тентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), что приводит к репопуляции печени рецепиента и сопровождается трансдифференцировкой трансплантируемых клеток в гепатоциты [8—13]. Тем не менее, вопросы трансплантации стволовых клеток далеки от разрешения. Так, трансплантация клеток в эксперименте (крысы) чаще всего проводится в хвостовую вену, что может серьезно повлиять на результаты лечения, поскольку не учитывается регионарность доставки клеточного препарата, и большинство клеток, трансплантируемых таким образом, может быть поглощено макрофа-
гами легких. В литературе имеется большое количество публикаций, посвященных детальному разбору маркеров вводимых клеток, молекулярных механизмов репарации поврежденного органа, но практически не освещается вопрос системного влияния трансплантируемых клеток.
Таким образом, актуальным направлением в клеточной биологии является исследование системных эффектов клеток, трансплантируемых в условиях, максимально приближенных к клиническому применению.
Цель работы — оценить влияние трансплантации различных вариантов стволовых клеток на показатели периферической крови и гемостаза при экспериментальном токсическом гепатите.
Материалы и методы. Эксперимент проведен на 50 крысах линии Вистар. Экспериментальный хронический токсический гепатит (ХГ) вызы-
—---------- —
~ 24 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Fundamental studies -------------------
вали введением 66% масляного раствора четыреххлористого углерода в дозе 0,1 мл на 100 г массы животного (18 инъекций на курс). Мультипотент-ные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) получали из жировой ткани животных-доноров
по методу 2ие [14]. В работу брались клетки не старше 5—6 пассажа (рис. 1А). В качестве источника гемопоэтических СК (ГСК) использовали миелокариоциты костного мозга (рис. 1Б).
Рис. 1. Микроскопия трансплантируемых клеток:
А — монослой ММСК, 3 сутки культивирования, 5 пассаж, фазово-контрастная микроскопия, ув.х200. Б — осадок костного мозга после лизиса эритроцитов, окраска по Май-Грюнвальд — Гимзе,
ув.х900, масляная иммерсия
Животных выводили из эксперимента на 3, 7 и 15 сутки. Группы распределились следующим образом: контроль (интактные животные), группы с введением клеток (ММСК, ГСК, ММСК + ГСК), группы токсического гепатита (ХГ 3, 7, 15 сут.), а также группы с лечением (ХГ 3—15 сутки + ММСК, ХГ 3—15 сутки + ГСК, ХГ 3—15 сутки + ММСК +ГСК). Введение клеток проводили инт-раоперационно в воротную вену в физиологическом растворе с гепарином (1 ЕД/мл) в количестве 1-106 жизнеспособных клеток на животное, ММСК и ГСК вводили по 1-106 каждого вида клеток в виде смеси.
Для оценки лейкоформулы получали периферическую капиллярную кровь из кончика хвоста крыс. Мазок крови готовили по стандартной методике, высушивали и окрашивали по Май-Грюн-вальд — Гимзе. В мазке подсчитывали лейкоцитарную формулу, а также оценивали показатели ани-зоцитоза и гипохромии эритроцитов в баллах [4, 5]. Статистическую обработку данных проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение. Лейкоцитарная формула интактных животных не отличалась от
литературных данных [5, 6]. Лейкоформула животных, получавших ММСК, ГСК и ММСК + ГСК статистически не отличались от таковой для группы контроля (табл. 1).
Для животных с гепатитом было характерно развитие моноцитоза с пиком на 7 сутки. Известно, что тканевые макрофаги являются регуляторами функций в патологически измененной печени, управляют процессами резорбции соединительной ткани. Поэтому моноцитоз в периферической крови крыс с гепатитом можно объяснить, как реакцию организма на повреждение, поскольку именно моноциты являются предшественниками тканевых макрофагов. Токсическое поражение печени отражалось также и на содержании нейтрофильных гранулоцитов: в целом для гепатитных животных была характерна нейтропения со сдвигом влево. Данный факт можно расценить как проявление гематотоксического влияния четыреххлористого углерода. Угнетение миелопоэза приводило к дефициту зрелых элементов (сегментоядерных нейтро-филов) с появлением в периферической крови менее зрелых форм (палочкоядерных гранулоцитов). Сдвиг влево также был обусловлен реакцией костного мозга на воспалительный процесс в печени.
—----------- —
~ 25 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
—--------- —
Таблица 1
Показатели лейкоформулы периферической крови животных
Группа Нейтрофильные гранулоциты Эозино- Базо- Моно- Лимфо-
Палочко- ядерные Сегменто- ядерные филы филы циты циты
Без введения клеток
Контроль 0,14 ± 0,14 17,57 ± 3,77 1,14 ± 0,46 — 7,14 ± 0,51 74,14 ± 3,28
ХГ3 3,40 ± 1,12 8,20 ± 1,20 0,40 ± 0,40 0,60—0,40 13,20 ± 1,66 74,00 ± 3,03
ХГ7 2,67 ± 0,67 6,67 ± 3,28 0,67 ± 0,33 — 16,33 ± 0,88 73,00 ± 3,61
ХГ15 1,75 ± 1,11 11,25 ± 3,20 1,00 ± 0,41 — 8,50 ± 1,76 78,00 ± 5,12
Введение ММСК
Без гепатита 0,20 ± 0,20 11,40 ± 1,44 0,80 ± 0,37 — 6,40 ± 1,17 81,00 ± 1,84
ХГ3 0,50 ± 0,45 13,50 ± 2,50 0,25 ± 0,25 — 8,25 ± 0,85 77,75 ± 1,11
ХГ7 — 7,50 ± 0,87 0,75 ± 0,25 — 7,25 ± 1,31 84,50 ± 1,71
ХГ15 0,20 ± 0,20 19,60 ± 4,08 0,80 ± 0,37 — 9,20 ± 1,46 70,40 ± 5,16
Введение ГСК
Без гепатита 0,20 ± 0,22 13,20 ± 4,89 1,20 ± 1,08 — 6,20 ± 0,96 79,20 ± 5,38
ХГ3 — 7,80 ± 2,07 0,40 ± 0,27 — 8,20 ± 0,74 83,80 ± 2,25
ХГ7 — 12,33 ± 2,27 — — 8,00 ± 1,22 79,67 ± 3,49
ХГ15 — 12,60 ± 2,51 0,80 ± 0,55 — 11,60 ± 1,15 75,60 ± 3,51
Введение ММСК и ГСК
Без гепатита 6,00±2,03 0,80±0,65 — 5,60 ± 0,91 87,80 ± 2,41
ХГ3 0,33±0,41 22,17±2,88 0,83±0,74 0,17±0,20 11,33 ± 0,41 65,33 ± 2,27
ХГ7 — 11,67±1,47 1,00±0,71 — 12,00 ± 1,22 75,67 ± 2,86
ХГ15 — 16,60±4,64 0,60±0,27 — 6,20 ± 0,55 77,00 ± 4,26
Рис. 2. Влияние трансплантации клеточного материала на сумму баллов анизоцитоза и гипохромии в мазке периферической крови
~ 26 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Fundamental studies -------------------
Введение ММСК привело к повышению содержания сегментоядерных нейтрофилов с одновременным снижением палочкоядерных форм, одновременно с этим снизилась доля моноцитов. На фоне введения ГСК также происходит ликвидация «сдвига влево» и моноцитоза. Данные изменения можно охарактеризовать как противовоспалительный эффект вводимых клеток. Введение комбинации ММСК и ГСК оказалось менее эффективным.
Показатели красной крови гепатитных животных также были значительно ниже нормы. Так, интегральный балл «анизоцитоз + гипохромия» был наиболее высок в группе животных на 7 и 15 сутки эксперимента, что говорит о выраженной
анемии у животных в группах хронического гепатита, нараставшей весь период эксперимента (рис. 2).
Трансплантация клеточного материала приводит к достоверному снижению интегрального балла, во всех случаях. Естественно, что наилучшие результаты были получены при трансплантации костномозговых гемопоэтических клеток. Тем не менее, даже трансплантация стромальных клеток приводит к восстановлению эритроидного ростка кроветворения. При токсическом гепатите происходит снижение синтетической функции печени, что отражается на содержании фибриногена в плазме крови, что ведет к нарушению свертывания крови. Трансплантация всех вариантов клеточного материала приводит к повышению содержания фибриногена (рис. 3).
і* I Lb I j
3 сутки
I гепатит
~7 сутки
IV1IVICK
15 сутки
I IVlCK-1-rCK
Рис. 3. Влияние трансплантации клеточного материала на содержание фибриногена в плазме крови крыс
Таким образом, индукция токсического гепатита у крыс Вистар приводит к системному ответу, который характеризуется прогрессирующей анемией, изменением лейкоформулы, снижением содержания фибриногена в плазме крови. Трансплантация клеточного материала (ММСК, ГСК и их совместное введение) ведет к нормализации лейкоформулы, снижению тяжести анемии и повышению содержания фибриногена в плазме крови. Следовательно, трансплантированные в воротную вену клетки оказывают не только регионарный, но и системный эффект, выделяя ростовые факторы и воздействуя не только на больной орган, что необходимо учитывать в дальнейшей клинической практике. Вполне вероятно, что в таком случае факт приживления трансплантируемых клеток в ранние сроки можно будет оценивать именно по таким «клинически доступным» анализам, как гемограмма. Выделение ростовых факторов трансплантированными клетками приводит к быстрому ответу, что отражается на активно пролиферирующих клетках костного мозга.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гумерова А.А., Киясов А.П. Могут ли периси-нусоидальные клетки быть региональными стволовыми (прогениторными) клетками печени? // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010. Т. V. № 1. С. 33—40.
2. Гумерова А.А Звездчатые клетки печени стимулируют дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крысы в гепатоциты in vitro / Гумерова А. А., Шафигуллина А. К., Трондин А. А., Газизов И.М., Андреева Д.И., Калигин М.С., Ризванов А.А., Киясов А. П. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011. Т. VI. № 4. С. 72—81.
3. Киясов А.П. Трансплантация аутогенных гемо-поэтических стволовых клеток больным хроническими гепатитами / Киясов А.П., Одинцова А.Х., Гумерова А. А., Газизов И.М., Фаррахов А.З., Кундакчан Г.Г., Абдулхаков С.Р., Черемина Н.А. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2008. № 3. С. 70—75.
4. Луговская С.А., Почтарь М.Е. Гематологический атлас. М.; Тверь: Триада, 2004. 227 с.
5. Люблин Н.А., Конова Л.Б. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при
—-----------~
~ 27 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
—--------- —
патологиях. Для студентов и аспирантов факультетов ветеринарной медицины и технологического. Ульяновск: УГСХА, 2005. 113 с.
6. Люндуп А.В. Применение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга для коррекции фиб-розирующего повреждения печени (экспериментальное исследование): Автореф. дисс. канд. мед. наук. М., 2012. 26 с.
7. Урываева И.В. Стволовые клетки в регенерации печени // Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Т. 2 / Под ред. М. А. Пальцева. М.: Медицина; Шико, 2009. С. 211—252.
8. Aurich I. Functional integration of hepatocytes derived from human mesenchymal stem cells into mouse liver / Aurich I., Mueller L.P., Aurich H., Luetzkendorf J., Tisljar K., Dollinger M.M., Schormann W., Walldorf J., Hengstler J.G., Fleig W.E., Christ B. // Gut. 2007. Vol. 25. P. 1104—1113.
9. Banas A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes / Banas A., Teratani T., Yamamoto Y., Tokuchara M., Takeshita F., Quinn G., Oko-chi H., Ochiya T // Hepatology. 2007. Vol. 46. P. 219—228.
10. Najimi M. Adult-derived human liver mesenchymal-like cells as a potential progenitor reservoir of hepato-cytes? / Najimi M., Khuu D.N., Lysy P.A., Jazouli N., Abarca J., Sempoux C., Sokal E.M. // Cell Transplant. 2007. Vol. 16. P. 717—28.
11. Talens-Visconti R. Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells / Talens-Visconti R., Bonora A., Jover R., Mirabet V., Carbonell F., Castell J.V., Gomez-Lechon M.J. // World J Gastroenterol. 2006. Vol. 12. P. 5834—45.
12. Thorgeirsson S.S., Factor V.M., Grisham J.W. Early activation and expansion of hepatic stem cells // Handbook of Stem Cells. Vol. 2 Adult and fetal stem cells / Eds Lanza R., Gerhart G., Hogan B., et al. Burlington: Elsevier Academic Press, 2004. P. 497—512.
13. Thorgeirsson S. S. Hepatic stem cells in liver // FASEB J. 1996. Vol. 10. P. 1249—1256.
14.Zuk P.A. Human adipose tissue is a source of mul-tipotent stem cells / Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugar-te D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. // Molecular Biology of the Cell. 2002. Vol. 13. P. 4279—4295.
15. Журнал научных статей. Здоровье и образование в XXI веке. 2014. Т. 16. № 1.
16. Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». 2014. Т. 16. № 2. URL: http ://e-pubmed. org/isu 14-16-2. html
REFERENCES
1. Gumerova A.A., Kiyasov A.P. Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya inzheneriya, 2010, volume V, no. 1, pp. 33—40.
2. Gumerova A.A, Shafigullina A.K., Trondin A.A., Gazizov I.M., Andreeva D.I., Kaligin M.S., Rizvanov A.A.,
Kiyasov A.P. Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya inzheneriya, 2011, volume VI, no. 4, pp. 72—81.
3. Kiyasov A.P., Odintsova A.Kh., Gumerova A.A., Gazizov I.M., Farrakhov A.Z., Kundakchan G.G., Abdul-khakov S.R., Cheremina N.A. Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya inzheneriya, 2008, no. 3, pp. 70—75.
4. Lugovskaya S.A., Pochtar' M.E. Gematologiche-skiy atlas, Moscow, Tver', Triada, 2004, 227 p.
5. Lyublin N.A., Konova L.B. Metodicheskie reko-mendatsii k opredeleniyu i vyvedeniyu gemogrammy u sel'skokhozyaystvennykh i laboratornykh zhivotnykh pri patologiyakh, Ul'yanovsk, UGSKhA, 2005, 113 p.
6. Lyundup A.V. Primenenie mezenkhimal'nykh stromal'nykh kletok kostnogo mozga dlya korrektsii fibro-ziruyuschego povrezhdeniya pecheni (eksperimental'noe issledovanie), Doctor’s thesis, Moscow, 2012, 2б p.
7. Uryvaeva I.V. Biologiya stvolovykh kletok i kle-tochnye tekhnologii, volume 2, Pal'tseva M.A. (ed.), Moscow, Meditsina, Shiko, 2009, pp. 211—252.
8. Aurich I. Functional integration of hepatocytes derived from human mesenchymal stem cells into mouse liver I Aurich I., Mueller L.P., Aurich H., Luetzkendorf J., Tisljar K., Dollinger M.M., Schormann W., Walldorf J., Hengstler J.G., Fleig W.E., Christ B., Gut, 2007, vol. 25, pp. 1104—1113.
9. Banas A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes I Banas A., Teratani T., Yamamoto Y., Tokuchara M., Takeshita F., Quinn G., Oko-chi H., Ochiya T II Hepatology.. 2007. Vol. 4б. P. 219—228.
10. Najimi M. Adult-derived human liver mesenchymal-like cells as a potential progenitor reservoir of hepatocytes? I Najimi M., Khuu D.N., Lysy P.A., Jazouli N., Abarca J., Sempoux C., Sokal E.M., Cell Transplant, 2007, vol. 1б, pp. 717—28.
11. Talens-Visconti R. Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells I Talens-Visconti R., Bonora A., Jover R., Mirabet V., Carbonell F., Castell J.V., Gomez-Lechon M.J. World J Gastroenterol, 200б, vol. 12, pp. 5834—45.
12. Thorgeirsson S.S., Factor V.M., Grisham J.W. Early activation and expansion of hepatic stem cells II Handbook of Stem Cells. Vol. 2 Adult and fetal stem cells I Eds Lanza R., Gerhart G., Hogan B. et al. Burlington: Elsevier Academic Press, 2004, pp. 497—512.
13. Thorgeirsson S. S. Hepatic stem cells in liver, FASEB J., 199б, vol. 10, pp. 1249—125б.
14.Zuk P.A. Human adipose tissue is a source of mul-tipotent stem cells I Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugar-te D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H., Molecular Biology of the Cell, 2002, vol. 13, pp. 4279—4295.
15. Zhurnal nauchnykh statey. Zdorov'e i obrazo-vanie v XXI veke, 2014, volume 1б, no. 1.
16. Elektronnyy nauchno-obrazovatel'nyy vestnik «Zdorov’e i obrazovanie v XXI veke», 2014, volume 1б, no. 2, available at: http^Ie-pubmed.orgIisuM-^^.html
—----------- —
~ 28 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
