CC BY
244
БИОЛОГИЯ
Вестн. Ом. ун-та. 2013. № 4. С. 187-190.
УДК 575.224:595.773.4:577.112 К.А. Тарасова, И.В. Батлуцкая
ИЗМЕНЕНИЕ ЧАСТОТЫ ДОМИНАНТНЫХ МУТАЦИЙ У ДРОЗОФИЛЫ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ НЕКОТОРЫХ ПРОДУКТОВ БИОХИМИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА
Проведен генетический анализ с использованием Drosophila melanogaster. Дана оценка степени влияния некоторых разновидностей подсолнечных масел на изменение частоты доминантных летальных мутаций у линий Canton-S, Muller-5, vestigial, white дрозофилы.
Ключевые слова: дрозофила, Canton-S, Muller-5, vestigial, white, доминантные летальные мутации, биологический контроль.
Осознание опасности индуцированного мутагенеза для жизни и здоровья человека привело к развитию исследований по разработке методов, тактики и стратегии генетического скрининга, направленного на выявление и устранение потенциальных мутагенов из среды обитания [1]. Поэтому необходима разработка системы мониторинга качества пищевых продуктов, которая будет включать разнообразные тесты для определения их доброкачественности или степени вредного воздействия на организмы [2].
Широкое применение на сегодняшний день нашли методы тестирования при помощи живых организмов (организмов-индикаторов), а именно мух Drosophila melanogaster.
Метод учета доминантных летальных мутаций (ДЛМ) применяется для экспресс-оценки возможного оказываемого канцерогенного влияния разнообразных химических соединений на исследуемый организм. Обзор теоретического материала по данной проблеме показал, что этот метод применяется достаточно широко для исследования отдельных химических соединений, однако данных о применении этого метода именно к пищевым продуктам обнаружено не было. Этим объясняется новизна проведенных нами исследований.
Целью данной работы было провести генетический анализ с использованием линий Canton-S, Muller-5, vestigial, white дрозофилы (Drosophila melanogaster) для биологического контроля подсолнечного масла 2-х видов: масла торговой марки «Слобода» рафинированного дезодорированного и нерафинированного подсолнечного масла.
Из указанных двух видов подсолнечного масла были приготовлены 4 пробы: масло «Слобода» рафинированное дезодорированное в сыром виде (Раф) - 100 мл и термообработанное (Раф, t) - 100 мл; масло нерафинированное в сыром виде (Н/раф) - 100 мл и термообработанное (Н/раф, t) -100 мл.
Степень мутагенной активности анализируемых продуктов определяли по их способности индуцировать ДЛМ у дрозофилы рассматриваемых линий (мутационных рас), которые представляют собой генетические изменения, индуцированные в родительских зародышевых клетках и приводящие к гибели первого поколения потомков на эмбриональных стадиях развития.
Частота ДЛМ определялась по методике Е.М. Белоконь, как процент отложенных неразвившихся яиц по отношению к общему числу отложенных яиц [3].
Для анализа степени мутагенности исследуемых продуктов были поставлены опытные и контрольные скрещивания. Для постановки опытных скрещиваний была приготовлена стандартная питательная среда в
© К.А. Тарасова, И.В. Батлуцкая, 2013
5-ти повторениях (объемом на 1000 мл воды). В каждое опытное повторение мы добавили по 1-й из 4-х проб подсолнечного масла объемом 50 мл. Для контроля использовали питательную среду без добавления масла. Каждую готовую питательные среду разлили по 20 стаканчикам (по 5 штук для каждой линии мух) объемом 100 мл, по 20 мл питательной среды в каждый.
В каждом стаканчике были поставлены скрещивания. Для этого в них были посажены по 10 пар вылетевших мух (сразу после окончания формирования признаков полового диморфизма) каждой линии. Всего было проанализировано 100 стаканчиков.
Все мухи содержались в термостате при температуре 25 оС. Через 2-4 суток (в зависимости от линии) было отброшено родительское поколение и подсчитано количество яиц, отложенных мухами в каждом стакане. Для подсчета использовали стереоскопический микроскоп Микромед МС-2 с увеличением 2х10. Для удобства скальпелем питательную среду делили на секторы и производили подсчет по секторам лежащих на поверхности яиц, затем суммируя их количество. Далее стаканы помещали обратно в термостат при той же температуре и дожидались вылета имаго из подсчитанных яиц. После вылета взрослых мух учитывалось их количество. На основе полученных числовых данных вели расчет частоты ДЛМ.
Все полученные данные обрабатывали статистически. Значимость различий между контролем и опытом определяли с помощью 1-критерия Стьюдента для независимых выборок [4]. Определяли стандартную ошибку
средней, величину стандартного отклонения для n < 30, вычисляли коэффициент вариации.
Результаты подсчета представлены в таблице и на рисунке.
На диаграмме видно, что наибольшие средние величины частоты ДЛМ у мух всех линий наблюдаются в пробах с маслом нерафинированным, термообработанным.
Наименьшие средние величины указанного показателя в контрольных пробах.
Таким образом, анализируя данные, можно расположить исследуемые пробы по степени мутагенной активности в следующем порядке (по убыванию): Н/раф, t > > Раф, t > Раф > Н/раф > Контроль.
Если сравнивать показатели частоты ДЛМ по линиям в каждой пробе, то наименьшая средняя частота доминантных летальных мутаций наблюдается во всех пробах у линии Canton-S, далее следует линия white, затем vestigial и, наконец, наибольшая средняя частота ДЛМ у линии Muller-5 (кроме пробы Н/раф - наибольшая средняя частота ДЛМ в этом случае в пробах у линии vestigial).
Наибольшая средняя величина частоты ДЛМ у мух линии Canton-S наблюдается на опытной среде Н/раф, t и составляет 13,51 ± 0,53 %. Вторая по величине частоты доминантных летальных мутаций идет проба Раф, t (11,49 ± 0,56 %). В контроле частота ДЛМ достоверно ниже и составляет 5,78 ± 0,27 % (р < 0.05). При сравнении двух указанных проб между собой достоверных различий не наблюдается.
Результаты подсчета частоты доминантных летальных мутаций (%)
Линия Раф, t Н/раф, t Раф Н/раф Контроль
Canton-S 11,49 ± 0,56 13,51 ± 0,53 7,22 ± 0,74 7,36 ± 0,85 5,78 ± 0,27
Muller-5 28,76 ± 0,94 33,34 ± 0,99 16,34 ± 0,72 11,05 ± 0,37 10,01 ± 0,49
vestigial 29,93 ± 1,29 32,47 ± 1,38 13,92 ± 0,66 12,74 ± 0,54 7,10 ± 0,25
white 28,17 ± 1,38 31,31 ± 3,32 9,93 ± 0,77 10,11 ± 0,33 6,11 ± 0,15
И Canton-S Е) Muller-5 □ vestigial □ white
Средняя частота ДЛМ в различных пробах
Изменение частоты доминантных мутаций у дрозофилы..
189
Величины средней частоты ДЛМ в пробах с теми же маслами, но без термообработки примерно одинаковы и составляют в пробе Раф - 7,22 ± 0,74 %, в пробе Н/раф -7,36 ± 0,85 %. Достоверно значимых различий между этими двумя пробами для линии Canton-S не наблюдается. Также не значимы различия между рассматриваемыми пробами и контролем.
При сравнении частоты ДЛМ линии Canton-S в пробах с маслом рафинированным и рафинированным термообработанным наблюдаются статистически значимые различия (р < 0.05). Аналогично в пробах с маслом нерафинированным и нерафинированным термообработанным (р < 0.05).
Таким образом, пробы с термообработанными маслами достоверно индуцируют ДЛМ у дрозофилы линии дикого типа. При этом по степени воздействия на дикий тип дрозофилы между рафинированным и нерафинированным подсолнечными маслами, как с термообработкой, так и без нее, разницы практически не наблюдается. Добавление не обработанных температурой масел в стандартную питательную среду, в которой содержались мухи линии Canton-S, существенного влияния на эмбриональное развитие особей не оказывает.
В отличие от мух дикого типа между показателями частоты ДЛМ у линии Muller-5, содержавшихся на питательной среде с добавлением нерафинированного термообработанного подсолнечного масла и на среде с рафинированным термообработанным маслом, наблюдается достоверная разница (р < 0.05). В первом случае (Н/раф, t) средняя частота ДЛМ достоверно выше, чем во втором (Раф, t) и составляет, соответственно, 33,34 ± 0,99 % и 28,76 ± 0,94 %.
При сравнении этих показателей с контрольными образцами также наблюдаются статистически значимые различия (р < 0.05). Средняя частота доминантных леталей в контроле у линии Muller-5 составляет 10,01 ± 0,49 %. В пробах Раф этот показатель достоверно возрастает относительно контрольных проб примерно на 6 % и составляет уже 16,34 ± 0,72 % (р < 0.05). В пробах Н/раф среднее значение частоты ДЛМ возросло всего на 1 % (11,0 5 ± 0,37 %), что не является статистически значимым по сравнению с контрольными пробами. Полученное эмпирическое значение t-критерия при сравнении образцов с рафинированным и нерафинированным маслами находится в зоне значимости (р < 0.05).
При сравнении частоты ДЛМ линии Muller-5 в пробах с маслом рафинированным и рафинированным термообработанным наблюдаются статистически значимые различия (р < 0.05). Аналогично в пробах с маслом нерафинированным и нерафинированным термообработанным (р < 0.05).
Таким образом, можно отметить, что Muller-5 чувствительнее прореагировала на добавление в нормальную питательную среду термообработанного и необработанного температурой масла. Если мухи нормальной линии не показали существенных различий между сырыми маслами и контролем, то мухи линии Muller-5 показали достоверные различия. Это можно объяснить большей чувствительностью линии к изменению химического состава среды, на которой они содержатся.
На контрольной среде у линии vestigial показатель средней величины частоты ДЛМ самый низкий. Он составляет 7,10 ± 0,25 %.
Самые высокие показатели частоты доминантных леталей наблюдаются в опытных стаканчиках с маслами, прошедшими термообработку, и составляют 29,93 ± 1,29 % (Раф, t) и 32,47 ± 1,38 % (Н/раф, t). В сравнении с контролем указанные величины достоверно выше (р < 0.05). Значимых различий между этими показателями нами не выявлено.
Добавление в стандартную среду для содержания линии vestigial рафинированного и нерафинированного масел, не подвергавшихся термообработке, также индуцирует у мух данной линии ДЛМ. По сравнению с контролем этот показатель в пробе с рафинированным маслом достоверно выше и составляет 13,92 ± 0,66 % (р < 0.05); в пробе с нерафинированным маслом - 12,74 ± 0,54 % (р < 0.05). Статистически значимых различий между этими пробами нет.
При сравнении средней частоты ДЛМ мух линии vestigial в опытных пробах с добавлением рафинированного масла без термообработки и после термообработки выявлены достоверные различия (р < 0.05). То же самое наблюдается при сравнении проб с добавлением нерафинированного масла после термообработки и без термообработки.
Реакция линии с мутацией зачаточных крыльев vestigial так же, как и линии Muller-5, выражена сильнее по сравнению с диким типом. Это проявляется в том, что достоверно возрастает частота ДЛМ в опытных пробах с сырыми маслами по сравнению с контролем.
У линии white дрозофилы, как и у трех предыдущих линий, самый низкий уровень частоты ДЛМ наблюдается в контрольных пробах. Его средняя величина составляет 6,11 ± 0,15 %.
Самый высокий уровень частоты доминантных леталей так же, как и у линий Canton-S, Muller-5, vestigial, в пробах с маслами, подвергшимися термообработке. А именно: в пробе с термообработанным рафинированным подсолнечным маслом -28,17 ± 1,38 %, в пробе с термообработанным нерафинированным несколько выше -31,31 ± 3,32 %. Наблюдаются достоверные различия между уровнем частоты ДЛМ в
опытных пробах Раф, t и контролем (р < 0.05). Различия между частотой доминантных летальных мутаций в пробах Н/раф, t и контролем можно считать достоверными при р < 0.1. Между собой показатели данных отличаются незначимо.
В пробе с обычным рафинированным маслом уровень частоты ДЛМ достоверно ниже по сравнению с рафинированным термообработанным (р < 0.05) и равен 9,93 ± 0,77 %. В аналогичной пробе с нерафинированным подсолнечным маслом он составляет 10,11 ± 0,33 %, что также достоверно ниже по сравнению с нерафинированным термообработанным (р < 0.1).
Достоверных различий не выявлено при сравнении средних величин частоты ДЛМ в стаканчиках с рафинированным и нерафинированным маслами. Однако в сравнении с контролем статистически значимые различия есть. Так, уровень частоты доминантных леталей в пробах с маслом рафинированное достоверно отличается от рассматриваемых показателей в контрольных средах при р < 0,1, в пробах с нерафинированным - при р < 0.05.
В целом можно отметить, что реакция мух линии white на добавление двух разновидностей подсолнечного масла (рафинированного и нерафинированного), как термообработанных, так и без обработки, схожа с таковой у линии vestigial. Однако данный
опыт показывает, что линия с мутацией зачаточных крыльев дает более точные результаты по сравнению с линией мутации белых глаз (в опыте Н/раф, 1 ошибка выборочной средней превышает 10 %, а в опыте Раф - 7 %).
Таким образом, можно отметить различные реакции каждой рассматриваемой линии дрозофилы на все пробы, что является ожидаемым и обусловливается особенностями каждой линии и различной мутагенной активностью проб.
Меньшее влияние оказывают все пробы на мух дикого типа. Более существенное влияние проявляется у мух мутированных линий. Наиболее выраженной ответной реакцией среди них обладает линия Ми11ег-5.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Бондаренко Л. В. Генетическая токсикология // Экологическая генетика. 2007. Т. 5. № 1. С. 39-41.
[2] Гоигорьева Р. З. Безопасность продовольственного сырья и продуктов питания : учеб. пособие. Кемерово : Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, 2004. 86 с.
[3] Белоконь Е. М. Методические указания к определению мутагенной активности химических препаратов на дрозофиле. Львов : ЛГУ, 1984. 26 с.
[4] Лакин Г. Ф. Биометрия. М. : Высшая школа, 1990. 351 с.
