История выходa на мировую арену актинофага phiC31 и актиномицета Streptomyces lividans 66 Текст научной статьи по специальности «История и археология»

Simunek M.V., Hoßfeld U., Wissemann V. (2011b) "'Rediscovery' revised — the cooperation of Erich and Armin von Tschermak-Seysenegg in the context of the 'rediscovery' of Mendel's laws in 1899— 1901", Plant Biology, vol. 13, no. 6, pp. 835-841.

Stern C., Sherwood E. (eds.) ( 1956) The Origin of Genetics. A Mendel Source Book, San Francisco: W.H. Freeman.

Stern C., Sherwood E. ( 1978 ) "A note on the 'three redise overers' of Mendelism", Folia Mendeliana, vol. 13, pp. 237-240.

Tschermak E. v. (1903) "Die Lehre von den formbildenden Faktoren (Variation, Selektion, Mutation, Kreuzung) und ihre Bedeutung für die 'rationelle' Pflanzenzüchtung", Jahrbuch der landwirtschaftlichen Pflanzen- und Tierzüchtung, Bd. 1, H. 3, S. 30—45.

Tschermak E. v. (1908) "Der moderne Stand des Vererbungsproblems", Archiv fiir Rassen- und Gesellschaftsbiologie, Bd. 5, H. 3, S. 307-326.

Tschermak E. v. (1913) "Examen de la theorie des facteurs par la recordisement méthodique des hybrides", in: Vilmorin P., de (ed.): IVe ¡conference international de génétique, Paris, 1911. Comptes rendus rapports, Paris: Masson, pp. 91—95.

Пересмотр "переоткрытия" законов Менделя. Важность Арминафон Чермака-Сейсенегга (1870-1952) —

основной доклад

Михаль Шимунек1, Георгий Левит2 УвеХоссфелд3

1 Центр истории естествознания и гуманитарных наук/Институт современной истории, Академия наук Чешской Республики, Puskinovo nam. 9, CZ-16000 Прага, Чехия;

simunekm@centrum.cz 2 Университет ИТМО, ул. Чайковского. 11, 191187 Санкт-Петербург, Россия; georgelevit@gmx. net; gslevit@c orp. ifmo.ru 3 РГ Биологического образования, Йенский университет имени Фридриха Шиллера, Am Steiger 3, Bienenhaus, 07743 Йена, Германия; uwe.hossfeld@uni-jena.de

Так называемое «повторное открытие» работы Менделя в 1900 году считается поворотным моментом как в истории биологии, так и в генетике как новой и прогрессивной дисциплине. Эта статья даёт новый взгляд на события 1900 и 1901 гг. Она основана на оценке частной переписки между братьями Эрихом и Армином фон Чермак-Сейсенегг, которая оставалась неизвестной в течение многих десятилетий.

Ключевые слова: законы Менделя, "переоткрытие", классическая генетика, ЧермакЕ., ЧермакА.

ВОСПОМИНАНИЯ И ИНТЕРВЬЮ

История выхода на мировую арену актинофага phiC 31 и актиномицета Streptomyces lividans бб

Н.Д. Ломовская

доктор биологических наук, профессор, Калифорния, США; lomovskayan@gmail.com

Актиномицеты рода Streptomyces образуют большинство антибиотиков и других биологически активных веществ. Актинофаг phiC31 был изолирован в 1968 году в лаборатории генетики актиномицетов и актинофагов в институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов в Москве. Там же в течение более чем 20 лет проводилось его генетическое и молекулярно-генетическое изучение. Построение подробных генетических и физических карт генома phiC 31 позволило приступить к конструированию на его основе векторных молекул. Штамм Streptomyces lividans 66 оказался самым оптимальным реципиентом изолированной ДНК и используется в этом качестве во всех лабораториях мира, работающих с актиномицетами. В работах сотрудников института Д. Иннеса (Англия) и в работах лаборатории под руководством автора этих строк были получены фаговые векторы различного назначения, которые в дальнейшем использовались для идентификации генов антибиотикообразования в штаммах — продуцентах антибиотиков.

Ключевые слова: актинофаг phiC31, Streptomyces lividans 66, Streptomyces coelicolor АЗ(2), интеграза phiC31, система Pgl.

Посвящаю эту работу памяти Coca Исааковича Али-ханяна, заслуги которого в области микробной генетики и, в частности, генетики и селекции актиномицетов, образующих антибиотики, были широко известны мировой научной общественности. В 2016 году исполнилось сто десять лет со дня его рождения. Кроме С. И. Алиханяна, посвящаю эти воспоминания моим друзьям и коллегам из лаборатории генетики актиномицетов и актинофагов московского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов, а также памяти моего мужа Л.М. Фонштейна, внесшего волею судьбы свой значительный вклад в использованиеphiC31 фаговых векторов для идентификации и изучения функций генов антибиотикообразования у актиномицетов.

Я получила образование на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, и по окончании еёв 1958 г. меня взял в свою лабораторию селекции промышленных микроорганизмов Сое Исаакович Алиханян. С биолого-почвенного факультета МГУ он был уволен ещё после сессии ВАСХНИЛ в 1948 г. Ему вскоре удалось устроиться во Всесоюзный научно-исследовательский институт пенициллина и других антибиотиков Минздрава СССР (впоследствии ВНИИ антибиотиков).

Страна катастрофически нуждалась в налаживании производства отечественных антибиотиков, образуемых микроорганизмами, актиномицетами и грибами. Рентабельное производство антибиотиков могло функционировать лишь в случае увеличения продуктивности природных штаммов в десятки и более раз. Это могло быть осуществлено только в результате обработки низкопродуктивных штаммов мутагенами и использования методов классической генетики. Поэтому работы в лаборатории в годы засилья лысенковской идеологии велись практически подпольно. Благодаря интенсивной, трудоёмкой и квалифицированной работе лаборатории С.И. Алиханяна на антибиотические заводы внедрялись высокопродуктивные продуценты антибиотиков. Только отдельные сотрудники в лаборатории С.И. Алиханяна успели получить настоящее генетическое образование. Это генетик Софья Юльевна Гольдат, Софья Захаровна Миндлин, которая успела закончить кафедру генетики МГУ в 1948 г. и её сокурсница С.И. Любинская. Все остальные сотрудники лаборатории, не получив генетического образования, на ходу осваивали методы классической генетики и генетического изучения микробных объектов.

В конце 1940-х и все 1950-е гг. генетика микроорганизмов за рубежом развивалась стремительными темпами. Трудно перечислить все открытия в области генетики бактерий и их вирусов — бактериофагов, да я и не ставлю перед собой такой задачи. Все в лаборатории Алиханяна были в курсе открытий в области микробной генетики, несмотря на то что селекционная работа требовала больших физических усилий по отбору редких мутантов среди тысяч проверенных на активность вариантов. С большой нагрузкой работали лаборанты, засевая пробирки и колбы с приготовленной питательной средой и определяя антибиотическую активность культур. Алиханян умел подбирать кадры и на долгие годы заразить их своей поразительной научной энергией. Те, кто не выдерживал, тихо уходили. Все разговоры в лаборатории всегда и без исключения переходят на личность, и эта личность — Сое Исаакович. Позже многие из сотрудников лаборатории, в том числе и я, перейдут вместе с Сосом Исааковичем в его сектор генетики и селекции микроорганизмов радиобиологического отдела Института атомной энергии, а потом и в организованный по его инициативе в 1968 г. ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Радиобиологический отдел в Институте атомной энергии (РБО ИАЭ) был основан по инициативе И.В. Курчатова в середине 1958 г. В этот отдел были приглашены известные учёные различных специальностей, изучавшие проблемы радиобиологии, структуру и функции молекул ДНК, а также генетики С.И. Алиханян, Н.И. Шапиро, Р.Б. Хесин. Будучи под защитой физиков ИАЭ, они могли использовать для своих исследований методы классической генетики, не опасаясь гонений со стороны ещё имевших в эти годы влияние лысенковцев.

Проблемы вирусной инфекции продуцентов антибиотиков

Меня определили в помощницы к Тамилле Сергеевне Ильиной, которая не занималась селекцией, а уже много лет изучала взаимоотношения актиномицетов рода Х1гер1отусе.ч с актинофагами, вирусами, размножающимися в клетках актиномицетов и вызывающими их гибель (лизис). Буквально через неделю после моего прихода в лабораторию Сое Исаакович быстро поручил мне отреферировать на семинаре знаменитую статью А. Львова, описывающую концепцию лизогении у бактерий. Андре Мишель Львов — нобелевский лауреат по физиологии и медицине 1965 г. Иностранные научные журналы уже публиковали сотни статей по генетическому изучению вирулентных и умеренных бактериофагов. Модельными объектами вирулентных фагов были фаги Т-серии, а умеренных, главным образом, фаг лямбда. Вирулентные фаги имели один путь развития в бактериальной клетке — её лизис и образование многочисленного потомства фаговых частиц. Умеренные бактериофаги, в зависимости от физиологического состояния бактериальной клетки, либо были способны осуществлять вирулентный путь развития, либо инфекция приводила к установлению лизогенного состояния. В этом случае фаг не убивал клетку, а его геном, как правило, встраивался в бактериальную хромосому. В редких клетках такой лизогенной популяции геном фага самопроизвольно вырезался из хромосомы и убивал клетку с образованием фагового потомства. Я с первого взгляда влюбилась в поведение умеренных бактериофагов и все последующие годы старалась следить за успехами в этой области исследований.

Работа с актинофагами имела большое прикладное значение. Заводы по производству антибиотиков в нашей стране часто страдали от фаговой инфекции, возникающей в многотоннажных ферментерах, в которых выращивались актиномицеты. Каждый такой ферментер содержал тонны дорогостоящей питательной среды. Ферментация заканчивалась образованием антибиотика, который выделяли с помощью химической очистки. В результате инфекции актинофагами актиномицеты в таком ферментере гибли, не образуя антибиотика. Производство несло большие материальные потери.

В лаборатории Алиханяна стали заниматься получением актиномицетов, устойчивых к фаговой инфекции. Задача требовала детального изучения взаимоотношений актиномицетов с актинофагами. Две сложные проблемы возникали при промышленном использовании устойчивых к фагам актиномицетов. Во-первых, как правило, они образовывали значительно меньшее количество антибиотика. Это совершенно не устраивало производство, которому постоянно спускали сверху планы по увеличению антибиотической продукции. Во-вторых, при использовании устойчивых к фагу актиномицетов сразу находились фаги, преодолевающие их устойчивость, и все начиналось сначала. Для меня было совершенно очевидно, что актинофаги попадают в ферментеры извне в результате дефектов в их конструкции. Однако среди опытных заводских специалистов и ряда учёных в академических институтах существовало мнение, что инфекцию вызывает фаг, присутствующий внутри лизогенной актиномицетной клетки. Это позволяло дезавуировать основную причину фаголизиса, несовершенство заводского оборудования.

Успехи при получении высокопродуктивного и устойчивого к большому числу актинофагов продуцента стрептотрицина были впоследствии достигнуты в совместной работе лаборатории генетики актиномицетов и актинофагов (зав. лабораторией Н.Д. Ломовская) с лабораторией селекции продуцентов антибиотиков (заведующий лабораторией В. Г. Жданов). Этот штамм в течение долгих лет использовался в качестве промышленного продуцента.

Как это ни парадоксально, но проблемы фаголизиса при производстве антибиотиков стимулировали генетические исследования актинофагов в лаборатории С.И. Али-ханяна. Это позволило в дальнейшем использовать актинофаги как дополнительный инструмент при генетическом изучении самих актиномицетов, учитывая, какую существенную роль уже тогда играли бактериофаги в генетическом изучении бактерий.

В середине 1950-х годов стали проводиться фундаментальные исследования по генетике актиномицетов на штамме, который не использовался в качестве промышленного продуцента, а образовывал красивый синий пигмент. Эти исследования были настолько эффективными и результативными, что штамм Streptomyces coelicolor А3(2) стал модельным объектом генетики актиномицетов. Трудно переоценить роль этих исследований в практике использования актиномицетов в качестве промышленных продуцентов. У истоков генетического изучения модельного штамма актиномицетов стояли итальянский учёный Джузеппе Сермонти и английский учёный Дэвид Хопвуд. Д. Хопвуд впоследствии в течение десятилетий возглавлял большой отдел генетики в Институте Джона Иннеса (г. Норидж, Англия). За свои научные заслуги он, помимо научных званий, получил звание сэра из рук английской королевы. В Англии ценят своих героев.

С обоими этими учёными, и с Д. Хопвудом, и с Д. Сермонти, С.И. Алиханян поддерживал тесные контакты, умудряясь это осуществлять в эпоху «железного занавеса». В свою очередь они по заслугам оценивали вклад, который вносила лаборатория С.И. Алиханяна в генетическое изучение актиномицетов и создание основ селекции актиномицетов. Достаточно сказать, что наличие генетической рекомбинации у актиномицетов было практически одновременно продемонстрировано супругами Сермонти (в 1955 г.), С.И. Алиханяном и С.З. Миндлин (в 1957 г.), Д. Брэндлом и В. Шибальским (в 1957 г.), Д.А. Хопвудом (в 1957 г.). Потом Д.А. Хопвуд в генетических исследованиях на модельном штамме обогнал всех своих коллег.

Первоначальный этап моей работы завершился публикацией в английском журнале "Nature" статьи «Трансдукция у актиномицетов» (Alikhanian, Ilyina, Lomovskaya, 1960). В статье были впервые приведены доказательства наличия у актиномицетов феномена трансдукции, то есть переноса генов актиномицета с помощью фага. Следует учесть, что феномены общей и специализированной трансдукции на модельных бактериях к тому времени были открыты сравнительно недавно и продолжали интенсивно изучаться в конце 1950-х годов. Такчто мы шли по горячим следам. К сожалению, наша работа по трансдукции не имела продолжения ввиду слабой генетической изученности как актинофага, так и актиномицета — объекта трансдукции. Правда, даже сейчас, по прошествии многих лет, в литературе можно найти упоминания об этой работе.

Ввиду ограниченности объёма воспоминаний я не могу останавливаться на описании почти необъятной деятельности, которую предпринял Сое Исаакович Алиханян по переводу на русский язык и изданию в СССР книг зарубежных авторов, подводящих итоги работ по микробной генетике. Я не знаю, какой энергией надо было обладать, чтобы пробивать издание этих книг ещё в годы засилья в биологической науке лысенковской идеологии. Они сокращали пробел в генетическом образовании, по крайней мере, двух поколений учёных, работавших в Советском Союзе. Тяжёлый труд переводчиков этих изданий выполняли, главным образом, высококвалифицированные сотрудники лабораторий С.И. Алиханяна и Р.Б. Хесина, которые совмещали его с напряжённой экспериментальной работой.

Редкая удача — неожиданное продвижение по службе молодых научных сотрудников

При переходе С.И. Алиханяна в РБО Института атомной энергии в 1958 г. тематика его лаборатории кардинально изменилась. Селекционеры, главным образом, включились в получение высокопродуктивных бактериальных продуцентов я ми но кислот. Генетики стали работать с модельными микроорганизмами, бактериями и бактериофагами, более генетически изученными, чем актиномицеты и актинофаги. После защиты кандидатской диссертации в 1965 г. я стала работать с Александром Николаевичем Майсуряном по изучению мутаций бактериофага Т 4. Этот период работы явился для меня школой получения количественных оценок процесса инфекции бактериофагами как основы генетических экспериментов.

Во второй половине 1968 г. наш сектор усилиями С. И. Алиханяна был преобразован в Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ВНИИ генетика) при Министерстве микробиологической промышленности СССР. Несмотря на то, что этот институт, директором и организатором которого был С.И. Алиханян (рис. 1), принадлежал отраслевому министерству, в верхах было оговорено наличие в его составе, наряду с селекционными подразделениями, теоретических лабораторий, где бы разрабатывались генетические основы селекции. Соединение теории и практики в одном учреждении было своего рода уникальной ситуацией — и не только по нашим отечественным меркам.

Рис. 1. Сое Исаакович Алиханян в своём рабочем кабинете Fig. 1. Sos Isaakovitch Alikhanian in his study, early 1980s.

В постановлении планировалось и строительство нового здания института в Москве. В начале 1970-х гг. институту предоставили здание, построенное по стандартному школьному проекту, расположенное в глубине промышленной зоны на Варшавском шоссе. От Варшавского шоссе к институту вела плохая, разбитая грузовиками дорога. Утром и вечером сотрудников по ней привозил и отвозил к общественному транспорту институтский автобус. В другое время дня приходилось добираться до работы часто по грязи и в сопровождении бродячих собак. Строительство нового здания института оказалось долгостроем. Даже стыдно сказать, что въехали в него только в 1986 г., через 18 лет после образования института.

Неожиданностью для меня было предложение Coca Исааковича возглавить лабораторию, где объектами генетического изучения были бы актинофаги и актино-мицеты. Так мои коллеги и я — ученики Coca Исааковича — стали руководителями лабораторий, развивающих разные направления микробной генетики и селекции. Это В.В. Суходолец, В.Н. Крылов, А.И. Степанов, В.Г. Жданов, Н.И. Жданова, Л.И. Еро-хина, А.Н. Майсурян, З.М. Зайцева, Е.С. Морозова. Заведовать генетическими лабораториями были также приглашены A.A. Прозоров, Г.И. Наумов, P.P. Азизбекян, В.И. Корогодин, A.C. Кривиский и другие. Другие лаборатории возглавили химики, биохимики, физики, В.Г. Дебабов, В.М. Степанов, В.И. Пермогоров... Большую когорту в институте составило и следующее поколение молодых учёных. Они активно включились в развитие работ по биотехнологии и создание высокопродуктивных продуцентов биологически активных веществ методами генной инженерии.

Актиномицеты и актинофаги на протяжении многих лет были главными объектами генетического изучения и практической селекции в большой лаборатории С.И. Али-ханяна. При организации института генетическое изучение актинофагов и актино-мицетов сосредоточилось в одной лаборатории, а объектами практической селекции актиномицеты стали в лаборатории В.Г. Жданова. И так случилось, что в эти и последующие годы наша лаборатория практически оставалась единственной в СССР, где объектами генетики были только актинофаги и актиномицеты.

В мае 1968 г. С.И. Алиханян и С.З. Миндлин участвовали в международной конференции по генетике и селекции стрептомицетов — актиномицетов рода Streptomyces — в Югославии. Там Сое Исаакович впервые лично познакомился с Дэвидом Хопвудом. На этой конференции по инициативе учёных из Чехословакии было решено основать международный симпозиум по генетике промышленных микроорганизмов (GIM) с периодичностью один раз в 4 года. Первый GIM-симпозиум состоялся в Праге в 1970 году. С тех пор эта традиция сохраняется вот уже более 40 лет.

Выбор объектов изучения в лаборатории генетики актиномицетов и актинофагов

Хочу немного рассказать про организованную в нашем институте лабораторию генетики актинофагов и актиномицетов, которой я руководила почти в течение 25 лет вплоть до отъезда в Америку.

Как я уже упоминала, с середины 50-х годов модельным объектом генетики актиномицетов стал штамм Х1гер1отусе.ч соеНсо1ог А3(2). По признанию Д. Хопвуда, он в то время не рассматривал в качестве объекта генетического изучения штаммы Б^ер^тусез, образующие уже известные антибиотики. В 1960-е и 1970-е гг. были сделаны кардинальные открытия в генетике актиномицетов с использованием штамма соеНсо1ог А3(2). При выборе объекта нашего исследования, конечно, заманчивой была идея использовать в качестве хозяина актинофага активно изучаемый генетически актиномицет. Предыдущие попытки выделения актинофага, действующего на штамм соеНсо1ог А3(2), были практически безуспешными. Выделять такие актинофаги всегда пытались из почвенных проб. Задача усложнялась тем, что мы хотели иметь в своих руках умеренный фаг, способный не только лизировать, но и лизогени-зировать актиномицетный штамм-хозяин.

Начиная с 1929 г. классификацией и систематикой актиномицетов в нашей стране занимались в лаборатории H.A. Красильникова в Институте микробиологии АН СССР и на кафедре биологии почв биолого-почвенного факультета МГУ, которую он основал и был её заведующим с 1953 по 1973 г. Среди большой коллекции актиномицетов, охарактеризованных под руководством H.A. Красильникова, была группа «синих актиномицетов», к которой принадлежал и штамм S. coelicolor А3(2). Эта группа была изолирована из почв Казахстана и охарактеризована М.Х. Шигаевой. Видовые характеристики этих штаммов были подробно описаны в книге H.A. Красильникова1.

В 1968 г. коллекция «синих актиномицетов» из почти сотни штаммов оказалась бесхозной, и нам предложили забрать её к себе. Это был подарок судьбы. Имея в руках такую коллекцию штаммов, родственных штамму S. coelicolor А3(2), можно было попытаться изолировать актинофаги, действующие на штамм S. coelicolor А3(2), не из почвенных проб, как это обычно делалось, а из возможных лизогенных штаммов этой коллекции.

Таков был план наших действий. Неожиданно фаг, действующий на коллекционный штамм S. lividans 66, был изолирован из жидкой культуры штамма S. coelicolor А(3)2. На сам штамм S. coelicolor А3(2) этот фаг не действовал. На индикаторном штамме S. lividans 66 фаг образовывал красивые большие мутные негативные колонии (бляшки). Вторичный рост внутри бляшек указывал на то, что изолированный фаг может быть умеренным. Но это предстояло ещё доказать. Очень скоро нам удалось изолировать варианты штамма S. coelicolor А3(2), чувствительные к фагу, который был назван phiC31. Так он под этим названием и существует до сих пор. Соавторами первой публикации2, характеризующей фаг phiC31, как умеренный актинофаг были Н.Д. Ломовская Н.М. Мкртумян и Н.Л. Гостимская. Хорошо помню, как я тогда в шутку сказала, что нам уже больше ничего не надо делать и все будут всё равно упоминать, что фаг phiC31, действующий на штамм S. coelicolor А3(2), был изолирован Н.Д. Ломовской и ее коллегами. Но впереди нас ждали долгие годы напряженной работы по молекулярно-генетическому изучению фага phiC31, взаимодействию этого и других актинофагов со штаммами актиномицетов. По морфологии phiC31 фаг был сходен с фагом лямбда. Он имел головку шириной 53 (54) нм, несокращающийся хвост шириной 5 (10) нм и длиной 100 (123) нм, на конце которого была базальная пластинка шириной 15 нм со шпилькой посередине. Она, по-видимому, используется для прикрепления фага к рецептору актиномицетной оболочки'.

Я послала письмо Д. Хопвуду с просьбой прислать генетически маркированные штаммы S. coelicolor А3(2) для локализации профага phiC31 на хромосоме этого штамма. Он немедленно откликнулся на нашу просьбу. В ответ попросил прислать ему фаг phiC31 и индикаторный штамм S. lividans 66. Конечно, мы могли бы потянуть с отправкой фага и штамма, но я предпочла этого не делать, несмотря на вероятность

1 Красилъников Н.А. Актиномицеты — антагонисты и антибиотические вещества. М.: Изд-во АН СССР, 1950. 304 с. (Krasirnikov, 1950). Список литературы к этой работе нами оставлен только один — латиницей (ред.).

2 Ломовская Н.Д., Мкртумян Н.М., Гостимская Н.Л. Получение и свойства Streptomyces coelicolor бактериофага // Генетика. 1970. Т. 6. С. 135—137 (Tomovskaia et al., 1970).

3 Смирнова Е.Л., Новикова Н.Л. Внутриклеточный рост актинофага в штамме Streptomyces lividans лизогенном по температуроиндуцибельному мутанту // Микробиология. 1976. Т. 45. С. 531-534 (Smirnova, Novikova, 1976). (Наташа Гостимская сменила фамилию на Новикову.). См. также: Suares, Caso, Rodrigues, Hardisson, 1984.

сильной конкуренции с лабораторией, являющейся лидером в изучении генетики актиномицетов. Не хотелось оставаться в полной изоляции от мирового содружества учёных. Фаг и штамм были сразу посланы в отдел, возглавляемый Д.А. Хопвудом. Так началось наше многолетнее тесное сотрудничество с Д.А. Хопвудом и его коллегами. В ту пору актинофагами интересовался молодой сотрудник отдела Д.А. Хопвуда Кит Четер. Представляется, что в течение многих последующих лет сотрудники Д. Хопвуда, несмотря на наличие в их распоряжении нашего фага, всё-таки пытались изолировать свой собственный актинофаг, действующий на штамм S. coelicolor А3(2). Кроме того, работа с фагом требовала многолетнего опыта, который имелся у нас.

В течение всех 70-х годов основные усилия нашей лаборатории были направлены на генетическое изучение актинофага phi С31 и его взаимоотношений с актиномице-тами. На этом пути нас ожидали очень большие методические трудности, которые приходилось преодолевать на каждом шагу. Они были связаны со сложным жизненным циклом хозяев фага — актиномицетов, проходящих в своём развитии несколько стадий дифференциации, споруляции, образования при прорастании спор многоклеточного мицелия с последующим образованием в нём спор. Однако, в конце концов, удалось получить количественные оценки процесса инфекции, подробно охарактеризовать фаг phiC31 как умеренный фаг, количественно оценить частоту лизогенизации и индукции профага лизогенными штаммами.

Актинофаг рМС31 — главный объект генетического и молекулярно-генетического изучения актинофагов

Стремительно развивающаяся генетика и молекулярная биология бактерий уже продемонстрировала, какую важную роль играют бактериофаги (главным образом, умеренные) в изучении модельных бактериальных штаммов. При этом совершенно необходимым этапом являлось генетическое изучение самих бактериофагов, о котором уже были опубликованы большие обзоры и целые книги. АктинофагрЫСЗ 1 мог бы сыграть такую же важную роль в изучении актиномицетов. Как уже упоминалось, первые данные по изоляции и изучению фага рЫС31 были получены Норой Манвеловной Мкртумян, Натальей Львовной Гостимской и мной. Мы с Норой Манвеловной были первыми сотрудниками нашей лаборатории и проработали вместе с 1968 по 1992 г. вплоть до моего отъезда в Америку. В 1970-е гг. она опубликовала не менее десятка работ, посвященных генетическому изучению актинофага рЫС31. Кроме того, она была прекрасным профессиональным переводчиком с русского на английский, что было редкостью. Норины переводческие способности необычайно способствовали появлению наших статей в англоязычных журналах в Америке и Англии.

Почти одновременно с Норой Манвеловной в лабораторию пришли Наталия Львовна Гостимская и чуть позже Лидия Константиновна Емельянова, Татьяна Александровна Чиненова, Татьяна Александровна Воейкова, все молодые выпускники Московского университета, Валерий Иосифович Звенигородский, а также дипломник кафедры генетики МГУ Валерий Николаевич Даниленко. С ними мы проработали в лаборатории долгие годы. Всех сотрудников моей лаборатории я называла по именам и, конечно, на «вы». Они все, кроме Норы, были значительно моложе меня. На «ты» мы были только с Норой.

Нашими первоочередными задачами по генетическому изучению фага рЫС31 было получение количественных параметров инфекции чувствительных к актинофагу вариантов штамма соеНсо1ог А3(2) и индикаторного штамма Иу'икшн 66 в одноступенчатом цикле развития фага (ОЦР). Получение количественных оценок в опытах ОЦР является основой всех генетических экспериментов. Несинхронное прорастанием спор актиномицетов затрудняло определение стадии развития актиномицетного штамма, чувствительной в фаговой инфекции.

Наташей Гостимской и Таней Чиненовой были изолированы с-мутанты акти-нофага рЫС31, не способные к поддержанию лизогенного состояния и образующие прозрачные бляшки в отличие от мутных, образуемых фагом дикого типа. Среди них были изолированы и ей-мутанты, которые являлись с-мутантами только при высокой температуре. Лизогены, содержащие в качестве профага ^-мутант, были использованы, в частности, как удобная модель для более точного определения стадии в развитии актиномицета, чувствительной к фаговой инфекции. В опытах по термоиндукции (краткая инкубация при высокой температуре) лизогенов, несущих в качестве профага с18-муг;ип , происходило более синхронное образование фагового потомства, чем при инфекции прорастающих спор. Эти эксперименты позволили показать, что продуктивная индукция фага у таких лизогенов происходит в спорах с короткими проростками. Эта же стадия оказалась и чувствительной к фаговой инфекции (Ыо\чко\';| с| а1., 19734).

В конце концов фаг рЫС31 был охарактеризован в количественном отношении как умеренный фаг, способный к лизису и лизогенизации. Были оценены число фаговых частиц, образующихся при лизисе одной инфицированной прорастающей споры, частота лизогенизации чувствительных штаммов, параметры спонтанного и индуцированного образования фага лизогенными культурами ([.отоухкяуя, Мкйшшап, Оовйтвкауа, ПапПепко, 1972; МкПигтап, Гото\8к;ш, 19725).

Представляется, что прежде такие количественные параметры процесса инфекции и образования фага лизогенными культурами не были известны ни для одного из изучаемых актинофагов. Следует отметить, что очень важную роль при выполнении этих экспериментов сыграло использование в них антифаговой сыворотки.

Параллельно с этими работами шла серьёзная подготовка к осуществлению экспериментов по определению локализации профага на генетической карте штамма соеНсо1ог А3(2), которая была осуществлена Лидой Емельяновой с соавторами. К этому времени мы уже имели генетически маркированные штаммы соеНсо1ог А3(2), присланные нам Д.А. Хопвудом. Предварительно Норой Мкртумян были получены мутанты фага, отличающиеся по частоте лизогенизации и по морфологии негативных колоний. В скрещиваниях были использованы лизогенные генетически маркированные штаммы, несущие в качестве профагов эти мутанты. В начале работы необходимо было освоить методы скрещивания актиномицетных штаммов, что потребовало больших усилий. Не вдаваясь в значительные трудности и даже ошибки на этом пути, сайт интеграции профага на хромосоме актиномицета был, наконец локализован между

4 Это русскоязычная публикация: Новикова Н.Л., Капитонова О.Н., Ломовская Н.Д. Термоиндукция профага в прорастающих спорах Би'ер^тусез соеНсо!ог А3(2) (рЫС31 ^1) // Микробиология. 1973. Т. 42. С. 713-718.

5 Это русскоязычная публикация: Мкртумян Н.М., Ломовская Н.Д. Мутация, влияющая на способность умеренного актинофага рЫС31 Би'ер^тусез соеНсо!ог к лизису и лизогенизации // Генетика. 1972. Т. 8. С. 135-141.

двумя соседними генами игаА1 и рИеА 1 генетической карты штамма Б.соеИсо1ог А3(2). Сошлюсь на данные, опубликованные в нашем совместном обзоре с Китом Четером (Гопкткауа, С На! с г, Мкйшшап, 1980). Было также продемонстрировано явление зиготной индукции при скрещивании между лизогенными и нелизогенными штаммами (Гопкткауа, Ете1цапоуа, Мкйшшап, АИкЪашап, 1973).

В 1973 г. С.И. Алиханян организовал конференцию по генетике промышленных микроорганизмов на горном курорте Цехкадзор в Армении. Были приглашены и учёные из Европы, в том числе работающие с актиномицетами (рис. 2). Д.А. Хоп-вуд не смог принять приглашение и предложил вместо себя кандидатуру Кита Четера. Эта была первая поездка Кита Четера в Советский Союз. Собственно, Цехкадзор был тренировочной базой для спортсменов, тренирующихся для участия в Олимпийских играх. Зал, где проходила конференция, не отапливался. Участники и докладчики не снимали пальто, но все были полны энтузиазма. Кормили очень хорошо, по олимпийским нормам. Кит приехал легко одетым и делал доклад в костюме. Потом мы его немножко приодели. Приодели и Джузеппе Сермонти. Когда я сделала доклад, у меня было такое ощущения счастья, что я помню его до сих пор. Каждый вечер до поздней ночи упивались игрой джаза, состоящего из репатриантов. Танцевали до упаду. Большинство участников конференции были ещё такими молодыми. По-моему, Кит не представлял, что попадет в компанию интеллигентных и образованных людей. Так началось наше многолетнее с ним сотрудничество и настоящая дружба с легкими элементами конкуренции.

Рис. 2. Группа учёных, работающих с актиномицетами, на симпозиуме по генетике промышленных микроорганизмов в Цехкадзоре (Армения, 1973 г.) Слева направо: К.Ф. Четер (Англия), А.М. Воронин (СССР). 3. Гоштялек (Чехословакия), Д. Сермонти (Италия), Б.П. Мацелюх (СССР), Н.Д. Ломовская (СССР), Д. Ноак (ГДР). Fig. 2. The scientists involved in Streptomyces research during the Symposium on Industrial Microorganisms that took place in Cekhadzor, Armenia, in 1973. From left to right: K.F. Chater (England), A.M. Boronin (USSR). Z. Goshtalek (Chechslovakia), D. Sermonti (Italy), B.P.Matseluch (USSR), N.D. Fomovskaya (USSR), D. Noak (GDR)

В этом же 1973 г. я познакомилась с Дэвидом Хопвудом, когда в составе большой делегации советских генетиков приняла участие в качестве научного туриста в работе Международного генетического конгресса в Калифорнии в университетском городе Беркли, в США. С.И. Алиханян опять пробил через препоны партийной и государственной бюрократии возможность участия своих учеников в этом престижном международном форуме. Добирались из Москвы до Беркли в течение двух суток, пять раз меняя самолеты. Наконец, мы все в отеле в Беркли. Посмотрев на программу, я с ужасом увидела, что мой доклад должен состояться меньше, чем через час. Сделав его, я совершенно отключилась и не могла прослушать доклад Д. Хопвуда. Так мы с ним и познакомились. Мой разговорный английский при общении с Дэвидом совсем испарился. Пришлось обсуждать с ним научные проблемы, переписываясь.

В 1974 г. в Шеффилде (Англия) состоялся второй международный симпозиум по генетике промышленных микроорганизмов (01М-74). Я была туда приглашена с оплатой пребывания в качестве докладчика и сопредседателя секции по генетике актиномицетов. Я очень волновалась, как я смогу вести эту секцию, но Дэвид успокоил меня, что в мои обязанности входит, в основном, соблюдение докладчиками регламента. Участниками симпозиума из нашего института, которых я отчетливо помню, были также Элеонора Суреновна Пирузян, Виктор Николаевич Крылов, Анатолий Иванович Степанов. Опекал меня Кит Четер, его английский я понимала лучше, и он переводил мне дискуссии в кулуарах. Прощальный приём был устроен в музее. Много танцевали, в том числе английские народные танцы. Думаю, что эти танцы впоследствии обошлись мне дорого, так как меня длительное время с 1974-го по 1980-е гг. перестали выпускать на конференции в капиталистические страны. При этом на конференциях в социалистических странах мы продолжали активно общаться со всем стрептомицетным сообществом. Кит Четер за это время несколько раз приезжал в Москву, встречались с ним и на конференциях в ГДР. В лаборатории доктора Ноака в ГДР двое сотрудников — Ганс Крюгель и Зигфрид Клаус — тоже начали работать с актинофагом, но не с рЫС31, а с ЯНН) и часто приезжали в Москву.

Как гром с ясного неба для нас было увольнение в 1974 г. С.И. Алиханяна с должности директора института. Причина его увольнения так и осталась для нас тайной за семью печатями. Сое Исаакович остался руководителем большого теоретического отдела института вплоть до своей кончины в 1985 г. Чувствовалось, что он очень переживал, считал, что остался не у дел, и не было выхода его необыкновенной энергии. В то же время его отдел, как и весь институт, основанный им, продолжал продуктивно работать. На смену ему в качестве директора института пришёл Владимир Георгиевич Дебабов, который много лет до этого был заведующим лабораторией в нашем институте — крупный химик и молекулярный биолог, усилиями которого в институте стали быстро внедряться генно-инженерные методы для конструирования многочисленных продуцентов биологически активных веществ. Большой заслугой Владимира Георгиевича являлось сохранение в течение более чем 30 лет теоретических лабораторий и научных кадров института при интенсивном развитии прикладных исследований. И всё это при катастрофическом снижении финансирования фундаментальной науки.

Разработка методов получения количественных данных, характеризующих процесс инфекции актинофагом рЫС31 чувствительного штамма Л'. И\чс1ап.<< 66, позволяла приступить к подготовке экспериментов по построению генетической карты этого актинофага. Как правило, для картирования фаговых геномов получают большой

набор условно-летальных мутантов, например, температурочувствительных мутантов (18-мутантов), которые образуются практически во всех генах, имеющихся в геноме фага. Вся эта работа, включая и построение генетической карты актинофага рЫС31, в основном, выпала на долю Тани Чинёновой. Оглядываясь назад, нельзя переоценить тот вклад, который она внесла в изучение фага рЫС31, построение его генетической карты. Пришлось разрабатывать специальные приёмы для получения данных по комплементации (отнесения мутантов к одному или разным генам) и рекомбинации (расположению мутантов на генетической карте фага) в несинхронизированной по выходу фага системе. Все (х-мутапты и другие различные по фенотипу мутанты, за исключением одного, на генетической карте были расположены в линейном порядке по одну сторону от с-мутанта (СЫпепоуа, 1.ото\8к;па, 19756).

Для дальнейшего генетического изучения структуры генома фага рЫС31 необходимо было охарактеризовать его физически. Это было сделано Ириной Алексеевной Сладковой, блестящим специалистом в области гетеродуплексного анализа ДНК, нашим многолетним коллегой, физиком по образованию, на материале, представленном нашими генетиками. Было показано, что геном актинофага рЫС31, также как и геномы большого числа бактериофагов, представляет собой линейную молекулу ДНК (Н1ас1ко\ а е( а1., 19797). Только в конце 70-х годов в нашей лаборатории начались работы по установлению соответствия между генетической и физической картами актинофага с целью конструирования на основе этого фага векторных молекул.

В 1976 г. я была занята написанием докторской диссертации. В лаборатории были защищены к этому времен, несколько кандидатских диссертаций Н.Л. Новиковой, Т.А. Чинёновой, Л.К. Емельяновой, Т.А. Воейковой. Интенсивно работали с актино-фагом рЫС31 в эти годы Н.М. Мкртумян и В.И. Звенигородский. К написанию докторской диссертации «Тенетическое изучение актинофагов и их взаимоотношений с актиномицетами» я относилась очень серьезно и, как мне казалось, привела там много новых объяснений и гипотез при анализе полученных многолетних результатов. Защитила я её в конце 1976 г. Думаю, что её никто не читал, кроме оппонентов, Давида Моисеевича Еольдфарба, известного учёного в области бактериофагии, Льва Владимировича Калакуцкого, которого я тоже хорошо знала как коллегу по изучению а к ип 10-ми него в. Он является крупным специалистом в области систематики, изменчивости и экологии актиномицетов. Третьим оппонентом был Борис Николаевич Ильяшенко, хорошо известный своими работами по бактериофагам.

Ближе к осени в Москве, в 1978 г., состоялся Международный генетический конгресс. Долгих 40 лет его ждали отечественные генетики. Многие не дождались. Съехалось много знаменитостей, в том числе и из Америки. Приехали и европейские коллеги-актиномицетчики, в их числе и Кит Четер. С ним мы обсуждали детали готовящегося к печати совместного обзора по генетике и молекулярной биологии актинофагов, в который вошла значительная часть данных из моей докторской диссертации. Оказывается, никакая работа не пропадает даром. Обзор в дальнейшем цитировали в большом числе статей (Готоухкауа, СЬаЮг, Мкг(шгпап, 1980).

6 Это русскоязычная публикация: Чинвнова Т.А., Ломовская Н.Д. Температуро-чувствитель-ные мутанты актинофага рЫС31 Би'ер^тусез соеИсо!ог А3(2) //Генетика. 1975. Т. 11. С. 132—141.

7 Это русскоязычная публикация: Сяадкова И.А., Чинвнова Т.А., Ломовская Н.Д., Мкртумян Н.М. Генетическая характеристика и структура геномов актинофагов $1гер1отусе5.соеИсо1ог А3(2) // Генетика. 1979. Т. И. С. 1953-1962.

В дальнейшем мы попытались изолировать дополнительно фаги, действующие на штаммы S. coelicolor А3(2) и S. lividans 66, из имеющейся у нас большой коллекции родственных штаммов актиномицетов. Два лизогенных штамма были обнаружены Таней Чиненовой. Анализ строения ДНК фагов, образуемых этими лизогенными штаммами, проводился H.A. Сладковой, а их фенотипические и генетические признаки вместе с Таней изучали Лиля Васильченко, Нора Мкртумян и впоследствии Ольга Клочкова. ДНК обоих обнаруженных фагов phiC62 и phiC43, по данным гетеро-дуплексного анализа, оказались практически гомологичными фагу phiC31. Принцип гетеродуплексного анализа геномной фаговой ДНК состоял в денатурации ДНК двух актинофагов и в последующей ренатурации смеси их однонитчатых ДНК и использовался для обнаружения структурных различий в молекулах их ДНК. При этом можно с большой точностью определить размеры делеций или вставок в мутантных геномах. Фаг phiC62 отличался от фага phiC31 только отсутствием небольшой делеции и был идентичен фагу phiC31 по всем проверенным фенотипическим признакам.

А вот изучение фага phiC43 принесло нам много интересных фактов. Этот фаг тоже был практически гомологичен фагу phiC31, но имел в отличие от него чужеродную вставку. Образованные в результате спонтанной индукции лизогенного штамма мутные негативные колонии phiC43 имели разную морфологию. Этот признак, как оказалось, отражал наличие у этих вариантов фага различий в структуре их ДНК в области чужеродной вставки. Кроме того, практически все они обладали важным фенотипическим признаком — отсутствием способности к лизогенизации чувствительных штаммов. Так мы впервые столкнулись с появлением актинофаговых мутантов, образующих мутные негативные колонии, но не способных к интеграции в хромосому актиноми-цета. Такой фенотип был характерен для мутантных фагов, несущих мутации в фаговом гене, контролирующем синтез фермента интегразы8.

Конечно, мы сразу стали изучать возможность обнаружения таких мутантов, образующихся в результате утраты фрагментов фагового генома, среди мутантов фага phiC31, изолированных после обработки фага хелатирующими агентами, в том числе и не способных к установлению и поддержанию лизогенного состояния. После обработки фага хелатирующими агентами был получен и охарактеризован большой набор делеционных мутантов фага phiC31. Среди них были с-мутанты, не способные к поддержанию лизогенного состояния, а также мутанты, не способные к установлению лизогенного состояния (lyg-мутанты). Это стало настоящим подарком наших генетиков H.A. Сладковой9.

В дальнейшем было получено и изучено генетически большое число делеционных мутантов актинофага phiC31, различающихся по фенотипам. Представители делеционных мутантов различного фенотипа были локализованы на генетической карте

8 Сладкова И.А., Чинёнова Т.А., Ломовская Н.Д., Мкртумян Н.М. Генетическая характеристика и структура геномов актинофагов Би'ер^тусез.соеИсоЬг А3(2) // Генетика. 1979. Т. 11. С. 1953-1962 (ЗШкоуа й а1., 1979).

9 См.: Сладкова И.А., Васильченко Л.Г., Ломовская Н.Д., Мкртумян Н.М. Физическое картирование Би'ер^тусез соеНсо!ог А3(2) актинофагов. I. Локализация с-области актинофага рЫС31 // Молекулярная биология. 1980. Т. 14. С. 910-915 (ЗМкоуа, УавИ'сЬепко й а1., 1980); Сладкова И.А., Чинёнова Т.А., Васильченко Л.Г., Пельц Л.В., Ломовская Н.Д Физическое картирование Би'ер^тусез соеИсо!ог А3(2) актинофагов. II. Транспозоноподобная структура рЫС43 ДНК, локализация области, ответственной за установление лизогенного состояния // Молекулярная биология. 1980. Т. 14. С. 916-921 (8Мкоуа, СЫпешга й а!., 1980).

ИСТОРИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. 2017. Том 9. № 3

актинофага рЫС31. Это позволило установить соответствие генетических и физических карт этого актинофага и расположить на физической карте не только делецион-ные мутанты, но и температурочувствительные и другие мутанты этого фага10 (рис. 3).

2.6Q 2.6.5 2.0

ш

1 +-O.Q5 i.65 - <-5i

•о

i:

«ил«»!!

" чм frt 111c Lzi|

j j j

432,

ДС12 ~

йС2в|

Дс5|

f-

— — ; »8191

ctsi CIS CtbM tig

A W

tW<365

4U32

Рис. 3. Генетическая и физическая карты актинофага phiC31.

А — локализация ts, с, h, lyg маркёров на генетической карте фага phiC31, базирующаяся на результатах трёхфакторных скрещиваний. Цифры на генетической карте обозначают индекс

сегрегации, указывающий на уровень сцепления генетических маркёров с мутациями с и h в трёхфакторных скрещиваниях. В — вертикальные стрелки — сайты BcoR 1 на карте рестрикции phiC 31. Сплошные линии обозначают делеции в геноме phiC 31. Локализация точечных

с-мутантов основывается на результатах двухфакторных скрещиваний. Fig. 3. Genetic and physical maps ofactinophagephiC31. A, Respective locations of to, c, h, and/vg markers on the genetic map of phiC 31 based on the three-factorial crosses. Numbers on the genetic map indicate segregation index pointing to the level of marker linkage with the mutations с and h in the three-factorial crosses. B. Vertical arrows indicate BcoRl sites on the phiC31 restriction map, solid lines designate deletions in phiC31 genome. Focation of point с mutations as related to с deletions is shown,

based on the data of two-factorial crosses.

Гетеродуплексный анализ ряда делеционных мутантов фага рЫС31 позволил идентифицировать в геноме этого фага две непрерывные, значительные по длине области фагового генома, не существенные для его литического развития. В одной из этих областей были локализованы с-мутанты, не способные к поддержанию лизогенного состояния, а в другой — мутанты, не способные к установлению лизогенного состояния, предположительно затрагивающие ген, контролирующий синтез фермента интегразы. В последней были также обнаружены делеции ещё с одним мутантным фенотипом, так называемые ^-мутанты (рис. 3). Нельзя не отметить, какой существенный вклад в работу по получению делеционных мутантов, определению их фенотипов, картированию их на генетической карте рЫС31 внесла Л.Г. Васильченко.

Идентификация несущественных для литического развития фага рЫС31 областей его генома открывала большие возможности для конструирования на его основе

10 Васильченко Л.Г., Мкртумян Н.М., Ломовская Н.Д. Генетическое картирование и характеристика делеционных мутантов актинофага рЫС31, дефектных в лизогенизации // Генетика. 1981. Т. 17. С. 1967-1974 (УавЦ'сЬепко й а1., 1981).

фаговых векторов, в которых эти довольно протяженные по длине области могли быть замещены актиномицетными или другими генами. Итак, представляется, что в Москве были заложены фундаментальные основы для использования актинофага рЫС31 в качестве объекта генной инженерии и конструирования на его основе фаговых векторов. Привожу здесь только две сохранившиеся у меня памятные фотографии некоторых сотрудников нашей лаборатории (рис. 4 и 5).

Рис. 4. В лаборатории генетики актиномицетов и актинофагов (середина 90-х). Слева направо: многолетний лаборант лаборатории С.И.Косова, научные сотрудники В.Ю.Табаков, И.А. Сладкова, В.И. Звенигородский, JI.K. Емельянова, Т.А.Чинёнова. Fig. 4. The members ofthe laboratory of Streptomyces and Actinophages (VNII Genetics, mid-90s). From left to right: S.I. Kosova, the research assistant of many years, and scientists B.U. Tabakov, I.A. Sladkova, V.I. Zvenigorodsky, L.K. Emelianova, T. A. Chinenova

Рис. 5. Многолетние сотрудники лаборатории генетики актиномицетов и актинофагов. Слева направо: Т.А. Воейкова, JI.K. Емельянова, О.АКлочкова, и Л.М.Исаева.

Fig. 5. The members ofthe Laboratory of Genetics of Streptomyces and Actinophages of many years.

From left to right: T.A. Voeykova, L.K. Emelianova, O.A. Klochkova and L.M. Isaakova.

Все годы я ощущала большую моральную поддержку Д.А. Хопвуда и его коллег и всегда удивлялась, как внимательно следили они за нашими публикациями. И только сейчас я сформулировала представление о том, что наша лаборатория была не только единственной в нашей стране, но и единственной в мире, систематически изучающей генетику актинофагов. В своей обзорной статье Д. Хопвуд (Hopwood, 1999) в числе важных открытий в области генетики актиномицетов упоминает и открытие фага phiC31

и выход на мировую арену из нашей лаборатории штамма Н\чс1анх 66, сыгравшего впоследствии главную роль в разработке и использовании методов генной инженерии в применении к актиномицетам. Более подробно о наших научных и личных контактах с Д.А. Хопвудом и его коллегами описано в книге самого Хопвуда (Нор\уоос1, 2007).

В конце 70-х годов актиномицеты прочно завоёвывают свои позиции в качестве объектов генной инженерии в отделе Д. Хопвуда. Первой ласточкой оказалась работа по успешной трансформации плазмидной ДНК штамма Иу'икшн 66. В результате этот штамм оказался самым удобным реципиентным штаммом для введения в него изолированной плазмидной ДНК. Прошло десять лет с тех пор, как актинофаг рЫС31 был послан нами в отдел Д. Хопвуда. Имея в своем распоряжении наш богатый багаж генетического и физического изучения генома актинофага рЫС31, Кит Четер, наконец, выбрал в качестве основы для конструирования фаговых векторных молекул актинофаг рЫСЗ 1.

Настоящим прорывом в решении задачи конструирования и использования фаговых векторов на основе фага рЫС31 стала демонстрация трансфекции протопластов штамма 1Мс1ат 66 с помощью изолированной ДНК этого актинофага. Эта работа была опубликована Д. Зуаресом и К. Четером в том же плодородном на статьи по фагу рЫС31 1980г. Это позволяло в дальнейшем манипулировать с молекулой фаговой ДНК, а после трансфекции отбирать нужные жизнеспособные фаги, несущие в своем геноме чужеродные клонированные фрагменты. После этого Кит Четер и его коллеги семимильными шагами начали конструировать фаговые векторы различного назначения на основе актинофага рЫС31. Мы от этого тоже имели большие преимущества, так как Кит Четер присылал нам все свои фаговые конструкции в течение последующих лет. Упоминая работы К.Ф. Четера и его коллег по изучению фагов Н|гер1отусс8, позволю себе отослать читателя к его подробному обзору работ, включающих и наши работы по молекулярно-генетическому изучению актинофага рЫС31, конструированию на основе фага рЫСЗ 1 векторных молекул и их использованию при переносе генов с участием модельных актиномицетных штаммов (('ЬаЮг, 1986).

Неоспоримым преимуществом фаговых векторов перед векторами, полученными, например, на основе плазмидных геномов, являлось то, что гибридный фаг, полученный в результате трансфекции гибридной фаговой ДНК штамма 8.1Мс1аш 66, мог с помощью простой инфекции доставлять чужеродные гены в другие штаммы актиномицетов, у которых система введения в них изолированной ДНК не была разработана. Доставка актиномицетных фрагментов ДНК с помощью инфекции гибридным актинофагом могла быть использована для решения самых разнообразных задач, таких, например, как идентификация генов антибиотикообразования в штаммах-продуцентах, получения мутаций в этих генах, замены одних генов на другие в геноме актиномицетов и т. д.

Тем временем помимо работ по генетическому изучению фага рЫС31, наша лаборатория интенсивно проводила изучение взаимоотношений фага рЫС31 и других акти-нофагов с актиномицетами. Ведущая роль тут принадлежала Т.А. Воейковой, которой наряду с большой экспериментальной нагрузкой вместе с Н.М. Мкртумян удавалось помогать мне руководить большой лабораторией. Татьяна Александровна начала с освоения скрещиваний между производными А3(2) различной фертильности, потом разрабатывала методы получения межвидовых гибридов. Особенно продуктивной оказалось работа по получению отдаленных гибридов между штаммами соеНсо1ог А3(2) и griseus Кг. 15 — продуцентом стрептотрицина и изучению их свойств в отношении их чувствительности к фагам рЫСЗ 1 и 1^81, действующих только на один из родительских штаммов. После завершения этой работы нам представлялось, что при необходимости мы можем

получать гибриды между всеми штаммами актиномицетов рода Streptomyces, которые пожелаем скрестить, хотя эта работа требовала большой сноровки и специальных знаний. Получение гибридов, в частности, расширяло возможности изучения их взаимодействия с актинофагами. Так, например, можно было получать гибриды, наследующие от одного из родительских штаммов способность к образованию стрептотрицина, а от другого — устойчивость к фагам, лизирующим этот продуцент при промышленном производстве этого антибиотика. В этой же работе11 были впервые приведены данные о тестировании систем рестрикции и модификации (RM) у актиномицетов с помощью актинофагов. В этом же 1976 г. К. Четером и JI. Вилде было показано, что изолированная из штамма Streptomyces albus G эндонуклеаза Sali разрезает ДНК фага R4.

Таней Воейковой, Андреем Ореховым и их соавторами была осуществлена работа по идентификации у актиномицетов систем RM с помощью актинофагов12. Часть данных этого цикла работ суммированы в докладе на GIM86 (Lomovskaya, Voeykova, Mkrtumian, Emelyanova, 1986). Функционирование в бактериях систем рестрикции и модификации фаговой ДНК считается основным механизмом защиты бактерий от действия на них бактериофагов.

После выхода в печать нашей статьи с Томом Трустом, американским исследователем, проходившем годовую стажировку в нашей лаборатории, о новых свойствах плазмиды SCP2, которая была изолирована и изучалась в лаборатории Д.А. Хопвуда, В.Н. Даниленко и меня пригласили в лабораторию Д.А. Хопвуда. Приглашение пришло в конце 1979 г. На меня, как я понимала, еще распространялся запрет на поездки в капиталистические страны. 1980 г. ознаменовался началом многолетней войны в Афганистане. Начало этой войны вызвало большие протесты за рубежом. Многие страны объявили бойкот и советским учёным, отменив их приглашения на зарубежные конференции и командировки в научные центры. Приглашение на двухмесячную работу мне и В. Даниленко в отдел Д.А. Хопвуда оставалось в силе. Наши инстанции, наверное, были довольны отсутствием бойкота и дали нам быстро разрешение на эту поездку. Так, мы в феврале 1980 г. приехали в Англию, в г. Норидж, в Ботанический институт Джона Иннеса. Институт был основан в начале XX в. на деньги, завещанные Д. Иннесом, и в течение всего этого времени существует благодаря этому фонду и по правилам, обусловленным в завещании.

Это был самый продолжительный мой визит заграницу, и он оставил много воспоминаний обо всём увиденном, а главное, о людях, в то время работающих в отделе Д. Хопвуда, и о тех новых данных, которые позволили нам начать использовать методы генной инженерии в нашей лаборатории усиленными темпами. Я подробным образом узнавала все детали экспериментов по трансформации и трансфекции у людей из отдела, которые совсем недавно их сами разработали и охотно делились особенностями этих экспериментов. По ходу дела я быстро получила ряд новых чувствительных к актинофагу phiC31 генетически маркированных вариантов штамма S. coelicolor А3(2), которые мы с Китом предполагали использовать в намеченной на два месяца работе. Но ничего за такой короткий срок завершить не удалось. На дорогу Кит снабдил меня имеющимися в его коллекции первыми векторными вариантами фага phi С31.

11 Воейкова Т.А., Ломовская Н.Д. Межвидовая гибридизация в роде Streptomyces. Методы получения и свойства рекомбинантов между штаммами Streptomyces coelicolor А3(2) and S. griseus Kr. 15//Генетика. 1976. Т. 12. С. 196-213 (Voeikova, Tomovskaia, 1976).

12 Воейкова Т. А., Словинская Е.В., Орехов A.B., Ломовская Н.Д. Идентификация систем рестрикции и модификации в штаммах Streptomyces // Генетика. 1979. Т. 15. С. 1746—1757 (Voeikova et al., 1979).

Мы в течение многих лет работы с генетически маркированным штаммом S. coelicolor А3(2) продирались сквозь большие трудности при изучении взаимодействия фага phiC31 и других актинофагов с этим штаммом. Правда, и о штамме S. lividans 66 никогда не забывали. Штамм S. lividans 66 стал и сам предметом интенсивного генетического изучения в других лабораториях во многих странах. Как реципиент изолированной ДНК он обладал абсолютными преимуществами по сравнению со штаммом S. coeiicolor А(3)2. Однако штамм S. coelicolor А3(2) оставался самым генетически изученным штаммом актиномицетов, на котором были сделаны крушило открытия, перечислять которые не входит в мою задачу.

В июне 1982 г. в Киото (Япония) состоялся очередной Международный симпозиум по генетике промышленных микроорганизмов (GIM-82). С.И. Алиханян с начала организации этих симпозиумов в 1970 г. был постоянным членом Международного комитета по генетике промышленных микроорганизмов (GIMIC), который направлял работу этих симпозиумов. В разные годы в его состав входили известные учёные в этой области исследований. Учёные, которые по каким-либо причинам уже не могли участвовать в работе комитета, имели право предложить вместо себя кого-то другого. В письме, адресованном GIMIC, Сое Исаакович предложил рассмотреть в качестве члена этого комитета мою кандидатуру. На заседании GIMIC в начале работы симпозиума в комитет были кооптированы 8 новых членов. От нашей страны в него были включены A.M. Воронин и я.

Мой доклад на GIM-82 (LomovskayaN.D. et al., 1983) подводил итоги наших предыдущих исследований актинофага phiC31, содержал подробные данные по корреляции генетической, физической и рестрикционной карт ДНК этого актинофага. В этом же докладе впервые приводились данные о тестировании системы рестрикции и модификации в штамме S. coeiicolor А(3)2 с помощью нашего волшебного фага phiC31, размноженного перед этим в штамме S. albus с мутацией в гене рестриктазы Sali. Было также высказано предположение о наличии в штамме S. coeiicolor А(3)2, ранее охарактеризованной в наших работах рестриктазы Sgrll. Это исследование не получило продолжения даже через десять лет. Не знаю, стоит ли ждать.

В нашем докладе также приводились результаты по обнаружению и функционированию в геноме фага phiC43, родственного фагу phiC31, мобильной чужеродной последовательности IS281. Эта последовательность с большой вероятностью внедрилась в геном фага из хромосомы актиномицета.

Фаги, содержащие различные по длине фрагменты вставочной последовательности, отличались по морфологии негативных колоний, и эти наши данные были полностью подтверждены данными гетеродуплекного анализа. Работа по изучению генетических свойств вариантов фага phiC43, несущих вставочную последовательность IS 281 в районе гена интегразы фага phiC43 и отличающихся по морфологии негативных колоний в зависимости от длины вставки была осуществлена Т.А. Чиненовой и O.A. Клочковой". Помню как мы с Олей Кл очко вой, смотря на различную морфологию негативных колоний фага phiC43 предсказывали, какие структурные изменения они имеют в своем геноме и оказывались правы.

13 Сладкова И.А., Клочкова O.A., Чинёнова Т.А., Ломовская Н.Д. Физическое картирование ДНК Streptomyces.coelicolor А(3)2 актинофага.VII Образование делеций в области вставки фага phiC43 // Молекулярная биология. 1984. Т. 18. С. 497-503 (Sladkova et al., 1984).

Все работы по картированию полученных генетиками делеционных мутантов на физической карте ДНК актинофагов рЫС31 и рЫС43. были осуществлены И.А. Сладковой. Трудно переоценить её вклад в эти исследования, так же как и точность полученных ею результатов. Эти работы были направлены целиком на изучение возможностей конструирования на основе этих фагов векторов различного назначения для молекулярного клонирования чужеродных генов.

Впоследствии было показано, что эта последовательность содержится в хромосоме лизо генного штамма, из которого был изолирован фаг рЫС43 в числе пяти копий. По одной копии ее содержали и штаммы соеНсо1ог А3(2) и Иу'икшн 66.

В 1983 г. я в последний раз участвовала в работе Международного генетического конгресса в столице Индии Дели. От нашего института на конгресс в Дели послали нас вдвоём с Нелли Исааковной Ждановой. Мы с ней и её мужем Виктором Григорьевичем Ждановым много лет работали в одном институте. Оба они были выдающимися селекционерами и снабжали микробиологическую промышленность страны высокопродуктивными штаммами микроорганизмов.

Мой доклад в соавторстве с Т. Воейковой, А. Ореховым и О. Клочковой в основном был посвящен анализу и получению гибридов между штаммами соеНсо1ог А3(2) и Иу'икшн 66 с целью получить оптимальный реципиентный штамм для молекулярного клонирования. Этот штамм совмещал способность к эффективной трансформации и трансфекции плазмидной и фаговой ДНК штамма 8.1Мс1аш 66 и имел удобные генетические маркеры от штамма соеНсо1ог А3(2). Но впоследствии мы этот штамм не использовали. Просто как-то не пришлось.

В 1986 г. осенью состоялся очередной международный симпозиум 01М-86 в г. Сплит в Югославии. Меня пригласил сделать доклад на своей секции Джузеппе Сермонти. Я уже упоминала о нём как об одном из двух родоначальников генетики актиномицетов. Он дружил с С.И. Алиханяном, приезжал в его лабораторию вместе со своей женой и коллегой Изабеллой Спада-Сермонти еще в 60-х годах, посылал ему и мутанты модельного штамма соеНсо1ог А3(2).

В докладе, гдемоими соавторами были старожилы нашей лаборатории (Ьотоувкауа, Уоеукоуа, Мкг(шгпап, Ете1уапоуа, 1986), были представлены данные о конструировании фаговых векторов с использованием и без использования методов генной инженерии. Разнообразные варианты были отобраны в фаговом потомстве лизогенных штаммов, содержащих в своей хромосоме два профага. Эти векторы, образованные в результате рекомбинации между двумя профагами, в дальнейшем были нами использованы для изучения взаимодействия фага рЫС31 с продуцентами антибиотиков. Эти исследования заложили основу для использования фага рЫС31 в качестве переносчика клонированных актиномицетных генов не только в модельные актиномицет-ные штаммы, но и в продуценты антибиотиков. Целью этих исследований, главным образом, являлась идентификации генов антибиотикообразования в актиномицетных хромосомах и последующее изучения функций этих генов, чем мы с моим мужем Леонидом Максовичем Фонштейном стали активно заниматься, уже приехав в Америку.

Во время симпозиума я спросила у Дэвида Хопвуда, не хочет ли он все-таки когда-нибудь приехать в Москву, и вдруг он сказал, что хочет. Вернувшись домой, я написала директору нашего института В.Г. Дебабову докладную о большой целесообразности приглашения для посещения института с докладами двух крупных английских генетиков Д.А. Хопвуда и К.Ф. Четера с супругами. В министерстве согласились и выделили деньги для их визита.

Визит Джойс и Дэвида Хоивудов и Джейн и Кита Четеров состоялся в 1987 г. Сначала поехали впятером на несколько дней в Ленинград. На кафедре генетики ЛГУ нас встретил её заведующий Сергей Георгиевич Инге-Вечтомов, которого я хорошо знала в течение многих лет. Ленинград — отдельная вотчина, что сразу почувствовалась в том, как откровенно Сергей Георгиевич стал рассказывать нашим гостям о положении в стране. Сопровождать нас он попросил Никиту Николаевича Хромова-Борисова (наверное, потому, что тот тоже имел двойную фамилию), коренного ленинградца, одного из ведущих сотрудников кафедры. Мы об этом ни разу не пожалели. Для нас, конечно, он был просто Никитой. Дэвид сразу оценил его достоинства. Никита показал нам такой Ленинград, которого я никогда ещё не видела. В один из вечеров, придя из театра в гостиницу, Джойс с Дэвидом признались, что сегодня годовщина их серебряной свадьбы. Скоро в Никитиных руках возникла бутылка шампанского, и мы уселись в каком-то уютном уголке, и её распили.

Пожалуй, квинтэссенцией был рассказ супругов Хопвудов о том, что познакомились они в кинотеатре при просмотре картины С. Эйзенштейна «Александр Невский». Парадоксы жизни и пример взаимопроникновения культур, несмотря ни на какие преграды. Ещё же был такой плотный «железный занавес» в шестидесятые! И все-таки картина гениального русского режиссера, безвременно ушедшего из жизни, — в Англии. Правда, в Москве в 1961 г. состоялся Международный биохимический конгресс, и Джойс принимала в нём участие как биохимик по образованию. Там она познакомилась с известным русским учёным Рудольфом Салгаником и удивилась, как свободно они с ним говорили на некоторые политические темы. Когда она его об этом спросила, он ответил со смехом, что он уже живет в Сибири. Оба наших гостя сделали большие доклады в нашем институте, побывали и в других московских институтах (рис. 6).

Рис. 6. Во время визита английских учёных в Москву (1987 год). Слева направо: К.Ф. Четер, Н.М. Мкртумян, Д.А. Хопвуд, Н.Д. Ломовская. Fig. 6. During the visit of English scientists to Moscow in 1987. From left to right: K.F. Chater, N.M. Mkrtumian, D.A. Hopwood, N.D. Lomovskaya

В общем, все 80-е годы были посвящены в нашей лаборатории очень напряженной работе в разных направлениях. Вплоть до 1987 г. публиковались работы, связанные с дальнейшим генетическим изучением фага phiC31, физическим изучением его

ДНК и его взаимоотношений со штаммами актиномицетов, образующих антибиотики и другие биологически активные вещества.

Статья, описывающая новый механизм ограничения размножения фага phiC31 в штамме S. coelicolor А3(2), была опубликована в журнале «Генетика»14. Мы не публиковали материалы этой статьи в зарубежных журналах, но её содержание стало быстро известно, так как журнал «Генетика» в течение многих лет переводился на английский язык. Феномен ограничения развития фага phiC31 в исходном модельном штамме S. coelicolor A3(2) мы стали изучать спустя более чем 10 лет после того, как нами же был изолирован фаг phi С31, который не действовал на штамм S. coelicolor А3(2). Вот мы и сами поучаствовали в этом странном явлении, когда какой-то факт становился известным, а начинают его изучать через довольно продолжительное время. Наверное, каждый раз по разным причинам.

Начиная изучать феномен фагоустойчивости штамма S. coelicolor A3(2) к фагу phiC31, мы обозначили его фенотип как Pgl+ (phage growth limitation, по-русски — ограничение развития фага). Каждый полученный факт этого исследования приводил нас в изумление. Оказалось, что фаг не только адсорбируется на штамме S. coelicolor А3(2) Pgl+, но и образует нормальное фаговое потомство в одноступенчатом цикле роста. Кроме того, с высокой частотой образуются и лизогенные варианты штамма S. coelicolor А3(2) Pgl+. Значит, фаг phiC31 свободно проникает в прорастающие споры штамма S. coelicolor А(3)2 Pgl+ и или их лизирует, убивает, образуя фаговое потомство, или встраивается в хромосому. Однако фаг, размноженный однажды в штамме S.coelicolor А3(2) Pgl+, уже был не способен ни к лизису этого штамма, ни к его лизо-генизации. Оставалось предположить, что фаг, прошедший один цикл размножения в штамме S. coelicolor A3(2) Pgl+, изменяется (модифицируется) таким образом, что больше не способен размножаться в этом штамме.

На основании этих данных мы предположили, что в механизме ограничения размножения фага в штамме S. coelicolor А(3)2 Pgl+ участвуют по крайней мере продукты двух генов. Один из них модифицирует фаговую ДНК, а другой препятствует размножению модифицированного фага в штамме S. coelicolor А3(2) Pgl+. Оба гена, обозначенные как pal и pgl, были локализованы нами в одном и том же участке хромосомы штамма S. coelicolor А(3)2 Pgl+, отличном от локализации участка интеграции профага в хромосому. Можно было предположить, что система Pgl+ могла функционировать в качестве защиты от действия актинофагов целой популяции клеток актиномицетов, а не отдельных её представителей. В этой же статье были приведены данные, что фенотип Pgl+ является генетически нестабильным, то есть у штамма S. coelicolor A3(2) Pgl+ с высокой частотой возникали варианты S. coelicolor А3(2) Pgl, чувствительные к фагу phiC31. Из последних, в свою очередь, можно было легко изолировать варианты S. coelicolor А3(2) Pgl+. Частота возникновения Pgl вариантов у штамма Pgl+ и Pgl+ вариантов у штамма Pgl была значительно выше, чем частота возникновения точечных мутаций. То есть мы прибавили к довольно значительному числу генетически нестабильных признаков у актиномицетов, включающих и такой важный признак, как способность к образованию антибиотиков, ещё один. Открытый нами новый феномен ограничения развития фага phiC31 в штамме S. coelicolor A3(2) тоже остался ждать своих магических десяти лет

14 Чинёнова Т.А., Мкртумян Н.М., Ломовская Н.Д. Генетическое изучение нового признака резистентности к фагу у штамма Streptomy ees coelicolor A3 (2) //Генетика. 1982. Т. 18. С. 1945—1952 (Chinenova et al., 1982).

для того, чтобы начать его последующее изучение. Продолжить изучение этого феномена было решено в отделе Д. Хопвуда. В конце 1990 г. в нашу лабораторию приехали наши английские коллеги Марк Батнер и Кэрол Лейти для ознакомления со всей проблемой в целом. Мы к этому времени подсуетились и изолировали из нашей коллекции «синих актиномицетов» штаммы, которые по своему поведению по отношению к фагу рЫС31 были сходны со штаммом А3(2), то есть имели фенотип Pgl+. Марк сказал, что изучение этой проблемы может дать большую пищу для ума.

Сейчас со дня опубликования нами первой статьи о феномене Pgl прошло более 30 лет. Повторюсь, что в этой первой статье мы выдвинули предположение, что актиноми-цет, жертвуя очень незначительной частью своей популяции, которая гибнет в результате первичной фаговой инфекции, спасает остальную часть своей популяции. Модифицированное фаговое потомство, образующееся в инфицированных клетках, утрачивает способность к продуктивной инфекции клеток с фенотипом Pgl+ или их лизогенизации, не утрачивая способности к действию на клетки Pgl. Так и существуют вместе эти враги, актинофаг и его хозяин актиномицет и никто не остается побеждённым в этом поединке.

Вообще актиномицеты, как и другие бактерии, имеют несколько барьеров против инфекции актинофагами (бактериофагами). К ним относятся, например, отсутствие в клеточной оболочке актиномицетов рецепторов для адсорбции актинофагов. Другим очень серьёзным барьером является присутствие внутри клеток актиномицетов разнообразных систем рестрикции и модификации фаговой ДНК. Попадая внутрь актино-мицетной клетки, фаговая ДНК расщепляется ферментами рестрикции, рестриктазами и не способна к образованию фагового потомства. Лишь небольшая часть фаговой ДНК может избежать рестрикции в результате того, что сайты рестрикции у неё защищены с помощью функционирования другого актиномицетного фермента, метилазы. И опять нет побеждённых. Каждый из компонентов этой системы жертвует частью популяции для сохранения собственного вида. Аужлизогенное состояние — это вообще целая симфония. Оба — и фаг, и бактерия (актинофаг и актиномицет) — выживают, фаг в части популяции лизогенных актиномицетов в интегрированном в хромосому актиномицета состоянии, а лизогенная бактерия (актиномицет) становится устойчивой к повторной инфекции фагом. Как в песне «У попа была собака». Вскользь отмечу, что отличительной особенностью актинофага phiC31 является то, что он действует на очень большое число актиномицетных штаммов и это являлось ещё одним очень существенным основанием для конструирования на его основе фаговых векторов.

В начале 1991 г. в отделе Д.А. Хопвуда состоялся небольшой симпозиум — семинар, посвященный результатам многопланового изучения актинофага рЫС31 и его использования в молекулярно-генетических исследованиях актиномицетов. В симпозиуме участвовали сотрудники группы Кита Четера и ряд других сотрудников отдела Д.А. Хопвуда, сотрудники лаборатории Маргарет Смит из Университета Глазго, молодой сотрудник генно-инженерной лаборатории американской компании Илай-Лили С. Кёстос и я. Мне пришлось сделать три отдельных доклада, так как в нашей лаборатории изолированный нами фаг был объектом наиболее длительного и интенсивного генетического и молекулярно-генетического изучения (рис. 7).

В докладе С. Кёстоса сообщалось об изоляции гена интегразы фага pliiC 31, определении полной нуклеотидной последовательности этого гена и его клонировании на плазмид-ный вектор, который приобретал способность встраиваться в хромосомы актиномицетов по сайту интеграции профага рЫС 31. Доклад С. Кёстоса произвел на слушателей большое впечатление. В этом же 1991 г. эти данные были опубликованы (Kuhstoss, Rao, 1991).

Рис. 7. Участники семинара в институте Д. Иннеса (Англия, 1991 г.), посвященного итогам изучения актинофага phiC31. Сидят: К. Четер, С. Кёстос (герой дня), М. Батнер, Н. Ломовская, стоят (те, которых я помню) слева направо: М. Смит, С. Брайтон, М. Биб, четвёртая справа К. Лейти.

Fig. 7. Participants of the Seminar dedicated to the results of studies on the actinophagephiC31, that took place in the John Innes Institute, England, in 1991. Sitting (from left to right): K. Chater, S. Kuhstoss (the hero of the day), M. Batner, N. Lomovskaya. Standing (those I remember, from left to right): M. Smith, S. Brighton, M. Bibb, C. Laity (the forth from right).

Я досадовала, что не мы, которые идентифицировали ген интегразы в геноме фага phiC 31 практ ически десять лет назад, сделали эту работу. Как и в случае с самим фагом рЫС31, работы с геном интегразы начались только спустя десять лет после идентификации этого гена в наших работах. Создание плазмидных векторов с фаговым геном интегразы — очень важный этап в генной инженерии актиномицетов. Я думаю, что мы и сами могли бы раньше подсуетиться с переносом гена интегразы на актиномицетную плазмиду. Наверное, это подсознательно тормозилось низким уровнем освоения нами методов генной инженерии, а может быть, мы просто в то время не сообразили это сделать. Единственное, что успокаивало, это то, что мы, такие несообразительные, были в хорошей компании с Китом Четерома, а учёным из компании Илай-Лили потребовалось значительное время (те же заколдованные 10 лет), чтобы начать и осуществить эту работу.

Итак, повторюсь, что главным преимуществом использования фаговых векторов для клонирования актиномицетных генов является то, что гибридный фаг, содержащий я кип юм и пени.re гены или их фрагменты, отобранный в результате трансфекции штамма S. iividans 66, переносит их другой актиномицетный штамм просто с помощью инфекции таким гибридным фагом. Этот метод мы с моим мужем Л.М. Фонштейном модифицировали, уже работая в Америке, и широко использовали для идентификации в хромосомах актиномицетов сцепленных антибиотических генов, а также при изучении структуры и функций большого числа генов, участвующих в биосинтезе противораковых антибиотиков даунорубицина и доксорубицина.

Неожиданное предложение работы в Америке (наша рабочая лошадка — актинофаг phiC31 в новой роли)

В начале 1992 г. я получила письмо от профессора Висконсинското университета г. Мэдисона Ричарда Хатчинсона — заведующего одной из самых престижных в Америке лабораторий по изучению генетического контроля биосинтеза антибиотиков. В этом письме сообщалось о проблеме, которая возникла при выполнении совместного с фармацевтической фирмой «Эббот» гранта, темой которого являлась идентификация в штамме Streptomyces hygroscopicus кластера генов биосинтеза иммуносу-прессанта рапамицина. Рапамицин к тому времени был известен своей более высокой активностью, чем уже используемые в медицине иммуносупрессанты, но имел более высокую токсичность. Этот дефект можно было попробовать устранить с помощью модификации ряда генов, принимающих участие в биосинтезе рапамицина, для получения структурных аналогов рапамицина, обладающих сниженной токсичностью.

В самом начале работы сотрудники двух лабораторий Ричарда Хатчинсона и Леонарда Каца (фирма «Эббот») столкнулись с неожиданной трудностью, а именно с невозможностью ввести изолированную ДНК в штамм S. hygroscopicus ни с помощью трансформации, ни с помощью конъюгации, наиболее распространенных методов введение в штаммы актиномицетов изолированной ДНК. И тут Ричард Хатчинсон вспомнил о нашем фаге. Он предлагал мне заключить годовой контракт и приехать в его лабораторию в качестве приглашённого профессора вместе с мужем. Мы, почти не раздумывая, согласились, главным образом потому, что наша дочь Ольга, молекулярный биолог, и внучка Анна уже жили в Америке. После продолжительных формальностей при оформлении визита в университет и фармакологическую фирму неожиданно пришли все документы для отъезда в Америку для меня и моего мужа J1.M. Фонштейна, который в то время работал в Институте общей генетики АН СССР.

Столица штата Висконсин г. Мэдисон, где нам с Леонидом предстояло работать, расположен недалеко от Чикаго, на перешейке двух живописных озёр. Значительную часть населения города составляют студенты и преподаватели Висконсинского университета.

Я получила разрешение взять с собой все необходимые для работы варианты фага рЫС31. Кроме того, в моём распоряжении были и векторные молекулы фага, сконструированные Китом Четером. Началась новая жизнь нашего фага. Для меня важность предлагаемой работы определялась тем, что фаговые векторы до сих пор использовались в основном при работе с модельными штаммами актиномицетов или с их очень близкими родственниками. А у меня была неосуществленная мечта — использовать фаговые векторы в работе со штаммами, образующими используемые в медицине антибиотики с целью идентифицировать в их хромосомах гены антибиотикообразо-вания и получить мутации в этих генах для изучения их функций. Мой муж никогда «в лицо» не видел ни актиномицетов, ни актинофагов, но много лет назад имел опыт работы с Т-чётными бактериофагами и штаммами бактерии E.coli. Через несколько дней после нашего приезда Хатч (так его называли все сотрудники лаборатории) сказал, что берёт на работу и моего мужа и мы можем работать вместе над одним проектом.

И так мы, оба в преклонном возрасте, покинув свои руководящие должности, встали к рабочему столу и трудились вместе в течение 12 лет. Опыта совместных исследований у нас не было, однако в результате плоды нашей деятельности оказались намного больше суммы вложенных усилий каждого.

Внимательно проанализировав предложенную Китом Четером схему отбора фагов, несущих отклонированные чужеродные гены, мы пришли к неутешительному выводу о большой сложности осуществления этой схемы. Теперь в нашу задачу входила разработка быстрого и удобного метода отбора рекомбинантных фагов, несущих фрагменты хромосомной ДНК штамма Иу^озсоркт. И вот в течение одного зимнего вечера придумываем, как упростить процедуру отбора рекомбинантных фагов. Сразу же скромно называем ее спот-тестом. Для быстрой идентификации встроенного в векторный фаг фрагмента в него предварительно включается ген резистентности к неомицину (арИ1Г). Все изолированные после трансфекции фаги проверяются очень быстро, в течение менее чем одних суток на устойчивость к неомицину. Рекомбинантные фаги, несущие отклонированный ген, приводят к устойчивому росту на чашках с неомицином. Просто, как репа на блюде! (рис. 8).

Рис. 8. Изобретенный нами сиот-тест. Рекомбинанты, несущие отклонированный ген, образуют пятна устойчивого роста на чашках с неомицином.

Fig. 8. The simple spot-test that we have invented. The recombinant phages that acquired the cloned gene of interest were selected based on their ability to make resistant spots on the lawn of the neomycin.

Теперь клонированный фрагмент может быть перенесён в штамм S. hygroscopicus просто при его инфицировании рекомбинантным фагом и отборе устойчивых к неомицину вариантов, у которых клонируемый актиномицетный фрагмент включён в хромосому с помощью двойного кроссинговера. Надо сказать, что придуманный нами в течение совсем короткого времени сиот-тест сыграл кардинальную роль в нашей дальнейшей работе по получению мутаций в генах, контролирующих биосинтез вторичных метаболитов, к которым относятся и рапамицин, и антибиотики. Он позволил нам идти почти семимильными шагами к идентификации генов антибиотикообразова-ния и других Г) пологи чес к и активных веществ в штаммах актиномицетов.

Как я уже упоминала, у нас имелись все производные фага рЫС31, необходимые для осуществления планируемой работы. Характер взаимоотношений фага phiC31 и штамма S. hygroscopicus был нами выяснен довольно быстро. С помощью фагов, имеющихся в нашей коллекции, несущих маркеры резистентности к вио-мицину или теострептону и не утративших способности к лизогенизации, удалось получить лизогенные по фагу phiC 31 варианты штамма S. hygroscopicus. Было также продемонстрировано образование двойных лизогенов этого штамма в результате

гомологичной рекомбинации между резидентным профагом и суперинфицирую-щим фагом. Последнее обстоятельство указывало на возможность введения в штамм Иу^озсоркш фрагментов актиномицетной ДНК с помощью имеющихся в нашем распоряжении фаговых векторов.

Задача сотрудников компании «Эббот», участвующих в этом проекте, состояла в предварительной идентификации на хромосоме штамма Иу^зсоркш сцепленной группы (кластера) генов, контролирующих биосинтез рапамицина с тем, чтобы клонировать фрагменты предполагаемого кластера на фаговый вектор. Доказательством того, что на фаговом векторе отклонированы именно фрагменты кластера генов биосинтеза рапамицина, должно было стать образование неактивных в отношении синтеза рапамицина мутантов после инфекции штамма Иу&озсоркш рекомбинантным фагом.

На первых порах, которые растянулись на довольно продолжительное время, все наши усилия в этом направлении успеха не имели. Риск всей этой работы состоял в том, что штамм, образующий рапамицин, мог содержать в составе своей хромосомы несколько кластеров генов, контролирующих синтез вторичных метаболитов, только один из которых обеспечивал синтез рапамицина. Это могло привезти к тому, что получаемые нами от фирмы фрагменты принадлежали не к кластеру генов рапамицина, а к другим кластерам. Так оно и произошло. В течение довольно продолжительного времени введение в хромосому отклонированных на фаговом векторе фрагментов ДНК штамма Иу&озсоркш не приводило к образованию неактивных в отношении биосинтеза рапамицина мутантов.

И вот в 1995 г. была опубликована работа очень большого коллектива авторов из лаборатории, руководимой Питером Лидли (Англия), определивших нуклеотидную последовательность кластера генов, который по многим показателям являлся кластером генов, контролирующих биосинтез рапамицина. Однако в статье отсутствовало окончательное доказательство того, что повреждение гена или нескольких генов в этом кластере приводит к прекращению биосинтеза рапамицина и образованию неактивных мутантов. И тогда пришел наш час. Опубликование полной нуклеотидной последовательности кластера позволило нам быстро сконструировать фрагмент, в котором отсутствовали несколько генов кластера, клонировать его на фаговом векторе и ввести в хромосому штамма hygroscopkus. И тут мы впервые за несколько лет получили мутанты, не способные к образованию рапамицина. Картинки получились такие впечатляющие, что мы не могли от них оторваться. Ричард Хатчинсон в таких критических и торжественных ситуациях всегда приходил посмотреть такие данные и радовался вместе с нами. Надо признаться, что такие моменты можно было перечислить по пальцам (пожалуй, все-таки обеих рук). Как было отмечено в опубликованной нами совместно с лабораторией фирмы «Эббот» статье, в хромосоме Иу&озсоркш были в процессе этой работы идентифицированы четыре кластера поликетидсинтазных генов, и генов, обеспечивающих образование цитохрома Р450 гидроксилазы и ферри-доксина (Ьотоувкауэ с( а1., 1997).

Так как работа по совместному гранту продвигалась медленно, мы почти сразу же после приезда присоединились к проекту, в который был вовлечен практически весь коллектив лаборатории Хатчинсона, а именно изучению функционирования кластера генов, контролирующих биосинтез противораковых антибиотиков дауноруби-цина (ДНР) и доксорубицина (ДХР) в штамме Х1гер1отусе.ч реисеГшн. Биосинтез обоих антибиотиков контролируется одними и теми же генами. ДНР превращается в ДХР в результате функционирования одного гена с1охА. В медицине используется главным

образом ДХР как менее токсичный и более эффективный, который образуется природным штаммом S. peucetius в значительно меньших количествах, чем ДНР.

В конце 1980-х и в начале 90-х нуклеотидная последовательность практически всех генов биосинтеза ДНР и ДХР была определена, что облегчало задачу получения мутаций в этих генах для дальнейшей идентификации их функций. Все сотрудники лаборатории получали мутации в генах биосинтеза ДНР и ДХР с помощью трансформации штамма S. peucetius плазмидной ДНК, несущей фрагменты генов биосинтеза. Трансформация штамма S. peucetius была неэффективной и требовала значительных усилий и времени.

Быстро установив способность штамма к лизогенизации фаговыми векторами, мы приступили к работе по получению мутаций в гене drrC, белок которого имел сходство с белком UvrA E.coli, являющегося частью комплекса белков, репарирую-щих поврежденную бактериальную ДНК. Ну и крепкий орешек нам опять попался, который мы грызли параллельно с проектом по рапамицину. Достаточно сказать, что мутации в этом гене удалось получить только у неактивного в отношении биосинтеза ДНР штамма S. peucetius dnrJ. Суммарные данные этой работы указывали на то, что белок DrrC обеспечивает новый, отличный от уже описанных, механизм устойчивости штамма S. peucetius к собственному антибиотику. Эта статья была нашей первой публикацией в Америке в 1996 г. В ней мы подробно впервые описали методику конструирования и отбора рекомбинантных фагов, несущих фрагменты актиномицетной ДНК и получение мутаций в генах продуцента антибиотиков, используемых в медицине, просто с помощью инфекции такого штамма рекомбинантным фагом (Lomovskaya et al., 1996). Один наш коллега из лаборатории вклеил эту методику в руководство по работе со штаммами Streptomyces, выпущенное в отделе Д. Хопвуда, и сказал, что он очень высоко её оценил, но с фагами всё равно работать не решился. Вслед за этой работой Каору Фуруйа и Р. Хатчиксон опубликовали в 1998 г. статью по характеристике белка DrrC, в которой подтвердили, в частности, что этот белок является новым типом белка, обеспечивающего резистентность штамма к собственному антибиотику. Этот белок обладает способностью связываться с ДНК подобно белку UvrA. Мы очень дружили с Каору, который был соавтором и нашей статьи по гену drrC, и переняли у него с благодарностью некоторые принципы его работы.

Наша следующая работа с получением мутаций в генах биосинтеза ДНР и ДХР dpsYи dnrXбыла опубликована в 1998 г. В это время сказывался накопленный с годами опыт. Нам помогала жесткая стандартизация условий выращивания и хранения акти-номицетных штаммов, которую мы разработали для уменьшения наших физических усилий. Мне сейчас даже трудно представить, насколько больше нам удалось сделать в будущем в результате использования этой, казалось бы, простой процедуры. Не помню, чтобы этими простыми приёмами кто-нибудь воспользовался. Самое большое удовлетворение мы получили, когда оказалось, что мутация в гене dnrX приводила к трехкратному увеличению синтеза ДХР, вероятно, препятствуя его превращению в неактивные метаболиты.

Итак, уже идентифицированы два гена биосинтеза ДНР и ДХР, мутации в которых обеспечивали значительное повышение синтеза ДХР, по сравнению с его низким уровнем в исходном штамме. Один из них — это ген dnrH, описанный С. Скотти и Р. Хатчинсоном, а другой — обнаруженный нами ген dnrX. В дальнейшем мы получили также мутацию ещё в одном гене dnrU, присутствие которой тоже приводило к увеличению биосинтеза ДХР. Теперь становилось совершенно очевидным, что можно было

попытаться получить более активный штамм, объединив в нём все три мутантных гена. В случае положительного результата можно было обсуждать возможность получения более высокопродуктивных штаммов не только с помощью случайного отбора, но и с помощью направленной селекции методами генной инженерии.

Начав рисовать схему предполагаемого эксперимента по совмещению трёх мутаций в одном штамме, я удивилась, что это можно осуществить с помощью одного и того же фагового вектора, если каждый раз вводить мутации в описанных генах с помощью двойного кроссинговера. При этом сконструированный штамм не будет содержать никаких фрагментов фага. Процедуру можно было продолжать, последовательно вводя в один и тот же штамм необходимые мутации. Все расчёты по введению в ранее охарактеризованные гены мутаций, приводящих к увеличению продуктивности, осуществлял Леонид Максович. Довольно быстро нам удалось получить тройной мутант. Синтез ДХР двойного мутанты превышал таковой исходного штамма в 6 раз, а тройной мутант был активнее двойного почти в 4 раза. Колбы были тёмно-красными от присутствия в них большого количества ДХР по сравнению с исходным штаммом. Опять радовались вместе с Хатчем. Мы предложили фирме «Farmitalia», с которой сотрудничала многие годы лаборатория Р.Хатчинсона, ввести идентифицированные мутации в их высокопродуктивный штамм, но по разным причинам эта работа не состоялась. Статья, описывающая свойства тройных мутантов со значительно увеличенным биосинтезов ДХР, — наша любимая (Lomovskaya et al., 1999).

Конечно, я не имею возможности сослаться на большинство работ, выполненных в большой лаборатории в Москве и в Висконсинском университете. В последнем нам удалось опубликовать семь работ, в том числе в " Science" (Ahlert et al., 2002), стать авторами пяти патентов, участниками конференций и симпозиумов в США и Англии. Всё-таки мы проработали там с моим мужем Леонидом Максовичем Фонштейном 12 долгих лет, с 1992 по 2004 г. На рис. 9 — интернациональная лаборатория Р. Хатчинсона. Трое американцев, остальные из разных стран (Англии, Италии, Германии, Кореи, Китая, Японии) и мы с Леонидом Максовичем, известно откуда. Р. Хатчинсон отсутствует, так как он пошёл покупать пиццы для всех в пиццерию "Папы Джонса".

Рис. 9. Лаборатория Ч.Р. Хатчинсона. На традиционных проводах одного из сотрудников, стажирующихся в лаборатории для продолжения научной карьеры. Fig. 9. The Taboratory of Dr. Hutchinson. The traditional farewell party honoring the departing researcher.

Последний раз фаговый вектор был использован нами для уточнения функции гена, ранее обозначенного как dpsH. Многие гены в кластере, контролирующем биосинтез ДНР и ДХР, входили в состав оперонов. Если мутацией был затронут соседний ген в опероне, то функция исследуемого гена могла быть определена неправильно. Нами почти ювелирно в ген была введена мутация, которая не нарушала порядок считывания этого гена и соседних с ним генов. Это позволило установить, что изучаемый ген имеет другую функцию, чем ранее считалось, а именно участвует в биосинтезе сахарной части ДНР и был переименован в ген dnmW.

На этом наша работа с фаговыми векторами на основе актинофага phiC31 неожиданно закончилась. Р. Хатчинсон, сделав нам на бегу комплимент по поводу быстрого и безошибочного получения генно-инженерных конструкций, предложил нам совместно с очень грамотным химиком Свен-Эриком Волертом осуществить работу по получению различных конструкций олеандрозы — сахарной части антибиотика авермектина. Как известно, активность всех антибиотиков обеспечивается функционированием Сахаров, входящих в их состав (Wohlert, Lomovskaya et al., 2001). Так началась наша «сладкая жизнь», которая продолжалась вплоть до окончания нашей работы в Висконсинском университете в 2004 г. Единственное, что осталось в этой работе от незабвенного фага phiC31 — это его интегразный ген, с помощью которого все конструкции, клонированные на плазмидных векторах, стабильно встраивались в хромосомы актиномицетов.

Дальнейшая судьба актинофага phiC31

Актинофаг phiC31 все 90-е годы продолжал быть объектом изучения и использования в отделе Д.А. Хопвуда. После долгих лет перерыва там было продолжено и генетическое изучение системы ограничения развития фага (Pgl+) в штамме S. coelicolor А3(2), проведенное нами в ранних 80-х. Кэрол Лейти с соавторами были опубликованы статьи, характеризующие функционирование двух отклонированых генов (pglY и pglZ), участвующих в этом процессе (Bedford, Laity, Buttner, 1995). Совсем недавно возник, правда, уже совсем незначительный факт эффекта десятилетней давности. В своём письме в этом 2015 г. Кит Четер обмолвился, как ему понравился мой доклад, сделанный на симпозиуме в его честь в 2004 г. в институте Д. Иннеса, и он только сейчас осознал, каких трудов мне стоило собрать иллюстративный материал за столь долгие годы работы, да и то, живя за границей.

В эти и последующие годы значительный вклад в изучение актинофага phiC31, его взаимоотношений с актиномицетами и характеристики уникального фагового фермента интегразы был внесен Маргарет Смит и сотрудниками её лаборатории (Англия) (рис. 10).

В 1999 году М. Смит с соавторами опубликовала статью об определении полной нуклеотидной последовательности актинофага phiC31. Елавный акцент в этой статье был сделан на эволюционные взаимоотношения актинофага phiC31 с другими бактериофагами. Дальнейшего анализа нуклеотидной последовательности актинофага phiC31 я не встречала.

Не была обойдена в лаборатории М. Смит вниманием и система Pgl. Были отклонированы гены pglYZ и pglWX, функционирование которых оказалось необходимым и достаточным для приобретения Pgl штаммами фенотипа Pgl+. Были также

Рис. 10. Главные действующие лица в саге об актинофаге phiC31: Маргарет Смит, Наташа Ломовская и Кит Четер во время симпозиума в честь К.Ф. Четера (2004 г., Англия).

Fig. 10. The main characters in the actinophage phiC31 saga during the Symposium honoring K.F. Chater (Fngland, 2004): Margaret Smith, Natasha Fomovskaya and Keith Chater.

охарактеризованы белки, синтез которых контролируется этими генами. Фенотип Pgl был обусловлен мутациями в гене pglW. Введение всех этих генов в штамм S. lividans 66 обеспечивало этому штамму, исходно имеющему Pgl фенотип, фенотип Pgl+ (Hoskinson, Sumby, Smith, 2015). В тени опять остаётся (если я не упустила) механизм генетической нестабильности, когда в культуре Pgl+ с высокой частотой образуются варианты Pgl, у которых в свою очередь с такой же высокой частотой возникают варианты Pgl+.

В современных работах Pgl+ система описывается как вторая по значимости система ограничения развития бактериофагов в бактериях. Первыми, конечно, являются системы рестрикции и модификации фаговой ДНК, о которых упоминалось выше. Относительно недавно, в 2008 г., гены, гомологичные генам pgl штамма S. coelicolor А3(2), были обнаружены в бактериальном штамме Acidothermus celluloticus. И всё-таки в работах второго десятилетия XXI века ещё упоминается, что механизм ограничения фага phiC31 в штамме S. coelicolor А3(2) до конца не расшифрован, и как это ни парадоксально, в этих статьях приводится объяснение этого феномена, представленное в нашей статье, в которой он впервые был описан ещё в 1982 году.

Недавно в большой серии работ было показано, что система Pgl, описанная нами, как обеспечивающая резистентность штамма Streptomyces coelicolor к фагу рЫС31, является частью большой системы, обозначенной BREX (Bacteriophage Exclusion), ответственной за резистентность к значительному числу бактериофагов у довольно большого числа всех сиквенированных микробных геномов. Система BREX была обнаружена с помощью анализа на присутствие в микробных геномах генов, гомологичных гену pglZ, имеющемуся в кассете генов, обеспечивающих Pgl резистентность штамма Streptomyces coelicolor к фагу phiC 31.

Сага об актинофаге phiC31 продолжается и есть надежда, что неожиданное её направление даст свои довольно уникальные плоды. Впервые в лаборатории М. Смит было показано, что фермент интеграза фага рЫС31, ответственный за включение фага в хромосому актиномицета, обладает уникальными свойствами по сравнению с большинством интеграз других детально изученных бактериофагов. В отличие от большинства фаговых интеграз интеграза phiC31 не обладает свойством обеспечивать вырезание фага из хромосомы штамма хозяина. Эта функция обеспечивается другими ферментами актинофага phiC31. Мы в своё время с Леонидом Максовичем наблюдали, как стабильно сохраняются плазмиды, несущие ген интегразы и клонированные на них гены, в хромосоме штамма S. lividans 66. Кроме того, оказалось, что phiC31 интеграза обладает способностью включать определённые структуры не только в хромосомы актиномицетов, но и в хромосомы эукариотов, в том числе дрозофилы, растений, животных, человека, которые способны там стабильно сохраняться (Fogg et al., 2014). Свойства организмов, в которые необходимые гены были введены с помощью интегразы phiC31, продолжают интенсивно изучаться, и разнообразие этих организмов постоянно увеличивается. Не исключено, что интенсивные исследования в этой области приблизят время участия phiC31 интегразы в области генной терапии. Так что если не весь фаг, то его уникальный ген будет продолжать полезную деятельность, обеспечив своё применение в большом числе объектов генной инженерии.

Выражаю сердечную благодарность Ольге Николаевне Данилевской, которая явилась инициатором написания этой статьи, а также моей дочери Ольге Леонидовне Ломовской за критические замечания и помощь в работе.

The History of How the Streptomyces Phage phiC31 and Its Favorite Strain Streptomyces lividans 66 Gained the Worldwide Prominence

Natalia D. Lomovskaya

Professor Dr., Madison, Wisconsin, USA; lomovskayan@gmail.com

This paper describes the discovery and subsequent comprehensive investigation of the temperate bacteriophage phiC31. It was isolated in 1968 in Moscow, in the laboratory of genetics of Actinomycetes and actinophages in the Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms. Our laboratory dedicated the more than 20 years for studying genetics and molecular genetics of this phage. The phage was isolated based on its activity against two strains, the model, genetically characterized strain of Streptomyces coelicolor A3(2) and the strain of Streptomyces lividans 66, which was the most sensitive to this phage. Streptomyces are legendary for their ability to produce a variety of secondary metabolites, among them many useful antibiotics. Detailed genetic and physical maps of allowed construction of useful vector molecules based on PhiC 31. In addition, the strain of Streptomyces lividans 66 was identified as the most optimal recipient for cloning of isolated Streptomyces DNA and since then and until now it is being used as a cloning host worldwide in the laboratories involved in Streptomyces research. The laboratory of the John Innes Institute (Norwich, England) and our laboratory developed numerous phiC31 phage vectors that were successfully used for identification and cloning of genes responsible for synthesis of antibiotics from many antibiotic producing strains. In the course of these studies it was demonstrated that phage

vectors in many cases were unquestionably advantageous over plasmid-based vectors. Our laboratory also discovered and provided detailed characterization of the phage growth limitation system (Pgl). This Pgl system together with restriction and modification (RM) systems play imp ortant role in phage growth limitation in bacteria. Another important consequence of our studies of phiC31 is identification of its integrase enzyme that worldwide use now for transgenesis driven by its unic properties, efficiency, ease-of-use, and versatility.

Keywords: actinophage phiC31, Streptomyces lividans 66, Streptomyces coelicolor A3(2), phiC31 integrase, Pgl.

References

Ahlert J., Shepard E., Lomovskaya N., Zazopoulos E., Staffa A., Bachmann B.O., Huang K., Fon-stein L., Czisny A., Whitwam R.E., Farnet C.M., Thorson J.S. (2002) "The calicheamicin gene cluster and its iterative type I enediyne PKS", Science, vol. 297, pp. 1173-1176.

Alikhanian S.I., Ilyina T.S., Fomovskaya N.D. (1960("Transductioninactinomycetes", TVatare, vol. 188, pp. 245-246.

Bedford D.J., Faity C., Buttner M.J. (1995) "Two genes involved in the phase-variable phi C31 resistance mechanism of Streptomyces coelicolor A3(2)", Journal of Bacteriology, vol. 177, pp. 4681—4689.

Chater K.F. (1986) "Streptomyces phages and their applications to Streptomyces genetics", in: Queener S.E., Day F.E. (eds.) The Bacteria, vol. 9, Orlando, FF: Academic Press, pp. 119—158.

Chinenova T.A., Fomovskaia N.D. (1975) "Temperaturo-chuvstvitel'nye mutanty aktinofaga phiC31 Streptomyces coelicolor A3(2)" [Temperature-sensitive mutants of actinophage phiC31 Streptomyces coelicolor A3 (2)], Genetika, vol. 11, pp. 132—141.

Chinenova T.A., Mkrtumian N.M., Fomovskaia N.D. (1982) "Geneticheskoe izuchenie novogo priznaka rezistentnosti k fagu u shtamma Streptomyces coelicolor A3(2)" [Genetic study of a new evidence of phage resistance in Streptomyces coelicolor A3 (2) strain], Genetika, vol. 18, pp. 1945—1952.

Fogg PC., Colloms S., Rosser S., Stark M., Smith M.C. (2014) "New applications for phage integrases", Journal of Molecular Biology, vol. 426, pp. 2703—2716.

Hopwood D.A. (1999) "Forty years of genetics with Streptomyces from in vivo through in vitro to in silico", Microbiology, vol. 145, pp. 2183—2202.

Hopwood D.A. (2007) Streptomyces in Nature and Medicine. The Antibiotic Makers, Oxford: Oxford University Press.

Hoskinson PA., Sumby P., Smith M. (2015) "The phage growth limitation system in Streptomyces coelicolor A( 3)2 is a toxin / antitoxin system, comprising enzymes with DNA methyltransferase, protein kinase and ATPase activity", Virology, vol. 13, pp. 100-109.

Krasil'nikovN.A. (1950) Aktinomitsety — antagonisty iantibioticheskieveshchestva [Actinomycetes — antagonists and antibiotic substances], Moscow: Izd-vo AN SSSR.

Kuhstoss S., Rao R.N. (1991) "Analysis of the integration function of the Streptomycete bacteriophage phiC31", Journal of Molecular Biology, vol. 222, pp. 897—908.

Fomovskaya N.D., Chater K.F., Mkrtumian N.M. (1980) "Genetics and Molecular Biology of Streptomyces Bacteriophages", MicrobiogicalReviews, vol. 44, no. 2, pp. 206—229.

Fomovskaya N.D., Emelijanova F.K., Mkrtumian N.M., Alikhanian S.I. (1973) "The prophage behavior in crosses between lysogenic and nonlysogenic derivatives of S. coelicolor A3(2)", Journal of General Microbiology, vol. 77, pp. 455—463.

Fomovskaya N., Fonstein F., RuanX., Stassi D., Katz F., Hutchinson C.R. (1997) "Gene disruption and replacement in the rapamycin-producing Streptomyces hygroscopicus strain ATCC 29253 ", Microbiology, vol. 143, pp. 875-883.

Fomovskaya N., Hong S., Kim S., Fonstein F., Furuya K, Hutchinson C.R. (1996) "The Streptomyces peucetius drrC gene tncodes a UvrA-like protein involved in daunorubicin resistance and production", Journal of Bacteriology, vol. 178, pp. 3238—3245.

Lomovskaia N.D., Mkrtumian N.M., Gostimskaia N.L. ( 1970) "Poluchenie i svoistva Streptomyces coelicolor bakteriofaga" [Production and properties of Streptomyces coelicolor bacteriophage], Genetika, vol. 6, pp. 135-137.

Lomovskaya N.D., Mkrtumian N.M., Gostimskaya N.L., Danilenko V.N. (1972) "Characterization of temperate actinophage phiC31 isolated from Streptomyces coelicolor A3(2)", Journal of Virology, vol. 9, pp. 258-262.

Lomovskaya N., Otten S.L., Doi-Katayama Y., Fonstein L., LiuX., Lakatsu L, Inventi-Solari A., Filippin F., Lorti F., Colombo A., Hutchinson C.R. (1999) "Doxorubicin overproduction in Streptomyces peucetius: cloning and characterization of the tfwi/ketoreductase and clnrVgenes and the doxA cytochrome P-450 hydroxilase", Gene, vol. 181, pp. 305—318.

Lomovskaya N.D., Sladkova I.A., Klochkova O.A., Orekhov A., Chinenova L.A., Mkrtumian N.M. (1983) "Genetic approaches to the development of phage cloning vectors in Streptomyces", in: Ikeda Y., BeppuL. (eds.) Genetics of Industrial Microorganisms, Lokio: Radansha Lid., pp. 66—70.

Lomovskaya N.D., Voeykova LA, Mkrtumian N.M., Emelyanova L.K. (1986) "Lhe role ofphiC31 actinophage in genetic-selection studies of Streptomyces", in: Alacevic M., Hranueli D., Loman Z. (eds.) Fifth International Symposium on the genetics of Industrial Microorganisms, Split, Jugoslavia, Zagreb: Pliva, pp. 499-505.

Mkrtumian N.M., Lomovskaia N.D. (1972) "Mutatsiia, vliiaiushchaia na sposobnost' umeren-nogo aktinofaga phiC31 Streptomyces coelicolor k lizisu i lizogenizatsii" [Mutation that affecting the ability of the mild actinophage phiC31 Streptomyces coelicolor to lysis and lysogenization], Genetika, vol. 8, pp. 135-141.

Novikova N.L., Kapitonova O.N., Lomovskaia N.D. ( 1973) "Lermoinduktsiia profaga v prorastai-ushchikh sporakh Streptomyces coelicolor A3(2) (phiC 31 ctsl )" [Lhermoinduction of prophage in germinating spores of Streptomyces coelicolor A3 (2) (phiC31 ctsl)], Mikrobiologiia, 1973, vol. 42, pp. 713—718.

Sladkova I.A., Chinenova L.A., Lomovskaia N.D., Mkrtumian N.M. ( 1979) "Geneticheskaia khara-kteristika i struktura genomov aktinofagov Streptomyces coelicolor A3(2)" [Genetic characteristics and structure of genomes of actinophages Streptomyces coelicolor A3 (2)], Genetika, vol. 11, pp. 1953—1962.

Sladkova I.A., Vasil'chenko L.G., Lomovskaia N.D., Mkrtumian N.M. (1980) "Fizicheskoe kar-tirovanie Streptomyces coelicolor A3( 2) aktinofagov. I. Lokalizatsiia s-oblasti aktinofaga phiC 31" [Physical mapping of Streptomyces coelicolor A3 (2) actinophages. I. C-region's localization of actinophage phiC31], Molekuliamaia biologiia, vol. 14, pp. 910—915.

Sladkova I.A., Chinenova L.A., Vasil'chenko L.G., Pel'ts L.V., Lomovskaia N.D. ( 1980) "Fizicheskoe kartirovanie Streptomyces coelicolor A3(2) aktinofagov. II. Lranspozono podobnaia struktura phiC43 DNK, lokalizatsiia oblasti, otvetstvennoi za ustanovlenie lizogennogo sostoianiia" [Physical mapping of Streptomyces coelicolor A3 (2) actinophages. II. Lransposon-similar structure of phiC43 DNA, and localization of the region responsible for establishing the lysogenic state], Molekuliamaia biologiia, vol. 14, pp. 916—921.

Sladkova I.A., Klochkova O.A., Chinenova LA., Lomovskaia N.D. (1984) "Fizicheskoe kartirovanie Streptomyces coelicolor A3(2) aktinofagov. VII. Obrazovanie deletsii v oblasti vstavki faga phiC43" [Physical mapping of Streptomyces coelicolor A3 (2) actinophages. VII. Formation of deletions in the region of insertion of phage phiC43], Molekuliamaia biologiia, vol. 18, pp. 497—503.

Smirnova E.L., Novikova N.L. (1976) "Vnutrikletochnyi rost aktinofaga v shtamme Streptomyces lividans lizogennom po temperaturoindutsibernomu mutantu" [Intracellular growth of the actinophage in the Streptomyces lividans strain, lysogenic for the temperature-inducible mutant], Mikrobiologiia, vol. 45, pp. 531-534.

Suares J.I., Caso J.L., Rodrigues F., Hardisson C. ( 1984) "Structural characteristics of the Streptomyces bacteriophage phiC31", FEMS Microbiolology Letters, vol. 22, pp. 113-117.

Vasil'chenko L.G., Mkrtumian N.M., Lomovskaia N.D. (1981) "Geneticheskoe kartirovanie i kharakteristika deletsionnykh mutantov aktinofaga phiC31, defektnykh v lizogenizatsii " [Genetic mapping and characterization of deletion mutants of actinophage phiC 31 that are defective in lysogenization], Genetika, vol. 17, pp. 1967-1974.

Voeikova L.A., Lomovskaia N.D. (1976) "Mezhvidovaia gibridizatsiia v rode Streptomyces. Metody polucheniia i svoistva rekombinantov mezhdu shtammami Streptomyces coelicolor A3(2) and S. griseus

Kr.15" [Interspecific hybridization in the Streptomyces genus. Methods of preparation and properties of recombinants between strains of Streptomyces coelicolor A3 (2) and S. griseus Kr.15], Genetika, vol. 12, pp. 196-213.

Voeikova T.A., Slavinskaia E.V., Orekhov A.V., Lomovskaia N.D. (1979) "Identifikatsiia sistem restriktsii i modifikatsii v shtammakh Streptomyces" [Identification of restriction systems and modification in strains of Streptomyces], Genetika, vol. 15, pp. 1746—1757.

Wohlert S.E., LomovskayaN., KulovskiK, FonsteinL., Occi J., GewainK, Mac Neil D., Hutchinson C.R. (2001 ) "Insights about the biosynthesis of the avermectin deoxysugar 1-oleandrose through heterologous expression of Streptomyces avermitilis deoxysugar genes in Streptomyces lividans", Chemistry & Biology, vol. 8, pp. 681—700.

AD MEMORIAM

НАД РАДУГОЙ...

Рудольф Владимирович Камелин (12 августа 1938 г. — 1 апреля 2016 г.)

«...Если задуматься, почему столь часто тянет меня на эпитеты "огромный", "грандиозный"... и т.п., то, пожалуй, дело не в бедности ходовой лексики, или "manía grandiosa", а — объективно, это связано с иными методами передвижения. Ведь я, человек, видящий мир с ГАЗ-бб, в день рядовым порядком пересекавший 300-400 км (а при напряжении и до 1000)... Или пролетающий за день 3000-4000 км (overThe Rainbow)... Несравнимо совершенно с конским ходом (или пешком по 20-30 км)...»

Эту рукописную вставку, почти эпиграф, Р.В. Камелин сделал на полях работы «К истории пустынного комплекса видов флоры Центральной Азии» — введение в книге «Пустыни Заалтайской Гоби» (1988, с. 6—14). Прокомментирую, что "over The Rainbow" ("над радугой") — строка из баллады американского фильма-мюзикла «Волшебник страны Оз». Исполненная Джуди Гарленд в 1938 г., эта песня стала одной из популярнейших мелодий XX века. В том же 1938 г., 12 августа, в г. Перми родился Р.В. Камелин.

С уходом Рудольфа Владимировича Камелина российская ботаника потеряла выдающегося лидера. Рудольф Владимирович возглавлял многие научные подразделения и организации. Он был президентом Русского Ботанического общества, главным редактором «Ботанического журнала», заведующим отделом «Гербарий высших растений» Ботанического института им. B.J1. Комарова РАН. Он был членом-корреспонден-том Таджикской АН (1987), членом-корреспондентом Российской АН (1990), заслуженным деятелем науки и профессором. О Рудольфе Владимировиче немало написано его коллегами1. Его ученики (бывшие аспиранты и докторанты) работают во многих

1 Новиков В. С., Губанов И.А., Тихомиров В.Н., Павлов В.Н. Камелин Рудольф Владимирович (к 60-летию со дня рождения) // Бюл. МОИП. Отд. Биол. 1997. Т. 103. С. 67—72; Чернева О.В., Сытин А.К. Рудольф Владимирович Камелин (к 60-летию со дня рождения) // Ботанический журнал. 1998. Т. 83. № 8. С. 133—148; Дорофеев ВН., Крушина ЛИ. Рудольф Владимирович Камелин (к 75-летию со дня рождения) // Ботанический журнал. 2013. Т. 98, № 9. С. 1176—1179;