CC BY
31ISSR-МЕТОД В ИДЕНТИФИКАЦИИ ОСОБЕЙ ELEPHAS
MAXIMUS Козел А.В.1, Зятьков С.А.2
1Козел Ангелина Владимировна - студент, кафедра зоологии, физиологии и генетики, факультет заочного обучения и довузовской подготовки; 2Зятьков Сергей Александрович - старший преподаватель, кафедра зоологии, физиологии и генетики, биологический факультет, Гомельский государственный университет им. Ф. Скорины, г. Гомель, Республика Беларусь
Аннотация: в статье апробирован ISSR-метод, в качестве метода для определения родства и происхождения особей Elephas maximus. Ключевые слова: ISSR-метод, Elephas maximus, (CA)gG.
Слоны - уникальный вид животных, который находится на грани вымирания. Изучение генетического разнообразия этих животных во многом сможет помочь ученым приостановить скорость, а может даже и исключить вовсе, вымирание вида в естественной среде. От генетического разнообразия популяции зависит ее способность адаптироваться к непосредственному окружению в процессе естественного отбора. При низких показателях внутрипопуляционного полиморфизма снижается количество возможных комбинаций генов, способствующих адаптации к окружающей среде, что уменьшает вероятность возникновения в этой популяции новых приспособленных генотипов. Таким образом, популяция в естественных условиях нуждается в соответствующем уровне генетического разнообразия для выживания под давлением постоянно меняющихся биотических и абиотических компонентов экосистемы. Кроме того, чем больше генетическое разнообразие, тем больше вероятность найти молекулярно-генетический маркер позволяющий отличить особей из разных популяций одного вида, даже интродуцированных из разных географических локаций.
Цель нашей работы состояла в проверке (CA)9G ISSR-маркера, как удобного для определения родства и происхождения особей взятых из разных локаций Elephas maximus.
ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) - метод на основе ПЦР, в котором праймер состоит из микросателлитной последовательности, и в результате амплификации размножается участок между двумя микросателлитами [1].
Исследования включали следующие этапы: отбор образцов буккального эпителия, выделение из них ДНК, ПЦР, гель-электрофорез с последующей ген-детерминацией.
Выделение ДНК проводили упрощенным CTAB методом по стандартной методике описанной ранее [2].
1п 1м 1р 2л 2м 2р Вп Зм Эр
Рис. 1. Электрофоретическая оценка качества выделенной ДНК
М- маркер молекулярных масс; 1п, 2п, 3п - образцы, взятые у слонихи Претти; 1м, 2м, 3м - образцы, взятые у слонихи Марго; 1р, 2р, 3р - образцы, взятые у слонихи Ранго
Для выполнения работы был использован буккальный эпителий, взятый у трёх индийских слонов (Е. тахтив) разных возрастов и привезённых из различных регионов: Претти (31 год, Китай), Ранго (67 лет, Китай) и Марго (7 лет, Индия) Российской цирковой компании «Росгосцирк».
Из рисунка 1 видно, что образцы 1м, 2п, 2м, 3р содержат меньшее количество ДНК, а 2р и 3м - большее. Кроме того, для большинства образцов заметно свечение рядом с лункой, что указывает на наличие тяжелых, малофрагментированных фракций ДНК.
Проведённый в дальнейшем спектрофотометрический анализ позволил оценить концентрацию и чистоту ДНК выделенных образцов. В среднем полученные образцы содержали ДНК - 154,13 нг/мкл. Соотношение поглощения при 260 нм / 280 нм в среднем составило - 1,85, что говорит о чистоте выделенной ДНК. Однако соотношение поглощения при 260 нм / 230 нм в среднем составило уже - 1,13, что говорит о загрязнении полученных образцов компонентами, полученными в ходе выделения ДНК.
ISSR ПЦР проводили в следующих условиях: первоначальная денатурация - 2 мин при 95° С; денатурация - 30 с при 95° С, отжиг - 30 с при 55° С, элонгация - 2 мин при 72° С (37 циклов); завершающая элонгация - 7 мин при 72° С. Продукты амплификации (ампликоны) разделяли в 2% агарозном геле [3].
На основании полученных экспериментальных данных было установлено, что у проанализированных особей Е. тахгтив присутствует 8 фракций следующего размера 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 н.п., соответственно. Необходимо отметить, что перечисленные фракции присутствовали у всех исследованных особей. Данный факт говорит о том, что использование одного ISSR-локуса недостаточно, что точной оценки географического происхождения особей Е. тахтш.
Авторы выносят благодарность руководству и сотрудникам Российской цирковой компании «Росгосцирк» и в частности участникам шоу Андрея Дементьева-Корнилова «На слонах вокруг света», оказавшим помощь и поддержу при выполнении данной работы.
Список литературы
1. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics, 1994. № 20. P. 176-183.
2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.
3. Глазко В.И., Столповский Ю.А., Глазко Т.Т. ДНК-штрихкодирование сельскохозяйственных видов животных // Вестник российской академии естественных наук, 2010. № 1. С. 107-113.
