CC BY
25
<0 Коллектив авторов, 1997 УДК 618.1-006.04-097
Ю. II. Гусарова, О. В. Макаров, В. II. Косецкий,
С. С. Кирзой, T. II. Ткачева, Т. П. Вавилова
ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ДНК-ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ЯДЕР ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ОНКОГИНЕКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
Российский государственный медицинский университет
Нарушение противоопухолевого иммунитета является одним из ведущих патогенетических факторов в развитии онкогинекологических заболеваний. При данных заболеваниях выявлены количественные изменения клеток иммунной системы и нарушения их функциональных свойств [4], которые тесно связаны с состоянием генетического аппарата лимфоцитов. В связи с изложенным представляет интерес исследование активности эндонуклеаз — ферментов, принимающих участие в реализации различных генетических процессов. Основным ферментом нуклеазного комплекса лимфоцитов является Ca/Mg-зависимая эндонуклеаза (СМЕ) [5]. Активность этого фермента не исследована при данных патологиях, но ранее было выявлено резкое снижение уровня его активности при лимфопролиферативных заболеваниях [1]. Полученные данные были положены в основу критериев ранней и дифференциальной диагностики опухолей иммунной системы [2].
Целью настоящей работы было исследование активности СМЕ изолированных клеточных ядер иммуно-компетентных клеток периферической крови у женщин с различными неоплазиями репродуктивной системы и выяснение возможного значения данного параметра для диагностики и контроля терапии онкогинекологических заболеваний.
Материалы п методы. Всего обследована 61 женщина, 17 из которых не имели гинекологической патологии и составили контрольную группу. У 44 больных были различные опухолевые заболевания репродуктивной системы (см. таблицу).
Исследовали монопуклеарные клетки периферической крови, получаемые методом центрифугирования в одноступенчатом градиенте фпколла — верографнна [6]. Затем клеточные ядра выделяли в градиенте плотности сахарозы. Аутолпз хроматина проводили в условиях активации СМЕ [1]. Об активности фермента судили по результатам электрофореза ДНК. Негативы электрофореграмм сканировали и по денептограммам измеряли интенсивность СМЕ, которую выражали в условных единицах. Подсчитывали также количество лимфоцитов. Достоверность различии между сравниваемыми группами оценивали по критерию Стыодепта. Для выявления корреляции между выборками проводили регрессионный анализ (линейная модель), рассчитывали коэффициент корреляции п /-критерий.
Результаты. В исследованных пробах крови 17 женщин контрольной группы, 8 из которых находились в репродуктивном возрасте (от 20 до 45 лет) и 9 женщин — в пре- и постменопаузальном периоде (старше 46 лет), активность фермента не различалась и составила в среднем 105 ± 11 уел. ед. Это значение вполне соответствует средним значениям активности СМЕ, полученным другими исследователями [3] (рис. 1, 2).
Исследования проб периферической крови 14 женщин с миомой матки (I группа) разного размера, ло-
Yu.N. Gusarova, O. V.Makarov, V.N.Koselsky,
S.S.Kirson, T.I. Tkacheva, T.P. Vavilova
CHANGES IN LYMPHOCYTE NUCLEAR DNA ENDONUCLEASE ACTIVITY IN GYNECOLOGY MALIGNANCIES
Russian State Medical University
Impairment of antitumor immunity is a leading factor of development of gynecology malignancies. Patients with such diseases present with quantitative changes in and impairment of functional properties of immunity cells [4] closely related to lymphocyte genetic status. Therefore it is interesting to study activity of endonucleases, i.e. enzymes contributing to various genetic processes. Ca/Mg-dependant endonuclease (CME) is a main enzyme of the lymphocyte nuclease complex [5]. This enzyme activity was not studied in the pathology in question though there were reports of a sharp fall in its activity in patients with lymphoproliferative diseases
[1]. These findings were a basis for criteria of early and differentiation diagnosis of tumors of the immune system [2].
The purpose of this study was to analyze CME activity in isolated peripheral immunocompetent cell nuclei from patients with various neoplasms of the reproductive system and evaluation of this parameter in diagnosis and therapy monitoring in gynecology malignancies.
Materials and Methods. The study was performed in 61 women, of whom 17 had no gynecology pathology and composed a control group. The remaining 44 women had various neoplastic diseases of the reproductive system (see the table).
Peripheral blood mononuclears were derived by centrifugation in one-step ficoll-verographin gradient [6]. Then the cell nuclei were isolated in the saccharose density gradient. Chromatin autolysis was effected under CME activation [1]. The enzyme activity was assessed by DNA electrophoresis. Electrophoregram negatives were scanned to evaluate CME activity by the resultant densitograms, the CME activity was expressed in conventional units. Lymphocyte count was also performed. Analysis of differences between groups compared was performed by Student's test. Correlations between the samples were detected by means of regression analysis (linear model), correlation coefficients and /-test values were calculated.
Results. Blood specimens from the 17 controls of whom 8 were at reproductive age (20 to 45 years) and 9 in pre- or postmenopause (above 46 years) presented with no difference in the enzyme activity (mean 105+11 conv.units). This value is in agreement with CME activity levels reported in the literature [3] (figs. 1,2).
Study of peripheral blood from 14 patients with myoma of the uterus (group I) of various size, site and growth rate, and from 9 patients with cystadenoma (group II) of one or two ovaries showed that mean enzyme activity values were falling within normal limits or were above the higher limit of the benign lesions mentioned. The activity was 137.3+17.4 conv.units in
калпзацпн, скорости роста и 9 женщин с цистаденомоп (II группа) одного или двух яичников показали, что при этих доброкачественных опухолях в среднем активность фермента сохранялась в пределах нормальных значений пли превышала их. Она составила 137,3 ± 17,4 уел. ед. при миоме матки и 105,6 ±20,3 уел. ед. при цис-таденомах яичников (см. рис. 1). Следует отметить, что при миоме матки определялись значительные колебания активности СМЕ: от 50 до 240 уел. ед. Однако при корреляционном анализе нами не выявлено зависимости между активностью СМЕ и клиническими параметрами: размером опухоли (л = - 0,25), абсолютным количеством лимфоцитов (/• = 0,05), возрастом (г = - 0,46). У больных с доброкачественными опухолями яичников активности СМЕ колебались от 33 до 192 уел. ед. Проведенный корреляционный анализ также не определил зависимости между исследуемым параметром и возрастом больных (/• = 0,075), а также абсолютным количеством лимфоцитов в периферической крови (г - 0,52).
У 6 женщин был рак эндометрия (III группа) и у 9 рак яичников (аденокарцинома; IV группа). У всех пациенток III группы определен первый патогенетический вариант, т. е. заболевание сопровождалось нейроэндокринными расстройствами. У женщин этой группы активность эндонуклеазы была снижена в 4 раза по сравнению с контрольным уровнем (26,5 ±10,1 уел. ед) и у половины обследованных не превышала 7 уел. ед.
Больные IV группы были разделены по клиническому течению на две подгруппы: с асцитом и без него. У всех больных с асцитной формой рака яичников определялась низкая активность фермента, которая составила 23,6 ±3,1 уел. ед., у больных без асцита активность эндонуклеазы была повышена в среднем в 2 раза по сравнению с нормальным уровнем (202,3 ±26,1 уел. ед.) (см. рис. 1, 2). При анализе корреляции между активностью эндонуклеазы и абсолютным количеством лимфоцитов периферической крови у больных с асцитной формой рака яичников была выявлена обратная зависимость, т. е. чем меньше количество лимфоцитов, тем больше активность фермента и наоборот (г = - 0, 84). Та же зависимость определялась при раке матки (г = - 0,76).
В отдельные группы (см. рис. 1) были выделены больные с фоновыми заболеваниями эндометрия, которые возникают на фоне нарушенных гипоталамо-ги-пофизарно-яичниковых взаимоотношений и рассматриваются как предраковые. У всех больных полипозом эндометрия также отмечалось резкое снижение активности фермента (28,6 ± 1,8 уел. ед.). Эти данные представляют интерес в плане дифференциальной диагностики переходных состояний, поскольку при гиперплазии эндометрия у всех обследованных сохранялась высокая активность СМЕ (132,3 ±38,4 уел. ед.) (см. рис. 1).
Одной из задач работы было исследование возможных изменении активности СМЕ в процессе лечения больных с онкогинекологичеекпмн заболеваниями. У трех больных раком яичников без асцита активность эндонуклеазы определялась до и после проведения операции. При этом исходно повышенная активность СМЕ
2501
200
150-
100 -
50-
/ II III IVa IVb V VI VII К
Рис. 1. Активность СМЕ лимфоцитов периферической крови у больных с доброкачественными, злокачественными опухолями и с предраковыми состояниями.
По горизонтали — группы обследованных.
/ — миома матки; II — доброкачественные опухоли яичников; III —рак эндометрия; IVa — рак яичников с асцитом; IV6 — рак яичников без асцита до операции; V— полипоз эндометрия; VI — гиперплазия эндометрия; VII — рак яичников без асцита после операции; К—контрольная группа.
По вертикали — активность СМЕ, уел. ед.
Fig. 1. Peripheral lymphocyte СМЕ activity in patients with benign, malignant tumors and premalignant lesions.
Numbers on the x axis show patient groups; numbers on the у axis show CME activity in conv.units.
I, myoma of the uterus; II, benign ovarian tumors; III, endometrial cancer; IVa, ascitic ovarian cancer; IVb, non-ascitic ovarian cancer before surgery; V, endometrial polyposis; VI, endometrial hyperplasia; VII, ascitic ovarian cancer after surgery; K, control.
myoma of the uterus and 105.6+20.3 conv.units in ovarian cystadenoma (see fig.7). Of note that the CME activity varied considerably in patients with myoma of the uterus from 50 to 240 conv.units. However, correlation analysis failed to discover relation of CME activity to disease clinical parameters: tumor size (r = - 0.25), lymphocyte count (r = 0.05), patients’ age (r = - 0.46). In patients with benign ovarian tumors CME activity was ranging from 33 to 192 conv.units. Correlation analysis also failed to discover relation between the parameter studied and patients’ age (/• = 0.075), peripheral lymphocyte count (r = 0.52).
There were 6 women with endometrial cancer (group
III) and 9 with ovarian cancer (adenocarcinoma; group
IV). All patients of group III were classified as the first pathogenetic type, i.e. disease accompanied with neuroendocrine abnormalities. In these patients endonuclease activity was reduced 4-fold as compared to the controls (26.5+10.1 conv.units) and was not more than 7 conv.units in half of the patients.
Patients of group IV were stratified into two subgroups with respect to disease clinical course, i.e. with
снижалась после оперативного вмешательства и составляла в среднем 64,6 ±17,6 уел. ед., что ниже средних ■значений пациенток контрольной группы (см. рис. 1).
Обсуждение. Возможность использования ДНК-фер-ментов в качестве маркеров злокачественной трансформации изучалась многими исследователями. В основном исследовали сыворотку, но не клетки крови. Так, активность сывороточной щелочной ДНКазы может быть тестом для мониторинга злокачественных лимфом [7]. Показаны изменения активности кислой и щелочной ДНКаз сыворотки крови при раке мочеполового тракта [9], карциноме и предраковых состояниях полости рта
[11]. В то же время исследования эндонуклеаз, подобных СМЕ, локализованных преимущественно в ядре клетки, могут дать важную информацию о функционировании генома лимфоцитов при развитии вторичного иммунодефицита на фоне опухоли.
Результаты проведенного исследования выявили значительные изменения уровня активности СМЕ по сравнению с контролем. У большей части больных со злокачественными опухолями определялось резкое снижение исследуемого параметра, что, возможно, отражало функциональный статус мононуклеарных клеток периферической крови. Об этом свидетельствует низкая активность СМЕ, регистрируемая у больных раком яичников с асцитом, и высокая активность СМЕ у больных с безасцитной формой рака яичников. Появление асцита у больных сопровождало генерализацию процесса и обширное метастазирование по брюшине. При этом сниженная активность СМЕ отражала глубокое угнетение иммунной системы. Напротив, повышенная активность СМЕ при безасцитной форме рака яичников могла рассматриваться как способность иммунной системы реагировать на иммортализованные клетки. Последующее снижение активности фермента в этой подгруппе больных на фоне хирургического лечения, возможно, было вызвано развитием вторичного послеоперационного иммунодефицита. Можно предположить, что активность СМЕ отражает функциональный статус клеток иммунной системы.
Наблюдаемый нами большой разброс значений активности СМЕ у больных раком эндометрия (от 0 до 66 уел. ед.), миомой матки (от 50 до 240 уел. ед.), цистаденомами яичников (от 33 до 192 уел. ед.) мог быть обусловлен особенностями клинического течения заболеваний, а именно нарушением питания миома-тозных узлов, распадом опухоли и гормональным статусом. С другой стороны, по современным представлениям [10], злокачественная трансформация клетки обусловлена нарушением информационно-генетическо-го гомеостаза (ИГГ). Одним из факторов, обеспечивающих ИГГ, являются ДНК-эндонуклеазы, которые участвуют в процессах программируемой клеточной гибели — апоптоза [8]. Поскольку основной нуклеазой клеточных ядер лимфоцитов является СМЕ, то наблюдаемые нами изменения активности этого фермента (как увеличение, так и снижение) могут являться отражением нарушения ИГГ в мононуклеарных клетках периферической крови больных и, может быть, одним из кри-
Рис. 2. Данные по электрофорезу ДНК в агарозном геле.
Дорожки 1, 2— здоровый донор, активность СМЕ в норме; 3,4 — больная с безасцитной формой рака яичников, активность СМЕ несколько повышена; 5, 6 — больная раком эндометрия, активность СМЕ снижена; 7,8 — больная с асцитной формой рака яичников, активность СМЕ снижена.
Дорожки 7, 3, 5, 7 — ДНК ядер лимфоцитов до активации эндогенной СМЕ, 2, 4, 6, 8 — после инкубации в условиях активации эндогенной СМЕ.
Fig. 2. DNA agarose gel electrophoresis findings
Tracks 1,2, a healthy donor, normal CME activity; 3,4, a patient with non-ascitic ovarian cancer, slightly elevated CME activity; 5,6, a patient with endometrial cancer, decreased CME activity, 7,8, a patient with ascitic ovarian cancer, decreased CME activity. Tracks 1,3,5,7, lymphocyte nuclear DNA before endogenous CME activation; 2,4,6,8, after incubation under endogenous CME activation.
and without ascites. All the patients with ascites presented with low enzyme activity 23.6+3.1 conv.units, in the patients free from ascites endonuclease activity was reduced about-two-fold as compared to the normal level (202.3+26.1 conv.units) (see figs.7,2). Correlation analysis of endonuclease activity and peripheral lymphocyte count in patients with ascitic ovarian cancer discovered inverse dependance: the less the lymphocyte count the higher the enzyme activity and vice versa (r = - 0.84). The same correlation was found in patients with uterine cancer (r = - 0.76).
Individual groups (see fig.7) were composed of patients with endometrial lesions developing against the background of impairment of hypothalamus-pituitary-ovary interactions and considered preneoplastic. All patients with endometrial polyposis also presented with decreased enzyme activity (28.6+1.8 conv.units). These findings are of much interest for differential diagnosis of transitional conditions as all patients with endometrial hyperplasia exhibited high CME activity (l 32.3+38.4 conv.units) (see fig. I).
We attempted to study whether CME activity can change in the course of treatment of patients with gynecology malignancies. We measured endonuclease activity before and after surgery in three patients with ascites-free ovarian carcinoma. The CME activity elevated at baseline reduced after surgery to 64.6±l7.6
Таблиц л Table
Характеристика обследованных больных Patients’ characteristics
Диагноз Число обследованных больных Возраст, годы
Миома матки Myoma of the uterus 14 37—60
Доброкачественные опухоли яичников Benign ovarian tumors 9 31—68
Рак эндометрия Endometrial cancer 6 55—62
Рак яичников Ovarian cancer 9 46—72
Полипоз эндометрия Endometrial polyposis 3 46—57
Гиперплазия эндометрия Endometrial hyperplasia 3 49—59
Контрольная группа Controls 17 20—68
Diagnosis No. of cases Years of age
терпев оценки функционального состояния лимфоцитов при лечении злокачественных новообразований.
Снижение активности фермента при полипозе эндометрия и отсутствие изменений активности СМЕ при гиперплазиях эндометрия позволяет предположить, что определение активности СМЕ может использоваться в комплексе диагностики злокачественных новообразований и дифференциальной диагностики переходных состояний.
ЛИТЕРА ТУРА / REFERENCES
1. Кирзон С. С., Вотрин И. И., Ходарев H. H., Ткачева Т. И. //Бгалл. экспер. биол.— 1990.—№ 6. — С. 543—546.
2. Кирзон С. С., Вотрин И. И., Ходарев H. Н. и др. Способ диагностики злокачественных лимфопролиферативных заболевании. //А. с. № 1607572 от 15 июля 1990 г.
3. Kupjou С. С., Вавилова Л. М., Ткачева Т. II. п др. //Иммунология. — 1994.—№ 6. — С. 34—36.
4. Хашукоева А. 3., Головастиков И. II., Макаров О. В. I/ Иммунологические проблемы в акушерстве и гинекологии. — М.,
1981. —Т. CLXI. Сер. Хирургия. — Вып. 34.—С. 101 —105.
5. Ходирев Н. Я., Соколова И. А., Александрова С. С. и др. //Бголл. экспер. биол.— 1987. — № 3. — С. 312—314.
6. Bown A. //Scand. J. clin. Invest.— 1968. — Vol. 21, Suppl. 97. — P. 2—126.
7. ЕснпотШои-КигаоцЬи A., Laus M., Taper II. S. et al. //Cancer. — 1988.— Vol. 61, N 9.— P. 1838—1843.
8. Сапе K., Salmaan H., Jnayul-IIusum et al. II FEBS Letters. — 1994. — Vol. 349.— P. 385—391.
9. Lucourinas M., Constanlinidus C.. Spantidos A. et al. //Urol. Res. —
1982.— Vol. 10.— P. 67—70.
10. Modrich P. //Science. — 1994. — Vol. 266. — P. 1959—1960.
11. Scully P., Spandidos D. A., \Van«-Booth P. ct al. //Biomed. exp. — 1981, —Vol. 35.— P. 179—180.
Поступила 05.03.97 / Submitted 05.03.97
conv.units on the average, i.e. was less than the control values (see fig./).
Discussion. The possibility to use DNA enzymes as markers of malignant transformation was studied by many investigators, who mainly analyzed serum rather than blood cells. For instance serum alkaline DNAase may be a test for monitoring of malignant lymphomas [7]. Serum acidic and alkaline DNAase was shown to reduce in cancer of the genitourinary tract [9], oral cancer and premalignant lesions [11]. However, study of endonucleases (like CME) located mainly in cellular nuclei may provide important information about lymphocyte genome functioning during development of secondary immunity deficiency in neoplastic diseases.
Our study discovered significant differences in CME activity as compared with the control. Most patients with malignant tumors presented with a considerable fall in the enzyme, which was probably a reflection of peripheral blood mononuclears. The low CME activity in ascitic and the high CME activity in non-ascitic ovarian cancer support this supposition. The appearance of ascites was observed in parallel with disease generalization and peritoneal metastasis. The decreased CME activity in these cases reflected the patients’ deep immunity suppression. While the elevated CME activity in non-ascitic ovarian cancer may be evidence of the immunity ability to react on immortalized cells. The enzyme reduction after surgery in this group of patients might be due to secondary postoperative immunodeficiency. The supposition may be made that CME activity reflects functional status of immunity cells.
The large variability of CME values in patients with endometrial cancer (0-66 conv.units), myoma of the uterus (50-240 conv.units), ovarian cystadenocarcinoma (33-192 conv.units) might be due to disease clinical features, namely to disorder of nutrition of myoma nodes, tumor decay and hormonal status. On the other hand, according to the modern concepts [10] it is impairment of informational genetic homeostasis (IGH) that accounts for cell malignant transformation. DNA endonucleases that participate in the apoptosis, i.e. programmed cell death mechanisms [8], are factors responsible for the IGH. Since CME is the principal nuclease of lymphocyte nuclei, the changes in the enzyme activity (both elevation and fall) may be a reflection of IGH impairment in peripheral mononuclears and can thus be useful in evaluation of lymphocyte functioning in treatment of malignant lesions.
The reduction in the enzyme activity in endometrial polyposis and the absence of changes in CME activity in endometrial hyperplasia suggest that CME measurement may be used in diagnosis of malignant neoplasms and differential diagnosis of transitional states.
