CC BY
375
13. Brännström M., Johannesson L., Dahm-Kähler P. et al. First clinical uterus transplantation trial: a six-month report. Fertil. Steril. 2014; 101 (5): 1228-1236. doi: 10.1016/j.fertnstert.2014.02.024. Epub 2014 Feb 27.
14. ErmanA.M., Ozkan O., Aydinuraz B. et al. Clinical pregnancy after uterus transplantation. Fertil. Steril. 2013; 100 (5): 1358-1363. doi: 10.1016/j. fertnstert.2013.06.027. Epub 2013 Jul 3.
15. Гайворонский И.В., Дубинин А.А., Ничипо-рук Г.И. Горячева И.А. Первый в России кадавер-курс по 3D-анатомии малого таза / Всероссийская юбилейная научная конференция, посвященная 220-ле-
тию со дня основания кафедры нормальной анатомии Военно-медицинской академии «Достижения морфологических наук на современном этапе». СПб.: ВМА, 2018. [Gaivoronsky I.V., Dubinin A.A., Nichiporuk G.I. Goryacheva I.A. Pervyi v Rossii kadaver-kurs po 3D-anatomii malogo taza. (Conference proceedigs) Vserossiiskaya yubileinaya nauchnaya konferentsiya, posvyashhennaya 220-letiyu so dnya osnovaniya kafedry normal'noi anatomii Voenno-meditsinskoi akademii «Dostizheniya morfologicheskikh nauk na sovremennom etape» St. Petersburg:VMA; 2018. (In Russ.)]
УДК 616. 619: 576 DOI 10.24411/2220-7880-2020-10137
ИСТОРИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ ТРИХИНЕЛЛЕЗА (ОБЗОР)
1,2Жданова О.Б., 1Руднева О.В., Написанова Л.А., Макарова Н.А., 1,2,3Окулова И.И.
'ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений им. К.И. Скрябина» - филиал НИИЦ ВИЭВ им. К.И. Скрябина и Ф.П. Коваленко, Москва, Россия (117218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, 28), e-mail:oliabio@yandex.ru 2ФГБОУ ВО Кировский государственный медицинский университет Минздрава России, Киров, Россия (610998, г. Киров, ул. К. Маркса, 112),
3ФБГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт охотничьего хозяйства и звероводства им. проф. Б.М. Житкова», Киров, Россия (610000, г. Киров, ул. Преображенская, 79)
В статье представлен обзор литературы и собственные исследования в области иммунопрофилактики трихинеллеза. Трихинеллез является одним из самых опасных гельминтозоонозов. Анализ различных методов диагностики в гельминтологии указывает на возрастающее внимание к борьбе c данным зоо-нозом в Европе и России. Задача данной работы заключалась в оценке основных технологий получения антигенов для диагностики и иммунопрофилактики гельминтозооноза. Также был проведен анализ современных антигенов, иммуностимуляторов и схем профилактики трихинеллеза. Противотрихинел-лезная вакцина обычно содержит антигенные компоненты, активные в отношении взрослых гельминтов и личинок, производится из дезактивированных форм Trichinella spiralis (T. spiralis), секреторных антигенов или одного из поверхностных белков. Они стимулируют иммунную систему организма распознавать патогенный агент (T. spiralis) как угрозу с последующей элиминацией. Вакцины, разработанные на основе комплекса иммунобиологических компонентов, могут быть наиболее перспективными и эффективными в системе профилактики. Иммунопрофилактические препараты совместно с санитарно-эпидемиологическими мероприятиями создадут условия для снижения частоты распространения трихинеллеза. Также сохраняется актуальной проблема разработки современных диагностических технологий.
Ключевые слова: гельминтозооноз, трихинеллез, антиген, иммуностимуляторы.
HISTORICAL BACKGROUND AND CHALLENGES OF TRICHINELLOSIS IMMUNOPROPHYLAXIS (REVIEW)
1,2Zhdanova O.B., 1Rudneva O.V., 1Napisanova L.A., 2Makarova N.A., 1,2,3Okulova I.I.
1All-Russian Scientific Research Institute of Parasitology of Animals and Plants Scientific Center - branch of VIEV named after Skryabin and Kovalenko, Moscow, Russia (117218, Moscow, Bolshaya Cheremushkinskaya St., 28), e-mail: oliabio@yandex.ru
2Kirov State Medical University, Kirov, Russia (610998, Kirov, K. Marx St., 112)
3Kirov Research Institute of hunting and fur farming, Kirov, Russia (610000, Kirov, Preobrazhenskaya St., 79)
The article presents the results of literature analysis and the research in the field of Trichinellosis immunoprophylaxis. Trichinellosis is one of the most dangerous helminthozoonosis. Analysis of different methods of diagnostics in helminthology suggests increased attention to fighting with zoonotic diseases, including trichinellosis, in Europe and Russia. Our research is aimed at diagnosis and preventive immunization of helminthozoonosis. Also we have analyzed types of new antigens and possibility of using immunostimulators in trichinellosis prevention. A vaccine against trichinosis typically contains an agent that resolves a disease-causing helminth and its larvae and is often made from desactivated forms of the T. spiralis, its secretory antigens or one of its surface proteins. The agent stimulates the body's immune system to recognize the agent as threat, destroy it, and to further recognize and destroy any of the pathogenic agents associated with T.spiralis
that it may encounter. ^e use of Immunostimulants during vaccination causes less intensive reproduction of Trichinella. Тherefore, vaccines based on complex immune preparations can be the most important implementations in prophylaxis system. However, it should be born in mind that vaccination alone cannot achieve significant success in preventing this disease and radically reducing its incidence. Therefore, all other measures to combat trichinosis, especially new diagnostic methods, remain relevant.
Keywords : helminthozoonosis, trichinellosis, antigens, immunostimulators.
Трихинеллез, возбудителем которого являются нематоды рода Trichinella, относится к одному из наиболее опасных паразитозов, широко распространенных во всех климатических поясах. Этот опасный гельминтоз человека и животных вызывается гельминтами: Trichinella spiralis (spiralis), Trichinella spiralis (nativd) и Trichinella pseudospiralis. В Российской Федерации инвазия распространена среди 56 видов млекопитающих. В настоящее время большинство случаев трихинеллеза у человека в РФ регистрируется на Северном Кавказе и арктических побережьях, что связано в первую очередь с особенностями национальной кухни. В Арктике местное население использует в пищу кольпахен (копальхем, игунак), приготовленный без термообработки из сырого мяса [1-3]. Национальные блюда нганасан, чукчей, ненцев, энцев, эскимосов готовят из моржа, тюленя, оленя (ненецкий, чукотский, эвенкийский вариант), кита (эскимосский вариант). Из-за образования в процессе приготовления трупного яда и наличия личинок трихинелл, длительное время сохраняющихся в разлагающемся мясе, данный деликатес смертельно опасен для представителей большинства других народностей [4, 5]. Население Северного Кавказа, не употребляющее сырое мясо, чаще всего заражается при употреблении недожаренных шашлыков и вяленого мяса. И хотя в центральных районах РФ и в целом в Европе заболеваемость резко снизилась, большое влияние трихинеллеза на экономику и здоровье населения признаны Комитетом Экспертов ВОЗ, так как статистические отчеты с каждым годом отмечают увеличение числа случаев заболевания. При высоком уровне инвазии нередко наступает летальный исход
[1, 6, 7].
В данной ситуации возникает проблема разработки мер профилактики и лечения гельминтозооно-за в качестве одного из приоритетных направлений паразитологии. Проведение химиотерапии во время мышечной стадии всегда сопровождается большими дозами химических препаратов и ограниченным периодом их применения, они эффективны лишь до формирования соединительнотканной капсулы вокруг мигрировавших в мышцы личинок, кроме того, большинство этих препаратов являются токсичными. Одним из значимых направлений профилактики трихинеллеза может быть применение специфического паразитарного антигена, полученного из трихинелл с иммунопрофилактической целью. Исследования в области иммунопрофилактики гельминтозов ведутся на протяжении многих лет, как в нашей стране, так и за рубежом. Однако в настоящее время существует множество ограничений, препятствующих широкому внедрению вакцинаций при паразитозах.
В вакцинопрофилактике трихинеллеза, как и большинства паразитарных болезней, помимо получения оптимальных антигенов для вакцинации становится особенно важным выбор адъюванта. Поэтому при паразитозах предъявляется ряд требований
к проведению исследований по изучению иммунно-генных свойств вакцины с адъювантом. Необходимы сравнительные исследования, направленные на подбор адъюванта и различные схемы вакцинации. Экспериментальная модель трихинеллеза позволяет достаточно точно оценить защитный эффект по количеству личинок. А также позволяет изучить эффективность иммуностимулирующих препаратов по протективному механизму без использования антигенов и разработать схемы проведения вакцинации с оценкой интенсивности и длительности вызванного иммунного ответа. Известно достаточное количество публикаций о применении вакцин на лабораторных моделях, однако многие из них, в частности, вакцина на базе автоклавированных личинок трихинелл (ATSLV), вызывала непредсказуемую реакцию, вплоть до анафилактического шока на последующее экспериментальное заражение T. spiralis [8]. Тем не менее, исследователи отмечали достоверное снижение количества личинок трихинелл у вакцинированных животных при экспериментальном заражении. Защита от трихинеллеза достигалась также путем введения рекомбинантного белка (rTs-Adsp) [9]. По данным X. Li еt al [10], при иммунизации мышей линии BALB/c этим белком в сочетании с адъювантом наблюдалось снижение количества личинок трихинелл в мышцах при проверочном заражении на 46,5% по отношению к контрольной группе. Установлено, что применение рекомбинантного белка TspSP - 1,3 Т. spiralis в качестве вакцинирующего препарата вызывает сокращение в мышцах массы личинок у 39% мышей по отношению к контрольной группе.
Первые попытки получения антигенов были предприняты в начале ХХ столетия, чему предшествовали разработки получения простых экстрактов из различных гельминтов. Впервые экстракты из личинок трихинелл начали получать в 1911 г. Первые антигены трихинелл представляли собой грубые экстракты мышечной ткани животных, зараженных трихинеллезом, или экстракты декапсулированных, но не очищенных от мышечных белков, личинок трихинелл. Аналогичные исследования провели независимо друг от друга М.И. Романович (1911) и Н. Strobel (1911) [11]. Эффективность указанных антигенов в диагностике была очень низкой. При попытке введения их в организм нередко возникал анафилактический шок. Постепенно исследователи научились получать очищенные культуры личинок трихинелл и других гельминтов, а также расширился спектр их применения. Однако основным назначением их получения оставалась диагностика. Именно слабая чувствительность экстрактов, содержащих примеси белков хозяина и малое количество специфических антигенов, явилась причиной для G.W. Bachman (1928) заняться разработкой методов очистки личинок от примесей и изысканием новых экстрактов и режимов экстракции специфических антигенов. Методы экстракции использовались и для получения
активных компонентов вакцин. G.W. Bachman впервые в паразитологии применил методику получения экстракта с помощью эфира [12]. A. Trawinski (1934) и I. Maternivska (1933) установили, что, несмотря на огромный спектр выделенных веществ, антигены, экстрагированные физиологическим раствором, дают наиболее точные реакции, в то время как обработка их эфиром и фенолом приводит к возникновению ложноположительных реакций, так как не дезактивируются антигенные детерминанты, общие с другими паразитами и микроорганизмами. Опыты по использованию в иммунологических реакциях и вакцинации цельных экстрактов гельминтов различных методов очистки убедили абсолютное большинство исследователей в необходимости очистки антигенов от балластных веществ (липидов, некоторых полисахаридов и белков), приводящих к тяжелым аллергическим реакциям [13].
В дальнейшем антигенные свойства фракций трихинелл выявляли L.R. Melcher с соавт. (1943), в кислоторастворимой белковой фракции, а также достаточно чистым оказался обезжиренный экстракт личинок трихинелл по E.F. Chaffe et al. (1954) [1415]. Нативный антиген был впервые получен в 1962 году E.H. Sadun et al., который в дальнейшем использовали для серологической диагностики трихинеллеза. Но приготовленный таким образом антиген оказался нестабильным. В 1963 году R.K.Baratawidjaja et al. частично видоизменили антиген. Они декап-сулировали и фиксировали личинки на предметных стеклах фламбированием. Ими разработана методика флуоресцирования кутикулы трихинелл и поставлена реакция иммунофлуоресценции (РИФ) [16]. Позднее, используя РИФ для определения локализации антигенов в личинках трихинелл, E. Engelbrechtand и E.H. Kampelmacher (1965) окончательно установили, что кутикула является местом локализации антигена и соответственно местом связывания антител. Кутикулу можно широко использовать в диагностике и вакцинации. Также применение экскреторно-секреторных антигенов (ЕСА) достаточно перспективно. Ряд наблюдений по преципитации на живых трихинеллах in vitro (Е.А. Mauss, 1940) убедил многих исследователей в целесообразности использования в качестве антигена экскреторно-секреторных продуктов личинок трихинелл или метаболического антигена. В начале использования ЕСА М. Murell et al. (1986) получили невысокую чувствительность (93-96%), и еще меньшую специфичность (92-96%), причем большая часть ложноотрицательных ответов была при интенсивности инвазии ниже 5 личинок в 1 грамме мышц. Дальнейшие исследования способов очистки экскреторно-секреторных антигенов показали возможность их применения при условии возможности защиты от паразитарного и бактериального обсеменения питательных сред и соблюдения оптимальных параметров культивирования трихинелл [17]. В вакцинации экскреторно-секреторные антигены применяли единичные исследователи. В РФ они практически не получили широкого применения, так как низкая диагностическая эффективность иммуноферментного анализа (ИФА) с ЕСА при трихинеллезе была получена О.Г. Полетаевой с соавт. (1986). Авторы установили, что ИФА с антигеном в виде кислоторастворимой белковой фракции показала чувствительность 92,8%, а специфичность - 92%, в то время как с ЕСА - 77,6% и 89% [18]. А.Ф. Костецкий и Ю.И. Васерин (1992)
разработали способ получения культурального ЕСА трихинелл (А.с. СССР № 1493260), который можно использовать в различных иммунодиагностических тестах при трихинеллезе. По данным авторов, этот антиген обладает большей специфичностью, чем коммерческий. Однако в вакцинации его не применяли, и в целом антиген использовался крайне редко [19]. Производство ЕСА трихинелл также затруднено тем, что культивирование больших (2,0-2,5х 10000 личинок/мл) концентраций мышечных трихинелл в искусственных питательных средах уже через 30 часов приводит к массовой (до 50%) их гибели при содержании белка в культуральных средах не более 30-50 мкг/мл (А.С. Бессонов, 2000)[20]. Загрязнение среды культивирования продуктами распада погибших трихинелл значительно снижает специфичность ИФА и вызывает осложнения при вакцинации. Поэтому в настоящее время предпринимаются различные попытки разработок технологичных способов получения ЕСА трихинелл с использованием генной инженерии, дополнительных воздействий и очистки антигена. Помимо вышеперечисленных антигенов в иммунодиагностике и профилактике трихинеллеза использовались самые различные антигены: гисто-срезы мышц, инвазированных личинками трихинелл или живых декапсулированных и лиофилизирован-ных личинок. Диагностическую реакцию с данными антигенами широко применяли для выявления трихинеллеза человека и животных (E.J. Ruitenberg et al., 1972; E.J. Ruitenberg and E.H. Kampelmacher,1970; K.Chroust, V. Dubansky, 1967,1970; Z.Kozar et al., 1966; M. Kozar and Z. Kozar, 1970; P. Wehesaetal., 1971) [21-23].
В нашей стране особенности кутикулярных и личиночных антигенов изучал С.Н. Белозеров (19962000) при сравнении диагностической эффективности иммунных реакций [24]. Применение неочищенного антигена из личинок трихинелл позволяет отобрать животных, свободных от инвазии T. spiralis для формирования контрольных групп. Для изготовления вакцин при экспериментальном моделировании инвазии и в доклинических исследованиях он не используется из-за выраженных аллергических реакций [24, 25].
Совершенствование методов очистки антигенов было ключевой задачей целого ряда исследований в иммунопрофилактике трихинеллеза. И.И. Бенедиктов, Л.Н. Липатова (1992-1996) применили моноклональные антитела, полученные путем гибридизации клеток селезенки иммунной мыши и клеток мышиной миеломы линии P3-X63-Ag 8.653, для очистки диагностических антигенов трихинелл. Степень очистки составила 90%. Проверка очищенного антигена в постановке ИФА показала высокую диагностическую эффективность (чувствительность 100%, специфичность 98%). При оценке антигена, полученного с помощью моноклональных антител (МКАТ), при исследовании 90 сывороток свиней, в т.ч. инвазированных аскаридозом, эхинококкозом и тенуикольным цистицеркозом, установили, что чувствительность испытуемого антигена составила 100%, а специфичность 90,36%. В опытах по сравнению цельного экстракта трихинелл и фракционированного (вторая фракция) с антигеном, очищенным с использованием моноклональных антител выявили, что чувствительность и специфичность очищенного антигена не уступает фракции 2 и значительно пре-
вышает активность цельного экстракта [26]. Это исследование положило начало использованию антигенов, полученных с помощью МКАТ в РФ, однако наиболее удобным в получении и использовании был фракционированный антиген в модификации Всероссийского института гельминтологии им. К.И. Скрябина (ВИГИС). В 2000 г. Н.В. Шеховцов с соавт. провели сравнительные испытания антигенов производства АРТЕ (США) и ВИГИС в ИФА для прижизненной диагностики трихинеллеза. Доказали, что антигены могут использоваться для сероэпизоотоло-гических и сероэпидемиологических исследований [27, 34].
Таким образом, известны многочисленные способы получения антигенов трихинелл с использованием традиционных физико-химических методов, но наиболее целесообразно применение в иммунопрофилактике высокоочищенных антигенов. Метод гельфильтрации по W. Magat (1976) в модификации ВИГИС достаточно эффективный [28]. Он включает выделение гельминтозного материала от лабораторных белых крыс, инвазионных личинок трихинелл, их механическое измельчение, экстрагирование белка - антигена в буферном растворе и очистку полученного экстракта от неспецифических белковых примесей, которые снижают эффективность диагностических антигенов, а при изготовлении профилактических вакцин могут вызывать аллергические реакции. Очистка проводится с использованием гель-фильтрации на сефадексе G-200, в результате которой происходит разделение смеси экстракта на белковые фракции, причем в диагностике используется обычно фракция, обладающая достаточной чувствительностью и специфичностью. Можно проводить фракционирование с использованием других гелей, например, Тойоперл HW-50, который также позволяет в достаточной степени очищать экстракт от неспецифических белковых примесей. Для получения ЭСА необходимо провести значительное усовершенствование культивирования личинок: к питательной среде ДМЕМ добавить 20 мкл/мл 1,5% раствора L-глутамина и 2 мкл/мл 4% раствора ген-тамицина с уплотненным посевом 35-40 тысяч личинок/мл в стерильных условиях при постоянном газовом составе с содержанием СО2 - 5%, влажности 70% и температуре 37°С в течение двух суток со сменой среды один раз в сутки. Данный способ быстрого получения антигенов трихинелл, основанный на использовании питательных сред, обеспечивает лучшие условия выживания личинок трихинелл в процессе культивирования. Антиген от наиболее близких по способу получения ЕСА отличается тем, что используются дополнительные приемы, которые в совокупности улучшают жизнеспособность и условия жизнедеятельности личинок трихинелл, повышается плотность посева личинок и, в конечном итоге, выход белка-антигена. Так, например, переваривание (пептолиз) фарша из тушек крыс в искусственном желудочном соке с уменьшенной по времени экспозицией с целью выделения личинок, обеспечивает их жизнеспособность. Смена питательной среды при 48-часовом культивировании 1 раз в сутки на эквивалентную порцию свежей полноценной среды и культивирование в стерильных условиях в СО2-инкубаторе, поддерживающем постоянный газовый состав среды, предотвращают загрязнения. А использование обогащенной среды ДМЕМ позволяет
обеспечить более стабильные и благоприятные условия для поддержания процессов жизнедеятельности личинок в ходе культивирования, что выражается в меньшем проценте отмирания их и незначительной контаминации антигена продуктами распада. В то же время, данная методика позволяет увеличить конечный выход антигенспецифических белков в 4 раза. Таким образом, при использовании современных технологий получаемые антигены имеют достаточно высокую очистку и обладают иммуногенными свойствами [26-28].
Выбор адъюванта имеет важное значение в профилактике. Помимо простых химических веществ и растительных форм (сапонины) в последнее время в качестве адъювантов в паразитологии активно выступают цитокины (эндогенные или рекомбинантные), липосомы, виросомы, микрокапсулы и некоторые белковые носители в составе конъюгированных вакцин. Адъюванты обеспечивают более выраженный иммунный ответ путем формирования «депо» антигена, замедлением его всасывания; защитой антигена от деградации и элиминации; а также активацией компонентов системы врожденного и приобретенного иммунитета. Поэтому в паразитологии часто применяются иммуностимуляторы. Причем чаще всего при гельминтозах адъюванты должны стимулировать клеточный иммунитет.
Необходимо отметить, что в последние годы возрос интерес к применению иммуностимулирующих препаратов при гельминтозах, как в лечебно-профилактических целях, так и в научных исследованиях. Использование иммуностимуляторов различного происхождения повышает реактивность по отношению к специфическим паразитарным антигенам и усиливает сопротивляемость организма, в итоге приводит к снижению, а в некоторых случаях и полному предотвращению заражения гельминтами. Эти лекарственные средства, обладающие иммунотропной активностью, также в терапевтических дозах восстанавливают координированную работу звеньев иммунной системы, функционирование которой, как правило, разбалансировано при гельминтозах. Иммуностимуляторы начали применяться в гельминтологии сравнительно недавно, поэтому взгляды и мнения на их применение в составе профилактических препаратов на сегодняшний день противоречивые. Известно, что препараты из группы синтетических иммуностимуляторов, полученных путем направленного химического синтеза (левамизол), ранее использовались в терапии трихинеллеза, а в настоящее время иногда включаются как компоненты комплексных препаратов для его профилактики. Однако при применении иммуностимуляторов в лечении трихинеллеза развивались побочные эффекты. За последнее десятилетие подробно изучены этапы иммунного ответа при гель-минтозах, разработаны новые препараты для коррекции иммунных патологий. Так, например, цитокины с успехом используются в современной паразитологии, как и синтетические соединения их индукторов (индукторы интерферонов). Наиболее распространенным иммуностимулятором этого типа, применяющимся в паразитологии, является интерферон 2а [29]. Проведенный анализ доступной отечественной и зарубежной литературы по российскому и зарубежному рынку иммуностимуляторов, выявил, что наиболее эффективны для профилактики трихинеллеза и привлекательны в ценовом диапазоне препараты:
азоксимера бромид (синтетический препарат), рон-колейкин (рекомбинантный ИЛ 2), нуклеинат натрия (биологического происхождения). Вышеуказанные препараты, относящиеся к разным группам, проверялись в условиях эксперимента на лабораторных моделях в качестве иммуностимуляторов при экспериментальном трихинеллезе в его лечении и профилактике. К иммуностимуляторам биологического происхождения кроме нуклеината натрия, относятся препараты, полученные из бактерий и грибов (про-дигиозан, субалин, рибомунил, и др.), которые обладают способностью усиливать функциональную активность нейтрофилов и макрофагов при гельмин-тозах. F. Martinez-Gomez et al. [30] указывают, что введение внутрь культур Lactobacillus casei в течение 6 недель вызывает полную защиту против заражения трихинеллами в условиях небольшого количества личинок. Протективное действие иммуномодулято-ра ронколейкина (в пределах 40%) установлено при эхинококкозе собак и в лабораторных исследованиях у крыс Wistar при трихинеллезе в общепринятых дозах заражения. Также имеются данные о защитном действии иммуномодуляторов: азоксимера бромид, циклоферона и ронколейкина при экспериментальном трихинеллезе лабораторных беспородных белых мышей [31-32]. Предыдущими исследованиями на модели экспериментального альвеолярного эхино-кокоза установлено протективное действие иммуностимулирующего препарата риботан в комплексе с клеточным антигеном протосколексов Echinococcus multilocularis, дальнейшее применение имунофана в качестве иммунотерапевтического средства в комбинированной иммунотерапии при лечении эхинокок-коза было успешным [32]. Учитывая высокую эффективность применения имунофана при элиминации паразитов, О.В. Руднева с соавторами (2016-2018 гг.) изучила эффективность комплексного биопрепарата на основе соматического антигена трихинелл (СЭТ) и иммуномодулятора имунофан в схеме профилактики трихинеллеза. Исследование было лаборатор-но-рандомизированным и плацебо-контролируемым: использованы препараты соматического экстракта личинок трихинелл в дозе 40 мкг/мышь и иммуностимулятор имунофан, доза которого составила 1 мг/ мышь. Препараты вводились в 0,2 мл стерильного физиологического раствора дважды внутримышечно с интервалом 48 часов. Для заражения подопытных мышей использовались личинки T. spiralis в дозе 30±5 личинок/мышь (культура ВИГИС), заражение проводилось через 40 дней после последнего введения иммунных препаратов. В итоге при подсчете обнаруженных личинок трихинелл у каждой мыши в группе была определена протективная эффективность (путем подсчета количества живых личинок у животных различных групп).
Эффективность препарата (ЭП) рассчитывалась по формуле:
ЭП% (уменьшение) =(N1- N2)/N1 x 100
N1: среднее геометрическое числа живых личинок T. spiralis в контрольной группе;
N2: среднее геометрическое числа живых личинок T. spiralis в терапевтической группе.
Животные, получавшие комплексный препарат, оказались менее всего подвержены инвазии, среднее геометрическое число обнаруженных у них личинок
трихинелл было в 2,6 раза меньше по сравнению с контрольной группой, получавших плацебо. В целом, протективная эффективность комплексного препарата составила 61,98%, имунофана - 31,42%.
Для подтверждения предположения об эффективности иммуностимуляторов при вакцинации против трихинеллеза проводился цикл опытов. Оценка протективных свойств разработанного комплексного иммунопрепарата на лабораторных моделях при трихинеллезе осуществлялась по определению интенсивности инвазии в постмортальных исследованиях всех групп мышц животного. Вводили следующие иммунностимуляторы: ронколейкин, нуклеинат натрия и азоксимера бромид белым мышам (группы формировали по 10 голов) в соответствующих дозах. В контрольный группе животных применяли физиологический раствор. Через двое суток (48 часов) после последнего введения препарата мышей заражали инвазионными личинками трихинелл в дозе 80 г/животное одновременно с контрольной группой. Убой всех мышей проводили через 45 дней, их тушки подвергали перевариванию в искусственном желудочном соке каждую в отдельности и подсчитывали количество личинок трихинелл. В результате в группе вакцинированных мышей, получавших ронколейкин, выявлено наименьшее количество личинок трихинелл на одно животное, по сравнению с группами особей, принимавших нуклеинат натрия и полиокси-доний, что свидетельствовало о менее эффективной защите. В то же время в контрольной группе выделили в среднем 4485,8+430,6 личинок, что соответствует классической интенсивности инвазии при дозе заражения 80 г/животное. В итоге, протективный эффект ронколейкина составил 80, 6% , у препаратов на основе полиоксидония - 61,98%, нуклеината натрия - 20% [31-33]. Учитывая вышесказанное, препараты имунофан, ронколейкин, азоксимера бромид можно использовать в комплексной иммунопрофилактике трихинеллеза. Оценка эффективности препаратов по ИИ (количеству личинок трихинелл в мышцах) достаточно удобна для математических вычислений. Помимо паразитологической оценки проводили мор-фофункциональные исследования, которые также указывали на эффективность вакцинопрофилактики комплексными препаратами [31-33]. В отработке схем введения учитывали как соотношения доза-ответ в комбинации различных доз адъюванта с различными дозами антигена вакцины, так и тип и интенсивность иммунного ответа.
В итоге данные литературы и результаты ряда собственных паразитологических исследований экспериментальных животных (ИИ, патоморфологи-ческие исследования и др.) свидетельствуют о том, что при использовании иммуностимуляторов в вак-цинопрофилактике, происходит менее интенсивное размножение трихинелл и заселение мышц личинками. Поэтому для повышения эффективности профилактики и лечения трихинеллеза целесообразно осуществлять более активное использование этих препаратов.
Заключение
Таким образом, при разработке профилактических мероприятий по борьбе с трихинеллезом вакцинация должна занять соответствующую позицию, что позволит повысить эффективность существующей борьбы с трихинеллезом. Разработка методов
профилактики на основе комплексных вакцинных и иммуностимулирующих препаратов может стать эффективными мерами предупреждения развития гельминтозов в совокупности с своевременной диагностикой заболеваний и соблюдения санитарно-эпидемиологического режима [1, 6, 35]. Особенно важно совершенствовать методики получения антигена, которые планируется использовать как для вакцинации, так и для диагностических тест-систем.
Необходимо рекомендовать коррекцию мероприятий по борьбе с трихинеллезом с учетом особенностей эпизоотического процесса [1, 5, 7], для прижизненной диагностики трихинеллеза применять наиболее эффективные методы: иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг и др. Особое внимание уделять обеззараживанию туш инвазированных животных и остатков мышечной массы после мездрения шкур. Совершенствование диагностических мероприятий и вакцинации в профилактике паразитозов способствует уменьшению числа заражения человека и животных, сокращению экономических затрат. Борьба с трихинеллезом имеет не только биологическое, но и социально-экономическое значение.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии явного или потенциального конфликта интересов, связанного с публикацией статьи.
Исследование проведено в рамках Грантовой программы ФГБОУ ВО Кировский ГМУ Минздрава России «Университетский научный грант», проект № ААААА 20 -120012900109-71-1.1/2020
Литература/References
1. СанПиН 3.2.3215-14 «Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации». [SanPiN 3.2.3215-14 «Profilaktika parazitarnykh boleznei na territorii Rossiiskoi Federatsii» (In Russ.)]
2. Андреянов О.Н. Эколого-биологические особенности циркуляции возбудителей трихинеллеза в Центральном регионе России и оптимизация мер борьбы: дис. ... докт. вет. наук. ВИГИС, Москва. 2014 г. 280 с. [Andreyanov O.N. Ekologo-biologicheskie osobennosti tsirkulyatsii vozbuditelei trikhinelleza v Tsentral'nom regione Rossii i optimizatsiya mer bor'by [dissertation]. VIGIS, Moscow. 2014. 280p. (In Russ.)
3. Uspensky A., Bukina L., Odoevskaya I., Movsesian S. The epidemiology of trichinellosis in the Arctic territories. Journal of Helminthology. 2019;1:43-49. Doi; 10.1017/s0022149x18000020
4. Букина Л.А., Одоевская И.М., Успенский А.В. Методические положения по профилактике трихинеллеза на территории Чукотского полуострова // Российский паразитологический журнал. 2014. № 3. С. 137-143. [Bukina L.A., Odoevskaya I.M., Uspensky A.V. Metodicheskie polozheniya po profilaktike trikhinelleza na territorii Chukotskogo poluostrova. Rossiiskii parazitologicheskii zhurnal. 2014;3;137-143. (In Russ.) Doi 10.31016/978-5-9902340-8-6.2019.20.151-155
5. Успенский А.В., Скворцова Ф.К. Ветеринар-но-санитарная экспертиза в системе мер борьбы с трихинеллезом // Российский паразитологический журнал. 2019. № 1. С. 80-84 [Uspensky A.V., Skvortsova F.K. Veterinary-sanitary inspection in the system of control of trichinellosis. Rossiiskii parazitologicheskii zhurnal. 2019;1:80-84. (In Russ.)] Doi 10.31016/19988435-2019-13-1-80-84
6. Мартусевич А.К., Жданова О.Б., Хайдарова
A.А., Бережко В.К., Написанова Л.А. Анализ физико-химических свойств антигенов некоторых гельминтов как технология паразитологической мета-боломики // Фундаментальные исследования. 2014. № 12-7. С. 1437-1441 [Martusevich A.K., Zhdanovа O.B., Haidarova A.A., Berezhko V.K., Napisanova L.A. Analys of physical and chemical properties of antigenes of some helmints as technology parasitological metabolomics. Fundamental research. 2014;12-7:1437-1441. (In Russ.)]
7. Успенский А.В., Арисов М.В., Гулюкин М.И., Скворцова Ф.К. Особенности ограничительных мероприятий при трихинеллезе // Российский паразитологический журнал. 2019. № 3. С. 88-92. [Uspensky A.V., Arisov M.V, Guliukin M.I., Skvortsova F.K. Patterns of restrictive measures in the case of trichinellosis. Rossiiskii parazitologicheskii zhurnal. 2019;3:88-93. (In Russ.)] Doi: 10.31016/1998-84352019-13-3-88-92
8. Eissa М., Azzouni Z., Baddour N., Boulos L. (2003) Vaccination trial against experi-mental trichrinellosis using autoclaved Trichinella spiralis larvae vaccine (ATSLV). Journal of the Egyptian Society of Parasitology 05/2003; 33(l):219-28. Source: PubMed.
9. Feng S, Wu X, Wang X, Bai X, Shi H, Tang
B, Liu X, Song Y, Boireau P, Wang F, Zhao Y, Liu M. Vaccination of mice with an antigenic serine protease-like protein elicits a pro-tective immune response against Trichinellaspiralis infection. J Parasitol. 2013 Jun; 99(3):426-32. doi: 10.1645/12-46.1. Epub 2012 Dec 19.
10. Li X, Yao JP, Pan AH, Liu W, Hu XC, Wu ZD, Zhou XW. An antigenic recombinant serine protease from Trichinella spiralis induces protective immunity in BALB/c mice. Parasitol Res. 2013 Sep; 112(9):3229-38. doi: 10.1007/s00436-013-3500-6. Epub 2013 Jul 5.
11. Strobel H. The Serum Diagnosis of Trichinosis/ Strobel H. American Journal of the Medical Sciences: August 1911. Volume 142. Issue 2. P. 282.
12. Bachman G. W. An intradermal reaction in experimental trichiniasis/ Bachman G. W. J. Prev. Med. 1928. Т. 2. С. 513.
13. Maternivska I. Zbl. Bakteriol., Parasitenkunde, Infektionskrankh. UndHyg.1933;129(3-4):284-301.
14. Melcher L. R. An antigenic analysis of Trichinella spiralis / Melcher L.R. The Journal of Infectious Diseases. 1943. С. 31-39.
15. Chaffee E. F. Diagnosis of schistosomiasis by complement-fixation/ Chaffee E. F., Bauman P. M., Shapilo J. J. The American journal of tropical medicine and hygiene. 1954;3(5):905-913.
16. Baratawidjaja R.K. Fluorescent antibody staining in the serodiagnosis of trichinosis/ Baratawidjaja R. K., Hewson A., Labzoffsky N. A. Canadian Journal of Microbiology. 1963;9(4):625-628.
17. Mauss E.A. et al. The in Vitro Effect of Immune Serum upon Trichinella spiralis Larvae. American Journal of Hygiene. 1940;32(2):80-83.
18. Полетаева О.Г., Красовская Н.Н., Глаголева В.А. Характеристика иммуноферментной тест-системы с антигеном трихинелл // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1986. № 3. С. 51-56. [Poletaeva O.G., Krasovskaya N.N., Glagolevа V.A Characteristics of ELISA test systems with an antigene trihinella. Medical Parasitology and Parasitic Diseases. 1986;3: 51-56. (In Russ.)]
19. Васерин Ю.И., Костецкий А.Ф. Способ получения культурального антигена из Trichinella
spiralis. Авторский сертификат. 1493260 СССР-1992. [Vaserin Yu.I., Kostetsky A.F. Sposob polucheniya kulturalnogo antigena iz Trichinella spiralis. Avtorskii sertifikat 1493260 USSR-1992. (In Russ.)]
20. Бессонов А.С. Виды и вариететы в роде Trichinella railliet // Материалы докладов к 8-ой научной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных. Москва, 30-31 мая 2000 г. [Bessonov A.S. Vidy i varietety v rode Trichinella railliet. (Conference proceedings) Materialy dokladov k 8-oi nauchnoi konferentsii po probleme trikhinelleza cheloveka i zhivotnykh. 2000 May 30-31th; Moscow. (In Russ.)]
21. Ruitenberg E., Kampelmacher E.H., Berkvens J. Die in dir tecte fluorescierende Antikorpertechnik bei Serodiagnostik von mit Trichinella spiralis-infizierten Schweinen. Fleischwirtschaft. 1967: 1217 -1 220.
22. Chroust K., Chroust K., Dubansky V. The indirect fluorescent antibody method in experimental trichinosis diagnostic. Actavet. Brno, 39, 1970: 157-163.
23. Kozar Z. et al. An attempt of using some serologic methods in the diagnosis of trichinellosis in slaughter pigs. Wiadomosci parazytologiczne. 1970;16(1):41-44.
24. Белозеров С.Н., Жданова О.Б. Прижизненная диагностика трихинеллеза песцов с помощью им-муноферментной реакции // Ветеринария. 2000. № 2. С. 34 [Belozerov S.N., Zhdanova O.B. Prizhiznennaja diagnostics of trichinellosis of polar foxes with the help of ELISA. Veterinary science. 2000;2:34. (In Russ.)]
25. Clinard E.H., Saunders G. C., Leighty J. C. Prospects for use of the ELA test in control of trichinellosis in swine. Los Alamos Scientific Lab., NM (USA), 1976. №. LA-UR-76-2247; C0NF-760854-1.
26. Бенедиктов И.И., Липатова Л.Н. Получение, свойства и использование моноклональных антител для очистки диагностических антигенов трихинелл. Материалы докладов VI научной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных. М., 1992. [Benediktov I.I., Lipatova L.N. Poluchenie, svoistva i ispol'zovanie monoklonal'nykh antitel dlya ochistki diagnosticheskikh antigenov trikhinell. (Conference proceedings) Materialy dokladov VI nauchnoi konferentsii po probleme trikhinelleza cheloveka i zhivotnykh. 1992. Moscow. (In Russ.)]
27. Шеховцов Н.В. Испытания диагностической эффективности при трихинеллезе в ИФА // Восьмая Всероссийская конференция по трихинеллезу. Москва, 30-31 мая 2000 г. Статьи и тезисы докладов. [Schechovtsov N.V. Ispytaniya diagnosticheskoi effektivnosti pri trikhinelleze v IFA (Conference proceedings) Vos'maya Vserossiiskaya konferentsiya po trikhinellezu. 2000 May 30-31th; Moscow. (In Russ.)]
28. Magat W.J., Jeska E.L. A serodiagnostic antigen for trichinellosis.| Acta parasitol polon. 1976;24(11-19):191-198.
29. Жданова О.Б., Кузнецова Ю.К., Манчанти Ф., Романелли М. Зоонозный кожный лейшманиоз в Италии. Современное состояние проблемы //Вятский медицинский вестник.2019. № 3. С.78-81. [Zhdanova
O.B., Kuznetsova J.K., Mancianti F., Romanelli M. Zoonotic skin leismaniasis in Italy. A modern condition of the problem. Vyatskii meditsinskii vestnik. 2019;3:78-81. (In Russ.)]
30. Martinez-Gomez F1, Fuentes-Castro BE, Bautista-Garfias CR. The intraperitoneal in-oculation of Lactobacillus casei in mice induces total protection against Trichinellaspiralis infection at low challenge doses. Parasitol Res. 2011 Dec; 109(6):1609-17. doi: 10.1007/s00436-011-2432-2. Epub 2011 May 4.
31. Rudneva O.V., Berezhko V.K., Sasikova M.R. (2016) Immunoprophylaxis of secondary alveolar echinococcosis by a immunostimulationribotan combined with antigen protoscolex cells of Echinococcusmultilocularis. Ad Alta: Journal of Interdisciplinary Research . 2016. Vol. 6. Issue 1. p. 8891. 4p.
32. Rudneva OV, Napisanova LA, Berezhko VK (2018) Azoximeribromidum -protective action of immunostimulator drug in experimental trichinosis of mice. Agrofor - International Journal. 2018;3(1):99-105. DOI: http://dx.doi.org/10.7251/AGRENG1801099R
33. Руднева О.В., Написанова Л.А., Береж-ко В.К. (2018) Сравнительная оценка современных иммуностимулирующих препаратов на зараженность животных личинками Trihinellaspiralis при экспериментальном трихинеллезе. Инфекционные болезни в современном мире: эволюция, текущие и будущие угрозы. Сборник трудов X Конгресса по инфекционным болезням с международным участием, г. Москва, 26-28 февраля 2018 года. [Rudneva O.V, Napisanova L.A., Berezhko VK Sravnitel'naya otsenka sovremennykh immunostimuliruyushchikh preparatov na zarazhennost' zhivotnykh lichinkami Trihinellaspiralis pri eksperimental'nom trikhinelleze. Infektsionnye bolezni v sovremennom mire: evolyutsiya, tekushchie i budushchie ugrozy. (Conference proceedings) Sbornik trudov x Kongressa po infektsionnym boleznyam s mezhdunarodnym uchastiem. 2018 Febr. 26-28; Moscow. (In Russ.)]
34. Жданова О.Б., Ашихмин С.П., Клюкина Е.С., Парамонова А.Н., Мутошвили Л.Р. Новые методологические решения в патоморфологии гель-минтозоов // Российский паразитологическии журнал. 2010. № 4. С. 74-82. [Zhdanova O.B., Ashihmin S.P., Kljukina E.S., Paramonova A.N., Mutoshvili L.R. New methodological decisions in pathomorphology of helmintozoonosis. Russian Juornal of parasitology. 2010;4:74-82. (In Russ.)]
35. Мартусевич А.К., Жданова О.Б. Информативность исследования свободного кристаллообразования при зоонозах на модели лабораторных животных // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. 2006. № 1 (22). С. 30-39. [Martusevich A.K., Zhdanovа O.B. Informatively of the research of free crystallogenesis at the zoonosis on the model of laboratory animals. News of higher educational institutions. Volga region. 2006;1 (22):30-39. (In Russ.)]
