CC BY
45
СЫРЬЕ И ДОБАВКИ
Изменение аминокислотного состава мясного сырья
Е.И.Титов, Л.Ф.Митасева, Н.Г.Машенцева
Московский государственный университет прикладной биотехнологии С.В.Костров, И.В.Демидюк
Институт молекулярной генетики РАН
Одна из глобальных проблем, стоящих перед современной цивилизацией, - дефицит полноценного пищевого белка. Для повышения эффективности пищевой и перерабатывающей промышленности с целью максимального удовлетворения потребностей общества в отечественных продуктах питания требуется перестройка традиционных технологических процессов, основанных на комплексном использовании сырья и создании малоотходных и безотходных технологий, а также поиск новых нетрадиционных направлений переработки ценного животного сырья.
В пищевой промышленности накоплен определенный опыт создания биотехнологий по переработке недостаточно используемых вторичных сырьевых ресурсов, в том числе отходов переработки сельскохозяйственного сырья. Одно из перспективных направлений обработки вторичного мясного сырья - его ферментация с помощью микроорганизмов и их ферментов [1]. Полученную при этом биомассу можно использовать как полноценный белковый композит в технологиях производства различных мясопродуктов.
Проведенные ранее Московским государственным университетом прикладной биотехнологии исследования по биотрансформации нестандартного мясного сырья микроорганизмами и их консорциумами [2] выявили изменения качественных характеристик
мясного субстрата - вкуса, аромата, цвета и консистенции. Также было установлено, что музейные культуры МГУПБ, такие как Lactobacillus plantarum и Macrococcus caseolyticus, используемые в процессе биотрансформации низкосортного мясного сырья, обладают протеиназной и амино-пептидазной активностью.
Теоретически изменения белка, происходящие под действием ферментов микроорганизмов, можно объяснить следующим образом. Под действием протеиназ белок расщепляется на определенное количество пептидов. Завершают гидролиз белков пептидазы, проявляющие различную специфичность, которые катализируют гидролиз пептидов до свободных аминокислот. В процессе биотрансформации нестандартного мясного сырья в результате действия ферментной системы молочнокислых бактерий мышечные белки расщепляются на определенное количество пептидов, а затем наступает стадия гидролиза пептидов до свободных аминокислот (рис.1).
Проведенные исследования были направлены на выяснение влияния ферментативной системы штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum 31, 32 и Macrococcus caseolyticus 38 на изменение аминокислотного состава низкосортного мясного сырья.
Нестандартное сельскохозяйственное мясное сырье (легкое + селезенка в соотношении 1:1) подвергали предварительной обработке (очистка, промывка, ошпарка) и измельчали на волчке, а затем эмульгировали с помощью блендера. К полученному препарату добавляли 3 % NaCl, 10 % молочной сыворотки (в качестве дополнительного источника белков и углеводов), а также 0,003 % солей аммония к массе мясного сырья. После чего в субстрат вносили бактериальную биомассу молочнокислых микроорганизмов Lactobacillus plantarum 31 и 32 (0,2 % бактериальной закваски к массе несоленого сырья при содержании в ней 109 КОЕ на 1 мл), Macrococcus caseolyticus 38 (0,05 % бактериальной закваски к массе несоленого сырья при содержании в ней 109 КОЕ на 1 мл) и инкубировали при 25 °С. Предварительно биомассу микроорганизмов
наращивали на жидкой среде MRS при 37 °С 24 ч. Пять образцов инкубировали в течение 24 ч и пять - в течение 48 ч. В контрольные образцы бактериальную биомассу не вносили. Масса одного образца составляла 80-100 г. Биотрансформированные и контрольные образцы замораживали и хранили при -20 °С.
Образцы после биотрансформации и контрольный образец исходного субстрата размораживали при комнатной температуре и тщательно перемешивали. Затем брали навески и лио-фильно высушивали их до постоянной массы. Полученные сухие образцы растирали в ступке до пудрообразного состояния. Приготовленные таким образом препараты использовали для кислотного гидролиза.
Навески сухих растертых образцов помещали в стеклянные ампулы, затем добавляли по 400 мкл смеси, состоящей из 2 мл концентрированной HCl, 1 мл трифторуксусной кислоты и 3 мкл ß-меркаптоэтанола. Ампулы запаивали и выдерживали 1 ч при 155 °С. После инкубации ампулы вскрывали, и высушивали образцы на роторном испарителе. Для удаления остатков кислот дважды добавляли по 400 мкл воды и высушивали. Затем образцы растворяли в 1 мл воды. К 50 мкл полученного раствора добавляли 450 мкл воды. К 100 мкл этой смеси добавляли 150 мкл 0,1 HCl, и полученный раствор использовали для нанесения на аминокислотный анализатор.
Аминокислотный анализ проводили с применением хроматографии на сульфополистирольном ионообмен-нике с элюцией ступенчатым градиентом Na-цитратных буферных растворов на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония) [3, 4]. Объем наносимой автоматическим инжектором пробы - 145 мкл.
Полученные данные о содержании отдельных аминокислот в образцах нормировали на общую массу всех определенных в образце аминокислот. Затем вычисляли средние арифметические для нормированных значений в каждой группе образцов (без ферментации, с ферментацией 24 ч и 48 ч). Для каждой группы по каждой аминокислоте рассчитывали доверительный интервал с доверительной вероятностью р =0,95. Для расчета доверительного интервала использовали формулу Дх = , где Дх - доверительный интервал; n- число измерений; t - коэффициент Стьюден-та для соответствующих n (доверительная вероятность); Sn - среднеквадратичное отклонение. В расчете
82 ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ 11/2004
RAW MATERIALS AND ADDITIVES
Аминокислоты Содержание аминокислот в образцах, мкг/100 мкг аминокислот
Ферментация 24 ч Ферментация 48 ч Без ферментации
Tau 0,44+0,12 0,52+0,12 0,45+0,17
OH-Pro 1,46+0,10 1,56+0,12 0,45+0,17
Thr Ser 3,41+0,08 2 39+0 06 3,18+0,05 9,91+0,17 9,91+0,17 3,64+0,15 2,54+0,18 2,54+0,18
Glu 15,40+0,16 15,93+0,30 5 01+0 23 15,06+0,32 6,00+0,12 6,00+0,12
Gly 10,30+0,31 10,71+0,16 10,63+0,05
Cys2 0,89+0,47 0,86+0,15 8,86+0,09 8,86+0,09 0,85+0,07
Met Ile 1,62+0,10 1,71+0,06 7,44+0,12 7,44+0,12 1,58+0,07
Leu 9,73+0,07 10,08+0,12 4,30+0,07 4,30+0,07 9,51+0,13
Tyr Phe 4,79+0,19 4,91+0,16 0,23+0,34 4,47+0,53
Orn 1,16+0,09 1,58+0,11 0,28+0,00 0,18+0,01
Lys His 1,81+0,04 1,66+0,06 8,19+0,09 8,19+0,09 1,90+0,14
Trp Arg 1,43+0,51 1,07+0,48 0,34+0,19 1,86+0,66
были взяты значения коэффициентов Стьюдента, встроенные в табличный процессор Excel XP (Microsoft, США).
Было проведено пять независимых экспериментов для каждого времени инкубации. В качестве контроля использовали субстрат, не подвергшийся биотрансформации (три независимых определения аминокислотного состава). Кислотный гидролиз образцов проводили согласно методике с использованием смеси соляной и трифторуксусной кислот. Присутствие сильной органической кислоты позволяет существенно сократить время гидролиза с 24 до 1 ч, не приводя к заметным изменениям аминокислотного состава гидролизата [5]. Аминокислоты разделяли по классическому методу Шпэкмана, Штайна и Мура с использованием катионооб-
менной хроматографии на сульфопо-листирольных смолах [3, 4].
Полученные в результате аминокислотного анализа данные о мольном содержании аминокислот в образцах для сравнения полученных данных между собой были нормированы, т.е. содержание каждой аминокислоты было выражено в долях к общему количеству определенных аминокислот, суммарного белка или общей массе образца. Для каждой аминокислоты в каждой серии (24 ч ферментации, 48 ч ферментации и без ферментации) были рассчитаны средние значения и получены доверительные интервалы для них с доверительной вероятностью р = 0,95. Данные расчета приведены в таблице и представлены в виде диаграммы на рис.2.
Анализ полученных данных показывает, что может быть выделена группа аминокислот (Asp, Thr, Ser, Glu, Pro, Leu, Orn, Lys, His), содержание которых в образцах изменяется. По минимальной оценке, величина этих изменений находится в диапазоне от 2 до 13 %. Исключение составляет орнитин, содержание которого в ходе ферментации увеличивается в 6,4 раза за 24 ч и в 8,8 раза за 48 ч.
Установлено, что в результате обработки низкосортного мясного сырья молочнокислыми микроорганизмами Lactobacillus plantarum 31 и 32, Vacrococcus caseolyticus 38, обладающими протеазной и аминопептидазной активностью, наблюдаются изменения содержания ряда аминокислот (Asp, Thr, Ser, Glu, Pro, Leu, Orn, Lys, His): снижение аспарагиновой кислоты, треонина, серина, пролина, гистидина и увеличение глутаминовой кислоты, лейцина и орнитина (от 2 до 13 %).
Концентрация и состав образуемых аминокислот влияют на биологическую ценность сырья, а также коррели-руются со специфическими вкусовыми признаками. Известно, что свободные аминокислоты - предшественники некоторых летучих соединений, которые формируют вкус и аромат готового продукта. Поэтому дальнейшие исследования будут направлены на подбор микроорганизмов и их консорциумов, позволяющих целенаправленно изменять содержание необходимых аминокислот в низкосортном мясном сырье.
ЛИТЕРАТУРА
1. Рогов И.А., Ганина В.И., Хорольс-кий В.В. Процессы интеграции биотехнологии пищевых продуктов с генетикой микроорганизмов / 1-й Международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития». -М., 2002.
2. Хорольский В.В., Княжев В.А., Ту-тельян В.А., Рогов И.А, Митасева Л.Ф., Машенцева Н.Г. и др. Патент «Способ получения биологически полноценного белкового композита», заявка № 2001132972/13 (035441).
3. Spackman D.H., Stein W.H., Moore S. Automatic Recording Apparatus for Use in the Chromatography of Amido Acids//Analyt. Chem. 1958.
4. Moore S., Spackman D.H., Stein W.H. Chromatography of Amido Acids on Sulfonated Polystyrene Resins// Analyt. Chem. 1958.
5. Tsugita A., Scheffler J.J. A rapid method for acid hydrolysis of protein with a mixture of trifluoroacetic acid and hydrochloric acid//Eur. J. Biochem. 1982.
ПИЩEBАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ 11/2004
83
