CC BY
23
УДК 616-098:579.841.11
ИЗМЕНЕНИЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ СВОЙСТВ BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С TETRAHYMENA PYRIFORMIS
Е.В. Король, Л.К. Меринова, Н.Г. Плеханова, О.А. Меринова, Е.В. Шубникова, Т.В. Сенина
ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Проведен пассаж культуры возбудителя мелиоидоза, Burkholderia pseudomallei, в клетках Tetrahymena pyriformis. Установлена способность микроорганизма к выживанию и размножению в простейших. После пассажа в тетрахименах отмечено увеличение продукции внеклеточных ферментов, подвижности и снижение вирулентности культур.
Ключевые слова: Burkholderia pseudomallei, Tetrahymena pyriformis, пассирование, фенотипические свойства. DOI 10.19163/1994-9480-2018-2(66)-44-46
ALTERATION OF PHENOTYPIC CHARACTERISTICS OF BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI DURING INTERACTION WITH TETRAHYMENA PYRIFORMIS
E.V. Korol, L.K. Merinova, N.G. Plekhanova, O.A. Merinova, E.V. Shubnikova, T.V. Senina
FPHI « Volgograd Research Anti-Plague Institute» of Federal Service for Supervision of Consumer Rights
Protection and Human Welfare
Passaging of Burkholderia pseudomallei cultures has been carried out in Tetrahymena pyriformis cells. It has been adjusted, that microorganism multiples in protozoa. Passaging leads to increasing of production of extracellular enzymes, motility and decreasing of virulence of microorganism.
Key words: Burkholderia pseudomallei, Tetrahymena pyriformis, passaging, phenotypic characteristics.
Возбудитель мелиоидоза, Burkholderia pseudo-mallei- сапрофитный микроорганизм, обитающий в почве и воде эндемичных регионов Юго-Восточной Азии, Северной Австралии, южного Китая [2]. Некоторые исследователи предполагают, что выживание его во внешней среде может быть связано со способностью перси-стировать в биотических объектах, таких как Acantamoeba spp., в ассоциации с которыми внутриклеточно локализованные буркхольдерии оказываются более защищенными от экстремальных воздействий среды [4].
На примере ряда патогенных микроорганизмов показано, что в клетках простейших, амеб или тетрахи-мен, интернированные микроорганизмы в процессе адаптационной изменчивости приобретают повышенную резистентность к факторам окружающей среды и частично утрачивают свойства, необходимые для выживания в макроорганизме [1, 3].
Природная способность возбудителя мелиоидоза к существованию как в сапрофитической, так и паразитической фазах является свидетельством высокого потенциала адаптационных возможностей, что находит подтверждение в структуре его генома [8]. Однако характер и механизмы изменчивости B. pseudomallei во внешней среде, в том числе, обусловленные взаимодействием с простейшими, мало изучены.
В настоящей работе, используя приемы, описанные для других микроорганизмов, мы осуществили совместное культивирование B. pseudomallei цилиарной инфузорией Tetrahymena pyriformis, убиквитарным обитателем водных экосистем, и исследовали в процессе их взаимодействия некоторые известные фенотипичес-кие свойства микроорганизма.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить свойства буркхольдерий после пассажа в клетках T. pyriformis и выявить возможные отличия от фенотипа культур, выделенных от экспериментальных животных.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Были использованы дикий штамм B. pseudomallei 110, вирулентный для мышей линии BALB/c ^501х103м. к.), а также пуринзависимый ауксотрофный авирулентный мутант VPA (LD50 > 1х109м. к.). Аксеническая культура T. pyriformis получена из Института Цитологии РАМН (г Санкт-Петербург). Тетрахимены выращивали в Luria-Bertani (LB) бульоне (HiMedia) при температуре 28 оС.
Буркхольдерии, выращенные на агаре LB при 32 оС 24 ч, суспендировали в стерилизованной авто-клавированием речной воде и соединяли с тетрахиме-нами в соотношении 100:1 (1 х106 м. к./мл бактерий и 1 х104 кл/мл тетрахимен) в LB бульоне.
Сокультуры микроорганизма и тетрахимен инкубировали в климатической камере («Sanyo», Япония) при температуре 28 оС на протяжении срока наблюдения (до 10суток).
Для определения динамики размножения культур B. pseudomallei, ассоциированных с T. pyriformis, из со-культур ежедневно производили высев на плотную питательную среду LBагар для подсчета выросших колоний.
Наличие внутриклеточной локализации микроорганизма в простейших определяли, используя метод, предложенный в работе Inglisetal [5].
Для осуществления пассажа B. pseudomallei в клетках тетрахимен образцы сокультур отбирали
I^mpfe ©©СаГГГМЩ
спустя трое суток от начала совместного культивирования; материал осаждали центрифугированием при 8000 об./мин, 10 мин, отмывали в свежей среде LB и соединяли с проверенной на аксеничность культурой тетрахимен.
Активность внеклеточных ферментов определяли на плотных питательных средах, содержащих необходимые субстраты: 1 %-й раствор «Skimmilk» («HiMedia», США), лецитин (100 мг на 100 мл среды), гемолизированную кровь (5%-ю) при определении протеазной, лецитиназной, генолитической активности соответственно. Подвижность тестировали на среде Motility («HiMedia», США) с добавлением 1 %-го ТТХ (трифенилтетразолия хлорида).
Вирулентность буркхольдерий определяли на мышах линии BALB/c при внутрибрюшинном заражении 24 ч культурами B. pseudomallei в дозах 1х103 -1х104 м.к. и оценивали ее по динамике гибели животных в группах.
При статистической обработке полученных данных применяли методы определения средних величин и доверительных границ к ним (p < 0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что взаимодействие различных патогенных микроорганизмов с T. pyriformis, сопровождается образованием в клетках простейших фагоцитарных вакуолей, содержащих поглощенные бактерии. При этом значительная часть интернированных бактерий в вакуолях тетрахимен подвергается лизису, но оставшиеся резистентные к фагоцитозу микроорганизмы могут размножаться в них [6, 7].
Для установления способности B. pseudomallei размножаться в клетках T. pyriformis определяли динамику роста буркхольдерий в сокультурах и параллельно в LB без простейших (рис. 1). Как показано на рис. 1, в ассоциированных культурах в первые 24 ч отмечалось выраженное уменьшение количества бактерий (на 2 порядка), а затем восстановление его до исходного уровня, свидетельствующее о размножении микроорганизмов, выживших в фагосомах.
B. Pseudomallei УРА (до п х 105м.к./мл) и относительное быстрым, за тот же период времени, нарастание и уменьшение концентрации бактерий вирулентного штамма B. Pseudomallei 110 (до п х 104м. к./мл).
Дополнительные данные о внутриклеточной локализации размножающихся интернированных буркхоль-дерий были получены при исследовании чувствительности к антибактериальным препаратам сокультур микроорганизма с тетрахименами в сравнении с культурами в LB. Определение минимальных бактерицидных концентраций (МБК) для B. Pseudomallei цефтазидима, док-сициклина, меропенема показало, что ассоциированные с тетрахименами культуры отличались повышенной резистентностью к этим антибиотикам, что являлось результатом ограниченного проникновения антибактериальных препаратов в эукариотические клетки (рис. 2).
Рис. 2. Чувствительность к антибиотикам B. Pseudomallei 110 в сокультуре с T. pyriformis
При выборе режима пассажа B. Pseudomallei 110 в Т. РупОгт'^ основывались на данных динамики размножения его культур в клетках тетрахимен .Исследованию подвергали культуры, выделенные из клеток тетрахимен после 15 пассажей: их высевали на различные селективные среды для определения продукции внеклеточно секретируемых ферментов (протеаз, леци-тиназы, гемолизинов), а также подвижности (табл.).
Активность внеклеточных ферментов B. Pseudomallei
Штамм Диаметр зоны, мм
24 ч 48 ч
Exp Lec Hem Exp Lec Hem Mot
B. pseudomallei 110 исх. 2 2 <1 10 4 2 15
B. pseudomallei 110з.х. 4 2 <2* 14 4 2* 20
B. pseudomallei 110 Т.р. 6 4 <2 18 8 2 25
B. pseudomallei 110 з.х.+Т.р. 6 4 <2 10 8 2 25
B. pseudomallei 110 LB 2 2 <1 10 4 2 15
Рис. 1. Динамика размножения Б. pseudomallei в сокультуре с Т. Pyriformis
Кривые роста культур в ассоциации с Т. pyriformis имели отчетливые различия, зависящие от штамма. Более медленным было увеличение и снижение концентрации клеток авирулентного штамма
*р-гемолитическая активность.
Примечание: B. Pseudomallei 110 исх.- исходная культура; B. Pseudomallei 110 з.х. - культура от золотистых хомячков; 110 T.p. - после пассажа в T. pyriformis; 110 з.х. + Т.р. - от золотистых хомячков после пассажа в T. pyriformis; 110 LB - после пассажа в LB; Exp - экзопротеаза, Lec - лецитиназа, Hem - гемолизин, Mot - подвижность.
Как видно из табл., показатели активности внеклеточных ферментов и подвижность исходной культуры B. Pseudomallei 110 и культуры после пассажа в LB не имели отличий. Максимально выраженной протеазной, ле-цитиназной активностью и подвижностью обладали культуры, выделенные из клеток тетрахимен. Характерной особенностью культур, полученных от золотистых хомячков, было увеличение, в сравнении с исходной культурой, функции протеаз и подвижности, а также наличие р-гемо-литической активности. Однако после пассажа в клетках тетрахимен культур, выделенных от животных, наблюдали исчезновение р-гемолитической активности и формирование вокруг колоний зоны неполного гемолиза.
Вирулентность культур, выделенных из клеток Т. pyriformis, представлена на рис. 3.
5 \
¡8 4 \ -В. pseudomallei ПО
^ I 3 V^
Е " " \ ----В. psetidoiiiallei
| 1 \ 110, массированный
[) * в Т. pyiifomris
О 3 5 6 8 10 15 20 25 30
Бремя (сутки)
Рис. 3. Время гибели мышей линии ВА1_В/с, зараженных культурой Б. pseudomallei 110 в дозе 1 х 104 м.к., пассированной в клетках Т. pyriformis
Показано, что после пассажа в тетрахименах культура не вызывала гибели мышей линии BALB/c в течение срока наблюдения (30 дней), в то время как исходный штамм Б. Pseudomallei 110 приводил к гибели животных на 5-6-е сутки (рис. 3).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, как следует из приведенных материалов, возбудитель мелиоидоза может выживать и размножаться в клетках простейших вида Т. pyriformis. Пассаж в клетках тетрахимен оказывает влияние на фе-нотипические свойства Б. pseudomallei, способствуя увеличению подвижности, продукции внеклеточно сек-
ретируемых ферментов (протеаз, лецитиназы). Одновременно с этим в результате пассажа в простейших нивелируется приобретенная в организме экспериментальных животных способность к р-гемолитической активности и снижается вирулентность для экспериментальных животных.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Белов А.Б., Куликалова Е.С. Сапронозы: экология возбудителей, эпидемиология, терминология и систематика [Belov A.B., Kulikalova E.S. Sapronoses: ecology of pathogens, epidemiology, terminology and taxonomy] // Эпидемиология и вакцинопрофилактика [Ehpidemiologiya i vakcinoprofilaktika. Epidemiology and vaccine prevention]. -2016. - № 1 (86). - С. 5-16.
2. Cheng A.C., Currie B. J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management // Clin. Microb^l. Rev. -2005. - Vol. 18 (2). - P. 383-416.
3. Denoncourt A.M., Paquet V.E., Charette S.J. Potential role of bacteria packaging by protozoa in the persistence and transmission of pathogenic bacteria // Front. Microbiol. -2014. - P. 240.
4. Inglis T.J., Sagripanti J.L. Environmental factors that affect the survival and persistance of Burkholderia pseudomallei // Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - Vol. 72. -P. 6865-6875.
5. Inglis T.J., Rodrigues F., Rigby P., Norton R., Currie B.J. Comparison of the susceptibilities of Burkholderia pseudomallei to meropenem and ceftazidime by conventional and intracellular methods // Antimicrib. Agents Chemother. - 2004. - Vol. 48 (8). - P. 2999-3005.
6. Pushkareva V.I., Ermolaeva S.A. Listeria monocytogenes virulence factor Listeriolysin O favors bacteria growth in co-culture with the ciliate Tetrahymena pyriformis, causes protozoan encystment and promotes bacterial survival inside cysts // BMC Microbiol. - 2010. - P. 10-26.
7. Siegmund L., Burmester A., Fisher M.S., Wostemeyer J. Ingestion and digestion studies in Tetrahymena pyriformis based on chemically modified microparticles // European J. of Protistology. - 2013. - Vol. 49. - P. 552-563.
8. Tumapa S., Holden M.T., Vesaratchavest M., Wuthiekanun V., Limmathurotsakul D., et al. Burkholderia pseudomallei genome plasticity associated with genomic island variation // BMC Genomics. - 2008. - Vol. 9. - P. 190.
Контактная информация
Король Екатерина Васильевна - научный сотрудник лаборатории сапа и мелиоидоза, Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, e-mail: [email protected]
