Исследования иммуногенности терапевтических белков: методические аспекты выявления и изучения антител к лекарственному препарату Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© Коллектив авторов, 2024

Авдеева Ж.И.1, Солдатов А.А.1, Алпатова Н.А.1, Бондарев В.П.2, Мосягин В.Д.1, Коровкин А.С.1, Меркулов В.А.1

Исследования иммуногенности терапевтических белков: методические аспекты выявления и изучения антител к лекарственному препарату

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 127051, г. Москва, Российская Федерация

2 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Федерального медико-биологического агентства, 119121, г. Москва, Российская Федерация

Резюме

Биотехнологические лекарственные препараты (терапевтические белки) в настоящее время широко и успешно применяются в медицинской практике в связи с их высокой специфичностью по отношению к факторам, связанным с патогенезом различных заболеваний. При этом развитие иммунного ответа, направленного против терапевтических белков, вызывает серьезную озабоченность, поскольку нельзя исключить его влияния на фармакокинетику, фармакодинамику, безопасность и эффективность препаратов. Клинические последствия формирования иммунного ответа на терапевтический белок в значительной степени зависят от типа, степени его выраженности, а также от специфичности и направленности антител к лекарственному препарату. Выявление, определение уровня и характеристика функциональной активности антилекарственных антител является важнейшей задачей при разработке препарата для обеспечения безопасности и эффективности его применения при клиническом использовании. В обзоре приведена информация о подходах к изучению иммуногенности терапевтических белков, выбору и разработке методик анализа и характеристики антител к терапевтическим белкам на этапах разработки лекарственного препарата.

Ключевые слова: иммуногенность; антитела к лекарственному препарату; терапевтические белки; монокло-нальные антитела; скрининговые и подтверждающие исследования; выбор и валидация иммунологических методик; фармакокинетика; эффективность; безопасность

^атья получена 03.10.2023. Принята в печать 13.12.2023.

Для цитирования: Авдеева Ж.И., Солдатов А.А., Алпатова Н.А., Бондарев В.П., Мосягин В.Д., Коровкин А.С., Меркулов В.А. Исследования иммуногенности терапевтических белков: методические аспекты выявления и изучения антител к лекарственному препарату. Иммунология. 2024; 45 (1): 91-106. Б01: Шр§:/Мог о^/10.33029/1816-2134-2024-45-1-91-106

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00052-23-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР 121022000147-4). Публикация результатов исследования в открытой печати разрешена.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Авдеева Ж. И., Бондарев В.П.; сбор и обработка материала -Солдатов А.А., Алпатова Н.А., Мосягин В.Д.; написание текста - Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А.; редактирование - Коровкин А.С., Меркулов В.А.

Для корреспонденции

Авдеева Жанна Ильдаровна -доктор медицинских наук, профессор, главный эксперт Управления экспертизы аллергенов, цитокинов и других иммуномодуляторов Центра экспертизы МИБП ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: avdeeva@expmed.ru http://orcid.org/0000-0002-9377-1378

Avdeeva Zh.I.1, Soldatov A.A.1, Alpatova N.A.1, Bondarev V.P.2, Mosyagin V.D.1, Korovkin A.S.1, Merkulov V.A.1

Studies on the immunogenicity of therapeutic proteins: methodological aspects of identifying and studying of the anti-drug antibodies

1 Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products, Ministry of Health of the Russian Federation, 127051, Moscow, Russian Federation

2 Centre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks of the Federal Medical Biological Agency, 119121, Moscow, Russian Federation

Abstract

Biotechnological medicines (such as therapeutical proteins) are widely used in medical practice due to their high specificity to factors associated with the pathogenesis of diseases of various origins. However, the development of immune response to therapeutical proteins is big issue because it affects pharmacokinetic and pharmacodynamic profile, safety and efficacy of the drug. The clinical significance of therapeutic proteins immunogenicity mainly depends on its' mechanisms of development and robustness, as well as specificity and affinity of the anti-drug antibodies (ADA). Identification, quantification and determination of anti-drug antibodies functional activity is the most important objective in drug development process as a key drug safety characteristic. This paper reviews different approaches of the therapeutic proteins immunogenicity assessment, choice of analytical methods for analysis and characterization of ADA during the clinical development process.

Keywords: immunogenicity; anti-drug antibodies; therapeutic proteins; monoclonal antibodies; screening and confirmatory studies; selection and validation of immunological methods; pharmacokinetics, efficacy; safety

Received 03.10.2023. Accepted 13.12.2023.

For citation: Avdeeva Zh.I., Soldatov A.A., Alpatova N.A., Bondarev V.P., Mosyagin V.D., Korovkin A.S., Mer-kulov V. A. Studies on the immunogenicity of therapeutic proteins: methodological aspects of identifying and studying of the anti-drug antibodies. Immunologiya. 2024; 45 (1): 91-106. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-1-91-106 (in Russian)

Funding. The study reported in this publication was carried out as part of publicly funded research project No. 05600052-23-00 and was supported by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products (R&D public accounting 121022000147-4). Open publication of the research results is allowed.

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.

Authors contribution. The concept and design of the study - Avdeeva Zh.I., Bondarev V.P.; Collection and processing of material - Soldatov A.A., Alpatova N.A., Mosyagin V.D.; Writing the text - Avdeeva Zh.I., Alpatova N.A.; Editing - Korovkin A.S., Merkulov V.A.

For correspondence

Zhanna I. Avdeeva -MD, PhD, Professor, Chief Expert of the Department of Allergens, Cytokines and other Immunomodulators Examination, SCEEMP, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: avdeeva@expmed.ru http://orcid.org/0000-0002-9377-1378

Введение

Проблемы, связанные с проявлением иммуноген-ности терапевтических белков, привлекают внимание научного сообщества в связи с тем, что успехи биотехнологии позволяют получать и все шире внедрять в клиническую практику новые лекарственные препараты (ЛП) на основе рекомбинантных белков, включая модифицированные белки и биоподобные препараты при окончании срока действия патентов на оригинальные препараты.

Биотехнологические лекарственные препараты (БтЛП) играют важную роль в лечении тяжелых хронических заболеваний, однако поскольку они имеют белковую природу и применяются, как правило, длительно, а в ряде случаев даже пожизненно, в том числе для заместительной терапии, такая схема их применения приводит к формированию иммунного ответа у пациентов. Проявления иммуногенности терапевтических белков приводят к развитию первичной или вторичной неот-вечаемости на терапию, риску развития инфузионных и аллергических реакций, повышая риск относительно безопасности использования современных и высокоэффективных ЛП данной группы и ограничивая сроки их успешного применения.

Для снижения рисков указанных осложнений при разработке новых БтЛП на этапах доклинических и клинических исследований, а также пострегистрационных наблюдений необходимы исследования безопасности применения препаратов, связанные с оценкой их имму-ногенности [1].

Регуляторными органами ведущих стран мира разработаны нормативные документы, содержащие рекомендации по исследованию иммуногенности БтЛП на всех этапах их жизненного цикла [1-4]. Периодически документы обновляются для более детального изложения подходов и методических приемов оценки имму-ногенности. Обновления рекомендаций базируются на достижениях научных разработок по подходу к оценке иммуногенности современных БтЛП, а также на результатах анализа опыта их практического применения.

Цель работы - провести анализ методических приемов изучения иммуногенности БтЛП при проведении клинических исследований на основе опыта практического применения и данных, приведенных в обновленных международных документах.

Общие положения

Известно, что иммунный ответ, сформированный при клиническом применении препаратов на основе

терапевтических белков, как гуморальный, так и клеточный, может повлиять на фармакокинетику (ФК), фармакодинамику (ФД), а также на безопасность и эффективность БтЛП. Причины развития иммунного ответа многоплановы, они связаны с особенностями пациента и заболевания, с сопутствующей терапией и со свойствами самого БтЛП. Следует отметить, что риск иммуногенности различается между БтЛП, с одной стороны, и между отдельными лицами и группами пациентов с другой.

При этом факторы, связанные с БтЛП, оказывающие влияние на вероятность развития иммунного ответа, включают производственный процесс, рецептуру и характеристики стабильности. Факторы, связанные с пациентом, потенциально предрасполагающие к развитию определенного типа иммунного ответа, включают генетический фон, ранее приобретенный иммунитет, состояние иммунного статуса и др. К факторам, связанным с лечением, относят режим дозирования, способ введения БтЛП, сопутствующую терапию [1-5]. Данные вопросы были освещены в многочисленных работах отечественных и зарубежных авторов, а также описаны нами в предыдущих сообщениях [6-17].

В настоящей статье изложены методические подходы, которые могут быть использованы для выявления антител (Ат) к ЛП [антилекарственных Ат (anti-drug antibodies, ADA)] при проведении лабораторных испытаний на этапе клинических исследований.

При разработке ЛП на основе терапевтического белка оценку его иммуногенности проводят в рамках общих клинических исследований. Известно, что формирование ADA может либо не вызывать никаких клинических последствий, либо сопровождаться развитием серьезных осложнений, начиная от снижения эффективности ЛП или полной ее потери до системных реакций гиперчувствительности и анафилаксии. Предупреждение риска развития подобных реакций является задачей клинических исследований иммуноген-ности, проводимых с целью выявления и последующего определения титров и функциональных свойств ADA, а также установления любых последствий формирования Ат, влияющих на ФК, ФД, эффективность и безопасность ЛП. При этом выбор подходящей стратегии для оценки нежелательной иммуногенности БтЛП имеет ключевое значение [4].

Выявление истинных концентраций ADA при применении терапевтических белков в клинической практике прежде всего необходимо для выбора и назначения пациентам соответствующей адекватной терапии. Отмечается, что выявление ADA часто зависит от используемого метода анализа, поскольку многие методики, как чувствительные, так и толерантные к лекарственным средствам, не способны обнаруживать ADA в присутствии в циркуляции ЛП, а следовательно, при их использовании нельзя определить истинный уровень ADA. Кроме того, отсутствие стандартов, с помощью которых можно оценить чувствительность и устойчивость к БтЛП используемых методик, затрудняет адекватную

сравнительную оценку получаемых результатов [18]. Особые сложности следует отметить при оценке имму-ногенности терапевтических моноклональных антител (МкАт), поскольку ADA необходимо выявить в образцах сыворотки крови пациентов, в которых присутствуют нормальные иммуноглобулины, ADA и остаточное содержание терапевтических МкАт [3].

Ранние исследования по определению ADA к препаратам МкАт (ингибиторам ФИОа), при которых в основном использовались тесты, чувствительные к лекарственным средствам, не позволяли установить истинную частоту формирования ADA, что привело к недооценке иммуногенного потенциала терапевтических МкАт. Использование методик, толерантных к лекарственным средствам, способствовало установлению более высокой частоты выявления ADA, что указывает на важность понимания и информированности о принципах используемой методики по выявлению ADA для правильной интерпретации результатов исследования. Одновременное определение ADA и концентрации циркулирующего ЛП оптимально, оно способствует адекватной оценке клинических последствий формирования ADA [19].

В связи с вышеизложенным важнейшей задачей при создании препаратов терапевтических белков является выбор и разработка и валидация специфичных высокочувствительных методик по выявлению и характеристике ADA [20-25].

Подходы к проведению исследований для выявления ADA

Согласно рекомендациям международных документов определена стратегия проведения испытаний, концентрирующая внимание исследователей на важнейших положениях, которые должны быть реализованы в рамках проведения исследования иммуноген-ности БтЛП [1, 2].

Прежде всего рекомендуется многоступенчатый подход к проведению исследований, последовательность которого представлена на рисунке.

При оценке иммуногенности БтЛП в ходе клинических исследований вначале проводят скринин-говые исследования, которые позволяют выявить Ат, обладающие способностью связываться с терапевтическим белком. Скрининговые исследования должны проводиться с использованием высокочувствительных методик, позволяющих выявлять даже малые количества ADA с высокой и низкой аффинностью, относящиеся ко всем изотипам иммуноглобулина (IgG, IgM, ^А, IgE), при этом определение ^А- и IgE-Ат может потребоваться в случае необходимости, что зависит от пути введения ЛП или клинических проявлений гиперчувствительности.

Следует учитывать неизбежность появления лож-ноположительных результатов, поскольку абсолютной специфичности любого скринингового метода достичь невозможно [4]. Согласно рекомендациям нормативных документов ведущих регуляторных организаций раз-

Скрининговые исследования

IgG

Y

IgM срс "Tl и

Дополнительно:

IgA

IgE

Нет

Да

Подтверждающие

исследования

Дополнительные испытания не требуются

Нет

Дополнительные испытания не требуются

Исследование

нейтрализующей

активности

Изучение характеристик: титр, аффинность, перекрестная реактивность, изотип, специфичность эпитопа и др.

Схема проведения исследований с целью выявления и характеристики антител (Ат) к лекарственному препарату (по [1] с изменениями)

витых стран, частота выявления ложноположительных результатов не должна превышать 5 %, что позволит более точно выявить количество истинно положительных результатов при проведении последующих подтверждающих исследований; при этом ложноотри-цательных результатов быть не должно [1, 2].

Скрининг проводится с использованием ряда иммунологических методов, основанных на различных форматах и системах обнаружения Ат: прямой/непрямой иммуноферментный анализ (ИФА), связывающий ИФА, электрохемилюминесценция, радиоиммунопреципи-тация, поверхностно-плазмонный резонанс, анализ связывания конкурентного лиганда, биологические методики с использованием клеточных культур. Все методы, применяемые для скрининга, основаны на выявлении взаимодействия (связывания) Аг-Ат, но могут различаться принципами, лежащими в их основе. При выборе метода скрининга следует принимать во внимание все методологические вопросы и наличие мешающих факторов, которые могут оказать влияние на результаты испытаний [1, 12, 26, 27].

На ранней стадии разработки устанавливают пороговую точку анализа, т.е. выраженность ответа, на основании которого можно оценить ответ как положительный или отрицательный. Определение пороговой точки допускается проводить путем анализа 5-10 отдельных образцов сыворотки крови пациентов. Нельзя исключить того, что может потребоваться корректировка пороговой точки, когда станут доступны образцы сыворотки всех пациентов группы, не полу-

чавшей ЛП (n = 50 субъектов). При установлении пороговой точки рекомендуется учитывать влияние статистически определенных значений выбросов и действительно положительных образцов [1].

При проведении последующих подтверждающих исследований, в которых анализируются только положительные образцы, выявленные при скрининговом анализе, необходимо подтвердить, что Ат специфически связываются с терапевтическим белком. Далее следует более подробно изучить качественные и функциональные характеристики специфических Ат: титр, нейтрализующая активность, изотип Ig, аффинность, эпитопная специфичность [1]. Исследования по выявлению специфических IgE проводят в случае высокого риска развития анафилактической реакции. Оценка эпитопной специфичности может быть актуальна для характеристики Ат, сформированных к многодоменным белковым препаратам, таким как пегилированные белки, конъюгаты МкАт с лекарственным средством или биспецифические МкАт. В таком случае определяют направленность ADA к различным структурным элементам молекулы терапевтического белка [3, 24].

В некоторых случаях целесообразны исследования по выявлению перекрестной реактивности Ат с эндогенным белком, например если терапевтический белок относится к семейству с высокой гомологичностью белков друг к другу. При этом важно установить, влияют ли выявленные ADA на другие белки этого семейства [1].

При обследовании пациентов с гемофилией, получающих препараты фактора VIII, или пациентов с парциальной красноклеточной аплазией костного мозга, получающих эритропоэтин (ЭПО), важно определять подтип выявляемых Ig, поскольку в данном случае могут формироваться Ат, относящиеся к IgG4. Указанный подтип Ат может не выявляться методом твердофазного ИФА - за счет возможного обмена участками молекулы с молекулами Ig другой специфичности такие Ат не вступают во взаимодействие со специфическим Аг, сорбированным в лунках планшета [28-30].

При проведении подтверждающих исследований должны быть использованы методики, характеризующиеся высокой специфичностью и достаточной селективностью, для исключения ложноположительных результатов. Для расчета пороговой точки подтверждающего анализа допустим 1 % ложноположительных результатов, обусловленный возможностью неспецифического связывания [1]. Принцип и основные этапы воспроизведения методик, используемых для скринин-гового и подтверждающего анализов, могут быть либо подобными, либо существенно отличаться [1, 27].

Ключевыми параметрами методик для подтверждающего анализа являются чувствительность, специфичность и степень устойчивости к присутствию в исследуемом образце БтЛП, поскольку они определяют возможность адекватного выявления ADA.

При разработке методики оценивать ее чувствительность можно с помощью тестирования серийных разведений Ат с известной концентрацией, использу-

емых для положительного контроля, в среде, например, в плазме или в сыворотке крови, взятой у одного или разных пациентов, ранее не получавших ЛП. Чувствительность методики оценивается по самой низкой концентрации препарата Ат, при которой в серии испытаний получается либо положительный результат, либо значения, равные пороговой точке, определенной для конкретной методики. При этом образцы положительного контроля, используемые в низкой концентрации, должны стабильно распознаваться как положительные и в скрининговом, и в подтверждающем анализе. Указанный параметр целесообразно определять в присутствии ожидаемой концентрации БтЛП, учитывая, что он оказывает влияние на результаты оценки чувствительности [1].

Однако даже тщательно оптимизированные методики часто имеют проблемы из-за низких значений пороговой точки и невозможности отличить «шум» анализа от истинного биологического ответа.

В работе B. Gorovits и соавт. описан подход к разработке тестов, при котором путем оптимизации условий анализа, независимым от положительного контроля, проверяется их влияние на ответ и вариабельность, как аналитическую, так и биологическую, исследуемых образцов. Авторы отмечают, что в рамках воспроизведения двух методов для выявления ADA при изучении влияния минимального необходимого разведения образца, концентрации меченого лекарственного средства (исследуемого реагента), времени инкубации и состава промывочного буфера установлено, что условия анализа, особенно концентрация меченого препарата, оказывают влияние на значения пороговых точек скринингового и подтверждающего анализов [31]. Авторы предполагают, что, исследуя образцы крови ранее не леченных пациентов при различных условиях анализа, можно выбрать условия, позволяющие избежать нежелательно низких значений пороговой точки для скрининга (например, < 1,2 %) и подтверждающего (например, < 25 %) анализов [31].

Методики, используемые для выявления ADA, должны обладать достаточной чувствительностью и способностью обнаруживать такие незначительные количества ADA, которые не вызывают изменения профилей ФК, ФД и не влияют на безопасность или эффективность БтЛП. Чувствительность методики определяют в единицах массы и выражают как массу обнаруженных ADA на мл среды без разведения [1].

Иа чувствительность анализа может оказывать влияние присутствие в сыворотке крови терапевтических белков или их эндогенных аналогов. Одним из подходов к снижению интерференции со стороны терапевтического белка является взятие исследуемых образцов у пациентов при минимальной концентрации ЛП в системном кровотоке [1].

Однако многие терапевтические белки, как правило, вводятся неоднократно по определенной схеме и имеют длительный период полувыведения, что затрудняет оценку иммунного ответа из-за присутствия

в системном кровотоке высоких концентраций ЛП. Эти трудности еще больше усугубляются, когда препарат имеет сходство с эндогенным аналогом, который также может присутствовать в сыворотке крови в высокой концентрации.

R. Davis и соавт. отмечают, что в течение последних лет проводятся исследования по изучению нескольких подходов к преодолению проблем при достижении уровней толерантности методики к БтЛП при оценке иммуногенности и подчеркивают важность формата используемого анализа. Авторами проведена оптимизация методики электрохемилюминесценции (SPECL), используемой для выявления ADA к биотерапевтическому средству CSL112 (аполипопротеину A-I, полученному из плазмы человека, в состав которого входит фосфатидилхолин) в присутствии эндогенного аналога (аполипопротеин A-I, апоА-I), которая заключается в предварительной обработке образца (экстракция белка А из образцов сыворотки перед выполнением мости-кового анализа на платформе ECL). Данный формат анализа разработан для обнаружения ADA как ко всей структуре CSL112, так и к ее основному белковому компоненту, апоА-I. Отмечается, что методика является чувствительной (нижний предел количественного определения < 39 нг/мл) и имеет толерантность к ЛП (0,5 мг/мл), что соответствует требованиям FDA, США [1, 27]. Отмечается, что при использовании метода SPECL в нескольких клинических исследованиях (n = 970 субъектов) наблюдали отсутствие выявления ADA как к апоА-I, так и к препарату CSL112 до и после его повторного приема. Авторы подчеркивают, что разработанный формат анализа позволяет отличать циркулирующие ADA от терапевтического средства и эндогенных аналогов [32].

При оценке специфичности важно подтвердить способность методики обнаруживать именно целевое вещество, т. е. ADA, так как ложноположительные результаты могут скрыть взаимосвязь между иммунным ответом, приводящим к выработке ADA, и изменением параметров ФК и ФД, а также показателей клинической безопасности и эффективности препарата. Для ряда препаратов МкАт сложно подтвердить специфичность гуморального иммунного ответа, учитывая, что в сыворотке крови присутствуют Ig в высокой концентрации. Одним из основных подходов в этом случае является подтверждение, что связывание целевого белка с Ат может блокироваться очищенным терапевтическим белком; при добавлении указанного белка или его компонентов будет отмечено подавление сигнала, регистрирующего степень связывания Ат с препаратом. Кроме того, может быть информативным включение в испытание других МкАт, содержащих идентичный Fc-фраг-мент молекулы, но вариабельную область иной специфичности [1, 3, 4].

При разработке методики следует учитывать ее селективность, т. е. способность идентифицировать ADA в присутствии в образце других компонентов. На результаты анализа может оказывать влияние интерфе-

ренция среды образца (например, компоненты плазмы или сыворотки крови), а также присутствующего в системном кровотоке терапевтического белка. Компоненты среды могут способствовать появлению неспецифического сигнала и тем самым маскировать положительные результаты. Для понимания степени интерференции со стороны компонентов среды можно сравнить степень извлечения ADA из чистого буферного раствора со степенью их извлечения из среды [28].

Для предотвращения подобного влияния на результаты испытаний рекомендуется также предварительно разбавлять исследуемые образцы. До проведения вали-дационных исследований следует подобрать среду и определить минимально необходимое разведение образца, которые будут использованы при подготовке образцов для испытания [20]. В соответствии с рекомендациями FDA проводить определение минимально необходимого разведения следует на образцах, полученных от пациентов, ранее не получавших БтЛП, при этом оптимальным является разведение образца не выше 1 : 100 [1].

При оценке ответа на терапевтические белки, несущие в своем составе Fc-фрагмент, такие как МкАт и Fc-слитые белки (fusion proteins), может создавать трудности ревматоидный фактор (РФ), присутствующий в исследуемом образце. Как правило, РФ представляет собой IgM, распознающие IgG, хотя встречаются указания на РФ, специфичные к другим Ig. При проведении анализа РФ будет связываться с Fc-областями и имитировать присутствие Ат, специфичных к терапевтическому белку. В литературе приводятся сведения об использовании нескольких подходов по снижению интерференции РФ, включая назначение аспартама, оптимизацию концентраций используемых реактивов для уменьшения фонового связывания, выбор условий хранения и состава используемых буферных растворов при проведении чувствительного электрохемилюми-несцентного иммуноанализа, добавление F(ab')2 внутривенного IgG, который выделен из пула поликлональных IgG, полученных из плазмы [7, 34-37].

Согласно рекомендациям FDA, если ложноположи-тельные результаты при изучении иммунного ответа на препараты, содержащие Fc-слитые белки, обусловлены РФ, рекомендуется разработать методику, направленную на выявление Ат, специфичных для другой области молекулы слитого белка (отличной от Fc-фраг-мента белка), а не для цельной молекулы БтЛП [1, 3, 4].

При проведении подтверждающих исследований важно оценить нейтрализующую активность выявленных ADA, за счет которой они могут оказывать существенное влияние на ФК и ФД препарата, снижая его терапевтическое действие. В связи с этим оценка функциональной характеристики ADA важна в плане интерпретации эффективности и безопасности терапевтического средства.

Метод определения должен базироваться на принципах механизма действия терапевтического белка. Как правило, применяют биологические методики in vitro

с использованием клеточных культур, также можно использовать тесты на основе конкурентного связывания с лигандом (CLB). Определение нейтрализующей активности ADA в тестах in vitro на культуре клеток является предпочтительным, поскольку более физиологично, однако воспроизведение методик является более сложным и продолжительным. В частности, может потребоваться многоэтапная предварительная обработка тестируемых образцов, которая ограничивает чувствительность анализа по сравнению с методикой для обнаружения связывающих ADA. Указанные ограничения могут усложнить интерпретацию полученных результатов (положительный результат при оценке связывания и отрицательный в тесте на культуре клеток), что может быть связано с наличием только ненейтрализующих (связывающих ADA) или быть ложноотрицательным для нейтрализующих ADA из-за используемой методики.

Методики CLB базируются на использовании растворимых рецепторов и конъюгированных реагентов вместо клеток, что упрощает их выполнение. В работе J. Hu и соавт. представлены результаты сравнительного исследования клеточных и неклеточных аналитических методик для обнаружения клинически значимых нейтрализующих ADA, специфичных к ЭПО, при оценке его иммуногенности. На основании результатов проведенных исследований авторы делают заключение, что не всегда методы CLB позволяют выявить нейтрализующие ADA в полном объеме [38]. При этом метод CLB может быть применен для характеристики ADA к препаратам на основе Fc-слитых белков [39].

В работе A. Coddens и соавт. предложен инновационный метод характеристики нейтрализующих антител ^АЬ), направленных против терапевтических средств на основе МкАт, включая препараты наноантител, который позволяет выявлять только ADA, специфичные в отношении доменов, определяющих комплемен-тарность связывания (CDRs) ЛП с соответствующей мишенью. С этой целью получают препарат, отличающийся от ЛП только наличием мутаций в CDR-регионе («нулевой вариант»), что лишает его возможности связывания с мишенью, т. е. делающим его функционально неактивным, в остальном его структура идентична ЛП.

Принцип метода основан на выявлении эпитопа, ответственного за нейтрализующую активность ADA. Анализ выполняется поэтапно: вначале формирование комплекса ADA с нулевым вариантом наноантитела, на последующем этапе - определение CDR-связывающих ADA с нейтрализующим потенциалом (ANP). Данный способ выявления NAb определен как метод характеристики эпитопов NAb [NAb Epitope Characterization Assay (NECA)]. Результаты исследования панели очищенных NАb и ненейтрализующих Ат, а также экспериментальных и клинических образцов подтвердили пригодность и преимущества разработанного формата анализа для раннего выявления ADA с нейтрализующим потенциалом. Авторы заключают, что использование метода NECA позволило провести однозначное сравнение уровней выявления связывающих и нейтра-

лизующих ADA в исследуемых образцах и определить истинную нейтрализующую активность ADA, обеспечивая адекватную оценку риска иммуногенности [40].

Информация о технологических достижениях в производстве наноантител (Nbs) за последние 10 лет и об их потенциальных возможностях использования в качестве таргетных терапевтических средств представлена в работе H. Boulenouar и соавт. [41].

При использовании культуры клеток оценку результатов проводят путем определения степени выраженности реакции клеток, таких как фосфорилирование внутриклеточных структур, стимуляция или подавление пролиферации, снижение жизнеспособности клеток. Если терапевтические белки воздействуют на клетки непосредственно, эффект NАb оценивают по снижению их биологической активности. Если же терапевтические белки влияют на клеточную активность косвенно (например, блокируя взаимодействие рецептор-лиганд), эффект NАb оценивают по восстановлению биологической активности препарата. В некоторых случаях для биологических тестов разрабатываются линии клеток, экспрессирующие требуемые рецепторы или репор-терные конструкции.

Обычно биологические методики предполагают использование одной концентрации терапевтического белка с разведением только исследуемого образца, содержащего ADA. Должна быть подобрана такая концентрация терапевтического белка, эффект которой может быть ингибирован присутствующими в образце ADA, т. е. она должна находиться в линейном диапазоне кривой зависимости «доза-ответ».

Следует отметить, что в данных тестах нужно учитывать возможность усиления или подавления активности терапевтического белка за счет присутствия в анализируемом образце повышенного количества одного или нескольких цитокинов, которые могут стимулировать активность клеток, используемых в анализе. Подобная ситуация возможна при тестировании образцов сыворотки крови пациентов с определенными заболеваниями. В таком случае может потребоваться поиск такой линии клеток, активация которых будет зависеть только от терапевтического белка, или отработка условий подавления или истощения ингибиру-ющих факторов. Для клеток, которые могут реагировать на стимулы, отличные от специфического терапевтического белка, адекватным показателем специфичности анализа является доказательство того, что NАb инги-бируют только ответ клеток на терапевтический белок, а не на другие стимулы [1].

Пороговую точку для методики оценки нейтрализующей активности ADA следует определять, учитывая вариабельность анализа, установленную при исследовании образцов от субъектов, которые ранее не получали ЛП. Если исследования проводятся с использованием образцов, которые дали положительные результаты при скрининге и в подтверждающих анализах, приемлемой считается частота ложноположительных результатов, равная 1 % [1].

Отмечается, что на этапах скрининговых и подтверждающих исследований, при выявлении в клинических образцах сыворотки или плазмы крови пациентов ADA, используются различные аналитические платформы, при этом каждый применяемый метод оценки связывания может иметь разную чувствительность. При этом чувствительность методик выявления ADA, которые имеют низкую аффинность связывания или высокую скорость диссоциации, варьирует в зависимости от типа и формата анализа. Применение функциональных тестов с использованием клеточных культур предпочтительно для выявления нейтрализующих ADA - это важно для оценки их влияния на клиническую эффективность препарата. Подчеркивается, что разработка или выбор чувствительного и адекватного метода является важнейшим шагом в оценке иммуногенности терапевтических белков, включая препараты МкАт [18, 39, 42].

В настоящее время для адекватной оценки имму-ногенного потенциала БтЛП, помимо выбора метода и оптимальных условий проведения анализа по выявлению и характеристике ADA, разрабатываются соответствующие панели МкАТ, специфичных к БтЛП. Так, с целью обеспечения возможности выбора и оценки эффективности соответствующих анализов выявления ADA к ЭПО человека, а также для стандартизации получаемых результатов Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) утверждена панель из 9 МкАт против ЭПО с разнообразными характеристиками, аналогичными тем, которые обнаруживаются у пациентов, получавших ЭПО.

Панель включает ненейтрализующие Ат (как правило, предсуществующие); Ат раннего ответа (обычно ненейтрализующие) IgM и IgG; нейтрализующие (изо-типы IgG1, IgG2 и IgG4), которые характерны для антитело-опосредованной истинной эритроцитарной аплазии. Пригодность панели оценена в многоцентровом международном исследовании с участием 18 лабораторий из разных стран и при использовании различных аналитических платформ, которые включали анализы по оценке связывания (некоторые из них были основаны на использовании новых технологий) и анализы нейтрализации с использованием клеточных линий, чувствительных к ЭПО. Результаты исследования показали пригодность анализируемой панели Ат в качестве индикатора эффективности анализа выявления Ат, специфичных к ЭПО человека. Панель МкАт против ЭПО предназначена для выбора анализа, способного обнаруживать все Ат к ЭПО, для оценки эффективности анализов и их валидации. Ат сгруппированы в две панели: панель А [код 15/240, Erythropoietin Antibody Reference Panel A (1st WHO Reference Panel)]; панель В [код 15/242, Erythropoietin Antibody Reference Panel В (1st WHO Reference Panel)]; отрицательное контрольное Ат [код 13/122, Erythropoietin Antibody Reference Panel Negative Control Antibody (1st WHO Reference Panel)]. Обе панели утверждены ВОЗ в 2015 г. [43, 44].

При сравнении аналитических характеристик трех методов анализа связывания лиганда для ADA к ЭПО -методов поверхностного плазмонного резонанса (SPR), электрохемилюминесценции (ECL) и биослойной интерферометрии (BLI) - с использованием эталонной панели Ат против ЭПО было установлено, что указанные методы различаются по способности обнаруживать ADA [30].

Дозозависимые реакции связывания наблюдались для всех 9 Ат к ЭПО в панели анти-ЭПО с помощью методов SPR и BLI. Напротив, метод ECL не выявил четкого связывания низкоаффинных Ат против ЭПО. IgG2-Ат проявляли более высокий ответ связывания в анализе SPR, тогда как ответ связывания IgM был выше, чем у IgG2 в анализе ECL. При применении метода BLI в реакциях связывания IgG2 или IgM последовательной закономерности не наблюдалось. Результаты исследования с использованием эталонной панели Ат против ЭПО свидетельствуют о том, что различия в платформах анализа могут повлиять на чувствительность и другие характеристики тестов для обнаружения ADA и что понимание аналитической эффективности анализов очень важно для надлежащей оценки иммуно-генности БтЛП [44].

В настоящее время общедоступные эталонные стандарты ADA против терапевтических МкАт отсутствуют, несмотря на потенциальную важность таких стандартных наборов для оценки используемых методик и сравнения результатов, получаемых разными авторами.

В исследовании M. Tada и соавт. созданы химерные (человек-крыса) МкАт к ритуксимабу (анти-CD20-Ат) с различными биологическими характеристиками и разработана панель ADA к ритуксимабу, состоящая из 8 клонов, различающихся связывающими свойствами (специфичность, эпитопная направленность, аффинность) и нейтрализующей активностью (комплемент-зависимая и антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность). Панель включает 7 антиидиотипических клонов, которые специфически связываются с ритуксимабом (ADA03, 05, 06, 08, 10, 12 и 13), и клон, который связывается с химерными МкАт (ADA19). Авторы отмечают, что молекулярный размер иммунного комплекса, состоящего из ритуксимаба и МкАт к ритуксимабу, различался среди клонов и хорошо коррелировал с уровнем FcyR-опосредован-ной активацией иммунных клеток. Показано различие в степени выявления ADA с разными характеристиками связывания при использовании ECL, SPR и BLI. Полученные результаты свидетельствуют о том, что МкАт разработанной панели соответствуют характеристикам ADA человека, которые обладают различным потенциалом влияния на безопасность и эффективность ритуксимаба. Авторы предполагают, что данный подход может быть применен к другим терапевтическим препа-ратамМкАт [42].

В исследовании T. Suzuki и соавт. разработаны панели химерных (человек-крыса) МкАт, специфичных

к препаратам МкАт против ФНОа (инфликсимаб и адалимумаб). Разработанные панели состоят из 7 (для инфликсимаба) и 11 (для адалимумаба) МкАт с различными связывающими свойствами. Большинство из них характеризуется наличием нейтрализующей активности. Используя данные панели МкАт, авторы сравнили выявляемость ADA в модельных анализах связывания SPR, BLI и ECL и клеточного анализа для обнаружения нейтрализующей активности. Оценивая результаты исследований по выявлению ADA, демонстрирующие разный уровень ответа в различных методиках, авторы подчеркивают, что разработанные панели МкАт могут быть использованы при выборе методики для выявления и характеристики ADA [45].

Рекомендации по разработке методик анализа

При выборе и разработке методики следует предусмотреть возможность влияния многих факторов на результаты оценки количества исследуемых ADA, например вариабельность полученных у пациентов образцов; чувствительность клеток, используемых в анализе по оценке нейтрализующей активности Ат для построения стандартной кривой; аффинность и авидность Ат; концентрация конкурирующего белка в подтверждающих анализах и др. Влияние указанных факторов следует анализировать для правильности оценки причин вариабельности и исключения ошибки интерпретации результатов.

Необходимо также учитывать, что на эффективность исследуемого терапевтического белка могут влиять ранее сформировавшиеся (предсуществующие) Ат. В случае выявления таких Ат необходима оценка их количества и качества. В ходе исследований иммуно-генности следует определить нарастание уровня титра индуцированных Ат и оценить влияние предсущест-вующих Ат на проявления иммуногенности ЛП в процессе лечения [1, 34]. Так, критерием для заключения об увеличении выработки ADA под влиянием проводимой терапии может служить повышение титра выявляемых ADA, который на 2 шага разведения выше (в случае двукратного разведения), чем титр до применения ЛП.

При оценке иммунного ответа и выявлении ADA к препаратам МкАт следует учитывать следующие факторы. Современные технологии - получение химерных, гуманизированных или полностью человеческих Ат; модификация участков гликозилирования на тяжелых цепях Fc-фрагмента Ig; разработка препаратов на основе scFv-фрагментов (так называемые нанотела); F(ab)-, F(ab)2-фрагментов, бифункциональных гибридных Ат -позволили снизить иммуногенный потенциал подобных препаратов, однако не исключили его полностью. Иммунный ответ в таких случаях направлен против вариабельных участков или CDR-региона Ig. В связи с этим наиболее приемлемо использование методик, способных обнаруживать последствия иммунного ответа против вариабельных областей молекулы МкАт [5, 7]. Разработка препаратов МкАт, имеющих только последовательности IgG человека, также не

исключает возможности формирования ADA [14]. При исследовании иммунного ответа на препараты, молекула которых содержит модифицированный Fc-фрагмент Ig или представляет собой слитый белок, состоящий из Fc-фрагмента и вариабельного участка молекулы МкАт, необходимо использовать методики, позволяющие выявлять Ат к каждому участку молекулы.

При оценке иммуногенности БтЛП, в которых к молекуле белка присоединен полиэтиленгликоль (ПЭГ) с целью улучшения профиля ФК, необходимо учитывать риск индукции иммунного ответа против ПЭГ. В связи с этим следует определять уровень ADA, специфичных как к белковому компоненту, так и к ПЭГ. Сложности выявления анти-ПЭГ-Ат обусловлены тем, что в ряде случаев указанные Ат являются низкоаффинными IgM и циркулируют в присутствии высоких концентраций биотерапевтического препарата. В работе N. Bivi и соавт. сообщается о разработке и валидации методики Affinity Capture Elution (ACE)-AGL для обнаружения ADA и анти-ПЭГ-Ат. Принцип метода основан на последовательности выполнения следующих этапов: первоначальное связывание ADA с комплексом биотин-ПЭГ, элюирование в кислой среде, повторное связывание ADA на втором планшете с белком AGL и последующее выявление ADA с помощью реагента рутений-ПЭГ. По заключению авторов, новый формат ACE-AGL-анализа характеризуется высокой чувствительностью выявления ADA и ПЭГ-Ат, а также устойчивостью к ЛП [46].

При оценке иммунного ответа на конъюгированные терапевтические белки, которые представляют собой конъюгат МкАт с синтетическим ЛП, необходимо оценивать иммунный ответ на все компоненты терапевтического белка, включая МкАт, соединение линкер-ЛП и новые эпитопы, которые могут сформироваться в результате конъюгации [1, 3, 4].

Разработка адекватных методик, используемых в скрининговых и подтверждающих исследованиях для оценки иммунного ответа против терапевтического белка, является основой оценки иммуногенности.

Подбор контрольных образцов и реагентов

Важный момент при проведении исследований -подбор контрольных образцов, таких как Ат для положительного и отрицательного контроля, образцы для контроля пригодности системы, а также выбор реагентов. При этом важно квалифицировать критические реактивы и установить их стабильность.

Положительным контролем могут служить моно-или поликлональные Ат, концентрация которых должна быть предварительно подобрана для обеспечения чувствительности анализа и обнаружения эффекта высокой дозы. Последний можно установить по снижению уровня оцениваемого параметра за счет высокой концентрации анализируемого вещества или Ат в контрольном образце, что может приводить к ложноотрица-тельным результатам [1, 2].

Чаще всего АТ для положительного контроля получают путем иммунизации животных БтЛП, последующей очисткой Ат с помощью аффинной хроматографии при использовании соответствующего терапевтического белка для повышения чувствительности методики.

При получении Ат для положительного контроля важен выбор вида животных. Иапример, если Ат к Ig человека будут использоваться в качестве вторичных Ат для выявления ADA к терапевтическому белку у пациентов, Ат для положительного контроля также должны выявляться с помощью этих же вторичных Ат.

В некоторых случаях для положительного контроля используют образцы, полученные из сыворотки крови пациентов, у которых сформировались ADA. Однако такие образцы на ранних этапах исследований обычно недоступны. В качестве альтернативы для положительного контроля могут быть использованы МкАт, при этом оптимальным условием является способность указанных Ат связываться с вариабельной областью терапевтического МкАт.

В работе Ch. Kunzel и соавт. указывается на успешное использование ИФА при клинических исследованиях (фаза I) по выявлению ADA класса IgM, в котором сопоставляется возможность использования в качестве положительного контроля химически конъюгированного и рекомбинантного образца IgM. Конъюгированный и рекомбинантный IgM были сопоставимы в отношении чувствительности анализа, точности и пригодности. Все доступные образцы субъектов также были дополнительно охарактеризованы по наличию IgM- и IgG-ADA. Подчеркивается, что изотипирование ADA играет важную роль для оценки и понимания профиля иммунного ответа после введения ЛП [47].

Тщательно подобранный образец положительного контроля должен быть использован для оценки воспроизводимости методики и изучения ее валидационных характеристик - чувствительность, селективность, специфичность, устойчивость к лекарственному средству. При разработке и валидации методики важно, чтобы при разведении образца отмечался высокий, средний и низкий уровень сигнала - это свидетельствует о возможности выявления ADA в широком диапазоне концентраций. В соответствии с рекомендациями FDA, Ат для положительного контроля следует использовать в качестве образца для контроля пригодности системы при рутинном выполнении анализа [1].

В качестве отрицательного контроля может быть использован образец, полученный из пула сывороток крови пациентов, ранее не получавших БтЛП. При этом желательно, чтобы пациенты были одного пола, близкие по возрасту и принимали аналогичные сопутствующие ЛП.

Контрольные образцы следует отбирать и обрабатывать в тех же условиях, что и исследуемые. Это касается, например, типа используемого антикоагулянта, объема, а также условий подготовки и хранения, поскольку все это может оказывать влияние на качество контрольных образцов.

В некоторых случаях допустимо использовать образцы сывороток здоровых доноров, однако при этом следует подтверждать, что пороговая точка, чувствительность и селективность методики соответствуют параметрам образцов популяции пациентов, не получавших БтЛП, в период, когда они станут доступны для исследования.

Контроль неспецифического связывания -важный фактор при разработке и выборе методики. Следует учитывать, что все используемые в испытании компоненты, от пластикового планшета для микротитрования до проявляющего реактива, могут повлиять на чувствительность анализа и уровень неспецифического связывания. Одним из самых важных моментов является выбор надлежащего буферного раствора и реактивов, блокирующих неспецифическое связывание. Необходимо установить кратность и время этапов промывки, а также тщательно подобрать вещества, добавляемые в буферные растворы (например, в блокирующий или в промывающий буфер) для снижения фонового сигнала при сохранении чувствительности анализа. В качестве реактивов, блокирующих неспецифическое связывание, используют различные белки, однако следует учитывать, что они могут или недостаточно хорошо связываться с твердой фазой, или вступать в перекрестные реакции с реактивом для детектирования. В связи с этим может понадобиться проведение испытания с использованием нескольких блокирующих веществ для выбора оптимального.

Особое внимание следует обратить на то, что для разведения образцов, используемых в качестве контрольных, следует использовать ту же среду, в которой будут анализироваться исследуемые образцы, полученные от пациентов (например, тот же антикоагулянт).

Общие сведения о валидации методик

Валидация аналитической методики - это экспериментальное доказательство того, что методика пригодна для решения поставленных задач. Основные валидаци-онные характеристики методики включают пороговую точку, чувствительность и устойчивость к ЛП, присутствующему в исследуемом образце, специфичность и селективность, прецизионность, воспроизводимость (необходима для оценки образцов в нескольких лабораториях), робастность некоторых характеристик анализа и стабильность критических реактивов.

Объем исследований по валидации аналитических методик зависит от стадии разработки ЛП и рисков последствий проявления иммуногенности БтЛП для пациентов. Для ранних стадий разработки ЛП (фазы I и II клинических исследований) допускается использование методик, прошедших частичную валидацию, включающую оценку чувствительности, специфичности, правильности, прецизионности, пороговой точки и устойчивости к присутствию ЛП, с меньшим объемом сведений о робастности, воспроизводимости и стабильности. Следует отметить, что для ЛП, характеризующихся высоким риском проявления иммуно-

генности, может потребоваться проведение валидации методик в полном объеме до начала всех клинических исследований. При этом в любом случае для анализа образцов в опорных и пострегистрационных исследованиях должны использоваться методики, прошедшие валидацию в полном объеме [1, 4].

Одним из важных параметров валидации методики является определение пороговой точки, т. е. выраженности ответа при анализе, которая позволяет оценить ответ образца как положительный или отрицательный. Если для проведения валидации до начала исследования нет образцов от пациентов, ранее не получавших БтЛП, могут быть использованы альтернативные образцы, т. е. образцы сыворотки крови здоровых лиц или пациентов, не подвергавшиеся воздействию рассматриваемого терапевтического белка. При использовании альтернативных образцов пороговую точку следует подтверждать, когда будут доступны образцы от соответствующей исследуемой популяции пациентов. Если пороговая точка, установленная по образцам от пациентов, ранее не получавших БтЛП, будет значимо отличаться от точки, установленной при валидации методики, необходимо провести коррекцию ее значения.

Пороговая точка является важным параметром для валидации анализа по определению ADA и имеет решающее значение для оценки иммуногенности препарата в клинических испытаниях. FDA рекомендует использовать статистический подход для определения пороговой точки с соответствующей процедурой удаления выбросов [1]. Известно, что установление пороговой точки в анализе по определению ADA оказывает большое влияние на получение и интерпретацию результатов, однако стандартный статистический подход к ее определению не установлен. В исследовании K. Nishimura и соавт. для выяснения факторов, влияющих на определение пороговой точки, при участии нескольких лабораторий, сравнили статистические подходы и рассчитали пороговые точки для нескольких наборов данных по выявлению ADA, используя индивидуальную процедуру, применяемую в каждой лаборатории. Установлено, что исключение выбросов, частота ложноположительных результатов и распределение полученных данных оказывают наибольшее влияние на пороговую точку как скрининговых, так и подтверждающих исследований [48]. В работе J. Zhang и соавт. указывается на существенное неблагоприятное влияние аналитической изменчивости на надежность классификации ADA с точки зрения ложноположительных, ложноотрицательных результатов и значимого влияния биологической изменчивости. Последовательное удаление аналитических и биологических отклонений (5 % ложноположительных показателей и 1 % ложно-положительных показателей в скрининговых и подтверждающих анализах соответственно) оказывает минимальное влияние на чувствительность анализа и способствует адекватному выбору истинных положительных образцов [49].

Прецизионность между анализами рекомендуется оценивать при их выполнении в разные дни и разными аналитиками с использованием одной и той же инструментальной платформы и модели, однако для учета всех источников вариабельности следует использовать разное оборудование. В рамках одного анализа прецизионность рекомендуется оценивать с внесением на планшет, как минимум, 6 независимых проб одного образца, подготовленных одним и тем же аналитиком. В качестве альтернативы в анализах с низкой пропускной способностью (например, в анализах с титрованием), когда невозможно анализировать 6 независимых проб одного и того же образца на планшете, прецизионность в рамках одного анализа следует оценивать, как минимум, с 3 независимыми пробами одного и того же образца на планшете, а в целом использовать не менее 9 независимых проб одних и тех же образцов [1]. В число образцов следует включить образцы для отрицательного и положительного контролей, тестирование которых дает низкие, средние и высокие значения, входящие в динамический диапазон анализа. В целом ожидается, что прецизионность в рамках одного и нескольких анализов, выраженная через коэффициент вариации (CV, %), будет ниже 20 % [1]. Однако в некоторых форматах анализа, например, при применении методик с использованием культур клеток, указанный коэффициент может быть выше.

В зависимости от метода, технологии или инструментальной платформы анализа может понадобиться валидация дополнительных параметров. Иапример, для методик с использованием поверхностного плаз-монного резонанса рекомендуется валидация стабильности поверхности чипа после регенерации, а также установление критериев по исходным рабочим характеристикам чипа. В некоторых случаях необходимо устанавливать эффективность и стабильность меченых реактивов, время и температуру инкубации.

В процессе стандартной программы разработки БтЛП возможна модификация какой-либо методики по выявлению ADA. В таком случае могут потребоваться образцы для повторного тестирования с помощью оптимизированной валидированной методики. Следует предусмотреть хранение достаточного объема образцов в условиях, которые позволят провести повторные испытания с целью валидации методики в полном объеме.

Сбор и сроки исследования образцов сыворотки крови у пациентов

Особое внимание следует обратить на то, что образцы сыворотки крови пациентов должны быть собраны до начала лечения ЛП; следует учитывать, что в ряде случаев предсуществующие Ат к исследуемому терапевтическому белку уже могут присутствовать в крови пациентов. Очень важно отбирать образцы в такое время, когда на результаты анализа присутствующий в системном кровотоке терапевтический белок окажет минимальное действие. В связи с этим необходимо оценивать период полувыведения терапевтичес-

кого белка и режим дозирования, чтобы определить подходящее время отбора образцов. Это особенно важно для препаратов МкАт, поскольку их период полувыведения составляет несколько недель или более. Кроме того, следует учитывать, что в зависимости от режима дозирования МкАт могут оставаться в сыворотке крови в течение нескольких месяцев [1, 3, 4].

При отсутствии возможности получения образцов, не содержащих терапевтический белок во время фазы исследования, необходимо подобрать условия, обеспечивающие чувствительность анализа в присутствии ЛП, или отбирать образцы после соответствующего периода его выведения из организма (обычно это 5 периодов полувыведения).

После начала лечения время забора образцов будет зависеть от частоты дозирования ЛП, при этом забор образцов следует проводить перед введением очередной дозы препарата [1, 2, 4]. Для выявления раннего иммунного ответа, сопровождающегося формированием IgM-Ат, оптимальным является забор образцов крови через 7-14 дней после первого введения ЛП. Для выявления IgG-Ат оптимальным является забор образцов через 3-6 нед, для выявления IgA-Ат - примерно через 2-3 нед после первого приема ЛП. Этих временных интервалов может быть достаточно в случае получения пациентом одной дозы терапевтического белка. Однако, поскольку пациенты получают терапевтический белок многократно, образцы необходимо брать через соответствующие промежутки времени на протяжении всего периода исследования и примерно через 30 дней после последнего приема ЛП [50].

Если у ЛП длительный период полувыведения, образцы следует отбирать примерно через 5 периодов полувыведения после последнего приема ЛП. В случае высокого риска развития серьезных последствий формирования АТ, необходимо запланировать отбор образцов до того срока, пока уровень ADA не достигнет исходного уровня [1, 2, 4].

Следует обратить особое внимание на то, что исследуемый терапевтический белок сам по себе может подавлять иммунный ответ. В таких случаях схему отбора проб рекомендуется скорректировать в соответствии с режимом приема ЛП, насколько это возможно.

Отчет по оценке иммуногенности

При подаче документации на регистрацию ЛП на основе терапевтического белка данные по оценке имму-ногенности должны быть включены в общий технический документ (CTD). В представляемых материалах должна быть отражена полная информация, полученная на всех этапах разработки БтЛП, начиная с оценки риска иммуногенного потенциала рекомбинантного белка, являющегося кандидатом для создания ЛП, приведены данные по оценке качественных характеристик терапевтического белка, включающих определение структуры белковой молекулы, физико-химических, иммунохими-ческих и функциональных свойств с использованием широкого спектра современных методов исследования.

Следует представить краткое описание многоступенчатой стратегии проведения биологических анализов и валидации методик, дизайна клинических исследований с указанием сроков отбора проб, результаты анализа клинических данных по иммуногенности, выводы, стратегии оценки и снижения рисков. Важно подробно отразить сведения о том, как иммуногенность терапевтического белка влияет на его безопасность и эффективность в исследованной популяции пациентов. Кроме того, следует рассмотреть вопрос о том, как иммуно-генность терапевтического белка будет отслеживаться после регистрации ЛП и учитываться в любых запланированных стратегиях оценки и снижения рисков проявления иммуногенности для пациентов [1-4]. Все факторы риска развития иммуногенности должны быть выявлены и подтверждены на этапах разработки, оценки качества и клинических исследований и учтены при составлении Программы фармаконадзора за применением БтЛП в пострегистрационном периоде. Подходы для минимизации рисков проявления иммуногенности должны быть отражены в инструкции по применению БтЛП.

Заключение

Научный интерес к разработке и применению в медицинской практике терапевтических белков растет с каждым годом. Проявление их нежелательной имму-ногенности, провоцирующей развитие ряда побочных реакций, снижающей эффективность проводимой

■ Литература

1. Guideline on immunogenicity testing of therapeutic protein products - developing and validating assays for anti-drug antibody detection. US Department of Health and Human Services, US FDA, Rockville, MD, USA, 2019. URL: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/immunogenicity-testing-therapeutic-protein-products-developing-and-validating-assays-anti-drug

2. Guideline on Immunogenicity assessment of therapeutic proteins (EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006 Rev 1) Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) 18 May 2017. URL: https:// www.ema. europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-immunogenicity-assessment-therapeutic-proteins-revision-1_en

3. Guideline on immunogenicity assessment of monoclonal antibodies intended for in vivo clinical use (EMA/CHMP/ BMWP/86289/2010). URL: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-immunogenicity-assessment-monoclonal-antibodies-intended-vivo-clinical-use_en.pdf

4. Правила проведения исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза (Решение Совета Евразийской экономической комиссии № 89 от 03.11.2016) (ред. от 15.07.2022). URL: https://docs.eaeunion.org/docs/ru-ru/01411954/cncd_ 21112016_89

5. Faraji F., Karjoo Z., Moghaddam M.V., Heidari S., Ema-meh R.Z., Falak R. Challenges related to the immunogenicity of parenteral recombinant proteins: Underlying mechanisms and new approaches to overcome it. Int Rev Immunol. 2018; 37 (6): 301-15. DOI: https://doi.org/ 10.1080/08830185.2018.1471139

6. Harding F.A., Stickler M.M., Razo J., DuBridge R.B. The immunogenicity of humanized and fully human antibodies: residual immunogenicity resides in the CDR regions. MAbs. 2010; 2 (3): 256-65. DOI: https://doi.org/10.4161/mabs.2.3.11641

7. van Schouwenburg P. A., Kruithof S., Votsmeier C., van Schie K., Hart M.H., de Jong R N., van Buren E.L., van Ham M., Aarden L., Wol-

терапии, привело к тому, что оценка иммуногенности БтЛП в настоящее время является важным элементом при их регистрации. Оценка иммуногенности ЛП должна основываться на комплексном анализе данных ФК, ФД, иммуногенности, а также на показателях клинической эффективности и безопасности. При этом опасения по поводу проявлений их нежелательной иммуногенности, выражающейся в продукции ADA, привели к необходимости создания платформ, с помощью которых можно выявлять, определять уровень и характеризовать Ат к указанным белкам. Рекомендации международных документов согласованы в отношении принципов оценки иммуногенности и подхода, необходимого для ее изучения.

Общепризнано, что для оценки клинической значимости иммуногенности терапевтических средств необходим многоуровневый подход для обнаружения ADA. В основном данный подход включает проведение скрининговых и подтверждающих исследований, оценку нейтрализующей активности ADA и изучение их характеристик. Последовательность в оценке имму-ногенности предусматривает также использование стандартизированных протоколов и валидированных аналитических методик. Разработка адекватных тестов, обладающих высокой чувствительностью, точностью и специфичностью для выявления АТ к БтЛП, критически важна для контроля качества терапевтических белков и получения клинически значимых данных об их иммуногенности.

bink G., Wouters D., Rispens T. Functional analysis of the anti-adalimumab response using patient-derived monoclonal antibodies. J Biol Chem. 2014; 289 (50): 34482-88. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M114.615500

8. Dingman R., Balu-Iyer S.V. Immunogenicity of Protein Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 2019; 108 (5): 1637-54. DOI: https://doi.org/ 10.1016/j.xphs.2018.12.014

9. Vaisman-Mentesh A., Gutierrez-Gonzalez M., DeKosky B.J., Wine Y. The Molecular Mechanisms That Underlie the Immune Biology of Anti-drug Antibody Formation Following Treatment With Monoclonal Antibodies. Front Immunol. 2020 Aug 18; 11: 1951. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2020.01951

10. Авдеева Ж. И., Солдатов А.А., Бондарев В.П., Мосягин В.Д., Меркулов В. А. Лекарственные препараты фактора VIII, актуальные вопросы разработки, клинического исследования и применения (Часть 2). БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2021; 21 (2): 97-107.

11. Солдатов А.А., Авдеева Ж.И., Медуницын Н.В., Крючков Н.А. Механизмы развития нежелательного иммунного ответа при применении биотехнологических препаратов. Иммунология. 2017; 38 (5): 271-83.

12. Авдеева Ж.И., Солдатов А.А., Бондарев В.П., Меркулов В.А., Медуницын Н. В. Проблемы, связанные с нежелательной иммуно-генностью биотехнологических лекарственных препаратов (терапевтических белков). Сообщение 1. Методические подходы к оценке иммуногенности. Иммунология. 2019; 40 (3): 51-64. DOI: https://doi. org/10.24411/0206-4952-2019-13006

13. Авдеева Ж.И., Солдатов А.А., Мосягин В.Д., Медуни-цын Н.В. Проблемы, связанные с нежелательной иммуногенностью биотехнологических лекарственных препаратов (терапевтических белков). Сообщение 2. Клинические аспекты. Иммунология. 2019; 40 (4): 29-40. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-14004

14. Авдеева Ж.И., Солдатов А.А., Бондарев В.П., Мосягин В.Д., Меркулов В.А. Проблемы, связанные с проявлением иммуногенности биотерапевтических белков, и пути их решения. Иммунология. 2021; 42 (6): 706-19. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-0-0

15. Soldatov A., Avdeeva J., Kryuchkov N., Skosyreva E. Safety concerns of biosimilar hormone products. Current Medical Research & Opinion. 2019; 35 (6): 1003-09.

16. Нуриев Р.И., Караулов А.В., Киселевский М.В. Новые стратегии лечения пациентов с онкологическими заболеваниями: имму-нотерапевтический подход. Иммунология. 2017; 38 (1): 39-48. DOI: https://doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-1-39-48

17. Генно-инженерные биологические препараты в лечении ревматоидного артрита / гл. ред. акад. Е.Л. Насонов. Москва : ИМА-ПРЕСС; 2013. 552 с.

18. Van Stappen Th., Brouwers E., Vermeire S., Gils A. Validation of a sample pretreatment protocol to convert a drug-sensitive into a drug-tolerant anti-infliximab antibody immunoassay. Drug Test Anal. 2017; 9 (2): 243-47. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.1968

19. Atiqi S., Hooijberg F., Loeff F.C., RispensT., Wolbink G.J. Immunogenicity of TNF-Inhibitors. Front Immunol. 2020; 11: 312. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.00312

20. Mire-Sluis A.R., Barrett Y. C., Devanarayan V., Koren E., Liu H., Maia M., Parish T., Scott G., Shankar G., Shores E., Swanson S.J., Taniguchi G.,Wierda D., Zuckerman L.A. Recommendations for the design and optimization of immunoassays used in the detection of host antibodies against biotechnology products. J Immunol Methods. 2004; 289 (1-2): 1-16. DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2004.06.002

21. Gupta S., Indelicato S.R., Jethwa V, Kawabata T., Kelley M., Mire-Sluis A.R, Richards S. M, Rup B., Shores E., Swanson S.J, Wak-shull E. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. J Immunol Methods. 2007; 321 (1-2): 1-18. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jim.2006.12.004

22. Gupta, S., Devanarayan V., Finco D., Gunn G.R., Kirshner S., Richards S., Rup B., Song A., and Subramanyam M. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. J Pharm Biomed Anal. 2011; 55 (5): 878-88. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.jpba.2011.03.038

23. Shankar G., Devanarayan V., Amaravadi L., Barrett Y.C., Bow-sher R., Finco-Kent D., Fiscella M., Gorovits B., Kirschner S., Mox-ness M., Parish T., Quarmby V., Smith H., Smith W., Zuckerman L.A, Koren E. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. J Pharm Biomed Anal. 2008; 48 (5): 1267-81. DOI: https://doi.org/10.1016/j. jpba.2008.09.020

24. Suh K., Kyei I., Hage D.S. Approaches for the detection and analysis of antidrug antibodies to biopharmaceuticals: A review. J Sep Sci. 2022; 45 (12): 2077-92. DOI: https://doi.org/10.1002/jssc.202200112

25. Mojtahed Poor S., Ulshofer T., Gabriel T.A., Henke M., Kohm M., Behrens F., Geisslinger G., Parnham M.J., Burkhardt H., Schiffmann S. Immunogenicity assay development and validation for biological therapy as exemplified by ustekinumab. Clin Exp Immunol. 2019; 196 (2): 259-75. DOI: https://doi.org/10.1111/cei.13261

26. Hajela P., Patel R., Kale P., Kumar M., Khambhampaty S. A comparative multi-tiered immunogenicity assessment of biosimilar pegylated filgrastim: validation of methods for clinical assessment of INTP5. Expert Opin Biol Ther. 2022; 22 (2): 321-30. DOI: https://doi. org/10.1080/14712598.2022.2006630

27. Wadhwa M., Thorpe R. Harmonization and standardization of immunogenicity assessment of biotherapeutic products. Bioanalysis. 2019; 11 (17): 1593-604. DOI: https://doi.org/10.4155/bio-2019-0202

28. Matsumoto T., Shima M., Fukuda K., Nogami K., Giddings J.C., Murakami T., Tanaka I., Yoshioka A. Immunological characterization of factor VIII autoantibodies in patients with acquired hemophilia A in the presence or absence of underlying disease. Thromb Res. 2001; 104 (6): 381-88. DOI: https://doi.org/10.1016/S0049-3848(01)00385-1

29. Malucchi S., Bertolotto A. Clinical aspects of immunogenicity to biopharmaceuticals. In: Weert M, Moller EH, editors. Immunogenicity of biopharmaceuticals. Biotechnology: pharmaceutical aspects. XII. 1st ed. New York: Springer. 2008; 27-56.

30. Aalberse R.C., Schuurman J. IgG4 breaking the rules. Immunology. 2002; 105 (1): 9-19. DOI: https://doi.Org/10.1046/j.0019-2805. 2001.01341.x

31. Gorovits B., Wang Y., Zhu L., Araya M., Kamerud J., Lepsy Ch. Anti-drug Antibody Assay Conditions Significantly Impact Assay Screen and Confirmatory Cut-Points. AAPS J. 2019 Jun 3; 21 (4): 71. DOI: https:// doi.org/10.1208/s12248-019-0342-x

32. Davis R., Velkoska E., McCallum H., Majcen B., Gille A., Kingwell B., Martin K. A method for detection of anti-drug antibodies to a biotherapeutic (CSL112) with endogenous counterpart (apolipoprotein A-I) using a novel sample pre-treatment electrochemiluminescence assay. J Immunol Methods. 2023; 513: 113411. DOI: https://doi.org/10.1016/j. jim.2022.113411

33. Gorovits B., Roldan M.A., Baltrukonis D., Cai C-H., Donley J., Jani D., Kamerud J., McCush F., Thomas J.S., Wang Y. Anti-drug Antibody Assay Validation: Improved Reporting of the Assay Selectivity via Simpler Positive Control Recovery Data Analysis. AAPS J. 2019; 21 (5): 76. DOI: https://doi.org/10.1208/s12248-019-0347-5

34. Pöhler A., Emrich T., Jordan G., Schäfer M., Stubenrauch K.-G., Staack R.F, Zach C., Meir J., Faigle J. Comparison of assay formats used for the detection of pre-existing anti-drug antibodies against monoclonal antibodies. Bioanalysis. 2022; 14 (13): 923-33. DOI: https://doi. org/10.4155/bio-2022-0085

35. Ramsland P.A., Movafagh B.F., Reichlin M., Edmundson A.B. Interference of rheumatoid factor activity by aspartame, a dipeptide methyl ester. J Mol Recognit. 1999; 12 (5): 249-57.

36. Tatarewicz S., Miller J.M., Swanson S.J., Moxness M.S. Rheumatoid factor interference in immunogenicity assays for human monoclonal antibody therapeutics. Journal of Immunological Methods. 2010; 357 (1-2): 10-6. DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2010.03.012

37. Rispens T., de Vrieze H., de Groot E., Wouters D., Stapel S., Wolbink G. J, Aarden L.A. Antibodies to constant domains of therapeutic monoclonal antibodies: anti-hinge antibodies in immunogenicity testing. J Immunol Methods. 2012; 375 (1-2): 93-9. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.jim.2011.09.011

38. Hu J., Wala I., Han H., Nagatani J., Barger T., Civoli F., Kaliyaperumal A., Zhuang Y., Gupta S. Comparison of cell-based and non-cell-based assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins. J Immunol Methods. 2015; 419: 1-8. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.jim.2015.02.006

39. Wu B., Chung S., Jiang X.R., McNally J., Pedras-Vasconcelos J., Pillutla R., White J.T., Xu Y., Gupta S. Strategies to determine assay format for the assessment of neutralizing antibody responses to biotherapeutics. AAPS J. 2016; 18 (6): 1335-50. DOI: https://doi.org/10.1208/s12248-016-9954-6

40. Coddens A., Snoeck V., Bontinck L., Buyse M-A., O Pine S.O. An innovative method for characterizing neutralizing antibodies against antibody-derived therapeutics. J Immunol Methods. 2020; 487: 112896. DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2020.112896

41. Boulenouar H., Amar Y., Bouchoutrouch N., Faouzi M.E.A., Cherrah Y. Sefrioui H. Nanobodies and their medical applications. Genetics and Molecular Research. 2020; 19 (1): gmr18452. DOI: https:// doi.org/10.4238/gmr18452

42. Tada M., Suzuki T., Ishii-Watabe A. Development and characterization of an anti-rituximab monoclonal antibody panel. MAbs. 2018; 10 (3): 370-9. DOI: https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1424 610

43. Wadhwa M., Mytych D.T., Bird Ch., Barger T., Dougall Th., Han H., Rigsby P., Kromminga A., Thorpe R. Establishment of the first WHO Erythropoietin antibody reference panel: Report of an international collaborative study. J Immunol Methods. 2016; 435: 32-42. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.jim.2016.05.005

44. Shibata H., Nishimura K., Miyama Ch., Tada M., Suzuki T., Saito Y., Ishii-Watabe A. Comparison of different immunoassay methods to detect human anti-drug antibody using the WHO erythropoietin antibody reference panel for analytes. J Immunol Methods. 2018; 452: 73-7. DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2017.09.009

45. Suzuki T., Tada M., Ishii-Watabe A. Development of antidrug monoclonal antibody panels against adalimumab and infliximab. Biologicals. 2020; 63: 39-47. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.biologicals. 2019.12.003

46. Bivi N., Swearingen C.A., Shockley T.E., Sloan J.H., Pottanat T.G., Carter Q.L., Hodsdon M.E., Siegel R.W., Konrad R.J. Development and validation of a novel immunogenicity assay to detect anti-drug and anti-PEG antibodies simultaneously with high sensitivity. J Immunol Methods. 2020; 486: 112856. DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2020.112856. PMID: 32916164.

47. Künzel C., Abdolzade-Bavil A., Engel A.M., Pleitner M., Schick E., Stubenrauch K. Assay concept for detecting anti-drug IgM in human serum samples by using a novel recombinant human IgM positive control. Bioana-lysis. 2021; 13 (4): 253-63. DOI: https://doi.org/10.4155/bio-2020-0308

48. Nishimura K., Shibata N., Aoyama M., Hosogi J., Kadotsuji K., Minoura K., Mori T., Nakamura T., Nishimiya K., Nomura T., Saito T.,

Soma M., Wakabayashi H., Sakamoto N., Niimi S., Katori N., Saito Y., Ishii-Watabe A. Elucidation of the statistical factors that influence anti-drug antibody cut point setting through a multi-laboratory study. Bioanalysis. 2019; 11 (6): 509-24. DOI: https://doi.org/10.4155/bio-2018-0178

49. Zhang J., Arends R.H., Kubiak R.J., Roskos L.K., Liang M., Lee N., Chen C. C-K., Yang H. A new method for identification of outliers in immunogenicity assay cut point data. J Immunol Methods. 2020; 484-485: 112817. DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2020.112817

50. Macpherson A.J., McCoy K.D., Johansen F.E., Brandtzaeg P. The immune geography of IgA induction and function. Mucosal Immunol. 2010; 1 (1): 11-22. DOI: https://doi.org/10.1038/mi.2007.6

■ References

1. Guideline on immunogenicity testing of therapeutic protein products - developing and validating assays for anti-drug antibody detection. US Department of Health and Human Services, US FDA, Rockville, MD, USA, 2019. URL: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/immunogenicity-testing-therapeutic-protein-products-developing-and-validating-assays-anti-drug

2. Guideline on Immunogenicity assessment of therapeutic proteins (EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006 Rev 1) Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) 18 May 2017. URL: https://www.ema. europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-immunogenicity-assessment-therapeutic-proteins-revision-1_en

3. Guideline on immunogenicity assessment of monoclonal antibodies intended for in vivo clinical use (EMA/CHMP/ BMWP/86289/2010). URL: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-immunogenicity-assessment-monoclonal-antibodies-intended-vivo-clin-ical-use_en.pdf

4. Rules for conducting research on biological medicines of the Eurasian Economic Union (Decision of the Council of the Eurasian Economic Commission No. 89 dated 03.11.2016) (as amended on 07.15.2022). URL: https://docs.eaeunion.org/docs/ru-ru/01411954/ cncd_21112016_89 (in Russian)

5. Faraji F., Karjoo Z., Moghaddam M.V., Heidari S., Emameh R.Z., Falak R. Challenges related to the immunogenicity of parenteral recombinant proteins: Underlying mechanisms and new approaches to overcome it. Int Rev Immunol. 2018; 37 (6): 301-15. DOI: https://doi.org/10.1080/0 8830185.2018.1471139

6. Harding F.A., Stickler M.M., Razo J., DuBridge R.B. The immunogenicity of humanized and fully human antibodies: residual immunogenicity resides in the CDR regions. MAbs. 2010; 2 (3): 256-65. DOI: https:// doi.org/10.4161/mabs.2.3.11641

7. van Schouwenburg P.A., Kruithof S., Votsmeier C., van Schie K., Hart M.H., de Jong R N., van Buren E.L., van Ham M., Aarden L., Wol-bink G., Wouters D., Rispens T. Functional analysis of the anti-adali-mumab response using patient-derived monoclonal antibodies. J Biol Chem. 2014; 289 (50): 34482-88. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M114.615500

8. Dingman R., Balu-Iyer S.V. Immunogenicity of Protein Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 2019; 108 (5): 1637-54. DOI: https://doi.org/10.1016/j. xphs.2018.12.014

9. Vaisman-Mentesh A., Gutierrez-Gonzalez M., DeKosky B.J., Wine Y., The Molecular Mechanisms That Underlie the Immune Biology of Anti-drug Antibody Formation Following Treatment With Monoclonal Antibodies. Front Immunol. 2020; 11: 1951. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2020.01951

10. Avdeeva Z.I., Soldatov A.A., Bondarev V.P., Mosyagin V.D., Merkulov V.A. Factor VIII products: key aspects of development, clinical research and use (part 2). BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2021; 21 (2): 97-107. DOI: https://doi.org/10.30895/2221-996X-2021-21-2-97-107 (in Russian)

11. Soldatov A.A., Avdeeva Zh.I., Medunitsyn N.V., Kryuchkov N.A. Mechanisms of development of an undesirable immune response in the use of biotechnological drugs. Immunologiya. 2017; 38 (5): 271-83. (in Russian)

12. Avdeeva Zh.I., Soldatov A.A., Bondarev V.P., Merkulov V.A., Medunitsyn N.V. The problems concerned with undesirable immuno-genicity of biotechnological medicines (therapeutic proteins). Part 1. Methodological approaches to the evaluation of immunogenicity. Immu-

nologiya. 2019; 40 (3): 51-64. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-13006 (In Russian)

13. Avdeeva Zh.I., Soldatov A.A., Mosyagin V.D., Medunitsyn N.V. The problems connected with unwanted immunogenicity of biotechno-logical medicines (therapeutic proteins). Part 2. Clinical aspects. Immu-nologiya. 2019; 40 (4): 29-40. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-14004 (in Russian)

14. Avdeeva Zh.I., Soldatov A.A., Bondarev V.P., Mosyagin V.D., Merkulov V.A. Problems associated with the manifestation of immunoge-nicity of biotherapeutic proteins and ways to solve them. Immunologiya. 2021; 42 (6): 706-19. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-706-719 (in Russian)

15. Soldatov A., Avdeeva J., Kryuchkov N., Skosyreva E. Safety concerns of biosimilar hormone products. Current Medical Research & Opinion. 2019; 35 (6): 1003-09.

16. Nuriev R.I., Karaulov A.V., Kisielewski M.V. Novel treatment strategies for patients with cancer: immunotherapeutic approach. Immu-nologiya. 2017; 38 (1): 39-48. DOI: https://doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-1-39-48 (in Russian)

17. Genetically engineered biological drugs in the treatment of rheumatoid arthritis / ch. ed. Academician E.L. Nasonov. Moscow: IMA-PRESS; 2013. 552 p. (in Russian)

18. Van Stappen Th., Brouwers E., Vermeire S., Gils A. Validation of a sample pretreatment protocol to convert a drug-sensitive into a drug-tolerant anti-infliximab antibody immunoassay. Drug Test Anal. 2017; 9 (2): 243-47. DOI: https://doi.org/10.1002/dta.1968

19. Atiqi S., Hooijberg F., Loeff F.C., RispensT., Wolbink G.J. Immunogenicity of TNF-Inhibitors. Front Immunol. 2020; 11: 312. DOI: https:// doi.org/10.3389/fimmu.2020.00312

20. Mire-Sluis A.R., Barrett Y. C., Devanarayan V., Koren E., Liu H., Maia M., Parish T., Scott G., Shankar G., Shores E., Swanson S.J., Tani-guchi G., Wierda D., Zuckerman L.A. Recommendations for the design and optimization of immunoassays used in the detection of host antibodies against biotechnology products. J Immunol Methods. 2004; 289 (1-2): 1-16. DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2004.06.002

21. Gupta S., Indelicato S.R., Jethwa V., Kawabata T., Kelley M., Mire-Sluis A.R, Richards S. M, Rup B., Shores E., Swanson S.J, Wak-shull E. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. J Immunol Methods. 2007; 321 (1-2): 1-18. DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2006.12.004

22. Gupta, S., Devanarayan V., Finco D., Gunn G.R., Kirshner S., Richards S., Rup B., Song A., Subramanyam M. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. J Pharm Biomed Anal. 2011; 55 (5): 878-88. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.jpba.2011.03.038

23. Shankar G., DevanarayanV.,Amaravadi L., BarrettY.C., Bowsher R., Finco-Kent D., Fiscella M., Gorovits B., Kirschner S., Moxness M., Parish T., Quarmby V., Smith H., Smith W., Zuckerman L.A, Koren E. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. J Pharm Biomed Anal. 2008; 48 (5): 1267-81. DOI: https://doi.org/10.1016/jjpba.2008.09.020

24. Suh K., Kyei I., Hage D.S. Approaches for the detection and analysis of antidrug antibodies to biopharmaceuticals: A review. J Sep Sci. 2022; 45 (12): 2077-92. DOI: https://doi.org/10.1002/jssc.202200112

25. Mojtahed Poor S., Ulshöfer T., Gabriel T.A., Henke M., Köhm M., Behrens F., Geisslinger G., Parnham M.J., Burkhardt H., Schiffmann S. Immunogenicity assay development and validation for biological therapy as exemplified by ustekinumab. Clin Exp Immunol. 2019; 196 (2): 259-75. DOI: https://doi.org/10.1111/cei.13261

26. Hajela P., Patel R., Kale P., Kumar M., Khambhampaty S. A comparative multi-tiered immunogenicity assessment of biosimilar pegylated filgrastim: validation of methods for clinical assessment of INTP5. Expert Opin Biol Ther. 2022; 22 (2): 321-30. DOI: https://doi.org/10.1080/ 14712598.2022.2006630

27. Wadhwa M., Thorpe R. Harmonization and standardization of immunogenicity assessment of biotherapeutic products. Bioanalysis. 2019; 11 (17): 1593-604. DOI: https://doi.org/10.4155/bio-2019-0202

28. Matsumoto T., Shima M., Fukuda K., Nogami K., Giddings J.C., Murakami T., Tanaka I., Yoshioka A. Immunological characterization of factor VIII autoantibodies in patients with acquired hemophilia A in the presence or absence of underlying disease. Thromb Res. 2001; 104 (6): 381-88. DOI: https://doi.org/10.1016/S0049-3848(01)00385-1

29. Malucchi S., Bertolotto A. Clinical aspects of immunogenicity to biopharmaceuticals. In: Weert M, Moller EH, editors. Immunogenicity of biopharmaceuticals. Biotechnology: pharmaceutical aspects. XII. 1st ed. New York: Springer; 2008; 27-56.

30. Aalberse R.C., Schuurman J. IgG4 breaking the rules. Immunology. 2002; 105 (1): 9-19. DOI: https://doi.org/10.1046/j.0019-2805.2001.01341.x

31. Gorovits B., Wang Y., Zhu L., Araya M., Kamerud J., Lepsy Ch. Anti-drug Antibody Assay Conditions Significantly Impact Assay Screen and Confirmatory Cut-Points. AAPS J. 2019; 21 (4): 71. DOI: https://doi. org/10.1208/s12248-019-0342-x

32. Davis R., Velkoska E., McCallum H., Majcen B., Gille A., Kingwell B., Martin K. A method for detection of anti-drug antibodies to a biotherapeutic (CSL112) with endogenous counterpart (apolipoprotein A-I) using a novel sample pre-treatment electrochemiluminescence assay. J Immunol Methods. 2023; 513: 113411. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.jim.2022.113411

33. Gorovits B., Roldan M.A., Baltrukonis D., Cai C-H., Donley J., Jani D., Kamerud J., McCush F., Thomas J.S, Wang Y. Anti-drug Antibody Assay Validation: Improved Reporting of the Assay Selectivity via Simpler Positive Control Recovery Data Analysis. AAPS J. 2019; 21 (5): 76. DOI: https://doi.org/10.1208/s12248-019-0347-5

34. Pöhler A., Emrich T., Jordan G., Schäfer M., Stubenrauch K.-G., Staack R.F, Zach C., Meir J., Faigle J. Comparison of assay formats used for the detection of pre-existing anti-drug antibodies against monoclonal antibodies. Bioanalysis. 2022; 14 (13): 923-33. DOI: https://doi. org/10.4155/bio-2022-0085

35. Ramsland P.A., Movafagh B.F., Reichlin M., Edmundson A.B. Interference of rheumatoid factor activity by aspartame, a dipeptide methyl ester. J Mol Recognit. 1999; 12 (5): 249-57.

36. Tatarewicz S., Miller J.M., Swanson S.J., Moxness M.S. Rheumatoid factor interference in immunogenicity assays for human monoclonal antibody therapeutics. Journal of Immunological Methods. 2010; 357 (1-2): 10-6. DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2010.03.012

37. Rispens T., de Vrieze H., de Groot E., Wouters D., Stapel S., Wolbink G.J, Aarden L.A. Antibodies to constant domains of therapeutic monoclonal antibodies: anti-hinge antibodies in immunogenicity testing. J Immunol Methods. 2012; 375 (1-2): 93-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j. jim.2011.09.011

38. Hu J., Wala I., Han H., Nagatani J., Barger T., Civoli F., Kaliyape-rumal A., Zhuang Y., Gupta S. Comparison of cell-based and non-cell-based

Сведения об авторах

Авдеева Жанна Ильдаровна - д-р мед. наук, проф., гл. эксперт Управления экспертизы аллергенов, цито-кинов и других иммуномодуляторов Центра экспертизы и контроля МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: avd-cytok@yandex.ru http://orcid.org/0000-0002-9377-1378

assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins. J Immunol Methods. 2015; 419: 1-8. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.jim.2015.02.006

39. Wu B., Chung S., Jiang X.R., McNally J., Pedras-Vasconcelos J., Pillutla R., White J.T., Xu Y., Gupta S. Strategies to determine assay format for the assessment of neutralizing antibody responses to biotherapeutics. AAPS J. 2016; 18 (6): 1335-50. DOI: https://doi.org/10.1208/s12248-016-9954-6

40. Coddens A., Snoeck V., Bontinck L., Buyse M-A., O Pine S.O. An innovative method for characterizing neutralizing antibodies against antibody-derived therapeutics. J Immunol Methods. 2020; 487: 112896. DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2020.112896

41. Boulenouar H., Amar Y., Bouchoutrouch N., Faouzi M.E.A., Cherrah Y., Sefrioui H. Nanobodies and their medical applications. Genetics and Molecular Research. 2020; 19 (1): gmr18452. DOI: https:// doi.org/10.4238/gmr18452

42. Tada M., Suzuki T., Ishii-Watabe A. Development and characterization of an anti-rituximab monoclonal antibody panel. MAbs. 2018; 10 (3): 370-79. DOI: https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1424610

43. Wadhwa M., Mytych D.T., Bird Ch., Barger T., Dougall Th., Han H., Rigsby P., Kromminga A., Thorpe R. Establishment of the first WHO Erythropoietin antibody reference panel: Report of an international collaborative study. J Immunol Methods. 2016; 435: 32-42. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.jim.2016.05.005

44. Shibata H., Nishimura K., Miyama Ch., Tada M., Suzuki T., Saito Y., Ishii-Watabe A. Comparison of different immunoassay methods to detect human anti-drug antibody using the WHO erythropoietin antibody reference panel for analytes. J Immunol Methods. 2018; 452: 73-7. DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2017.09.009

45. Suzuki T., Tada M., Ishii-Watabe A. Development of antidrug monoclonal antibody panels against adalimumab and infliximab. Biologicals. 2020; 63: 39-47. DOI: https://doi.org/10.1016j.biologi-cals.2019.12.003

46. Bivi N., Swearingen C.A., Shockley T.E., Sloan J.H., Potta-nat T.G., Carter Q.L., Hodsdon M.E., Siegel R.W., Konrad R.J. Development and validation of a novel immunogenicity assay to detect anti-drug and anti-PEG antibodies simultaneously with high sensitivity. J Immunol Methods. 2020; 486: 112856. DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2020.112856

47. Künzel C., Abdolzade-Bavil A., Engel A.M., Pleitner M., Schick E., Stubenrauch K. Assay concept for detecting anti-drug IgM in human serum samples by using a novel recombinant human IgM positive control. Bioanalysis. 2021; 13 (4): 253-63. DOI: https://doi.org/10.4155/ bio-2020-0308

48. Nishimura K., Shibata N., Aoyama M., Hosogi J., Kadotsuji K., Minoura K., Mori T., Nakamura T., Nishimiya K., Nomura T., Saito T., Soma M., Wakabayashi H., Sakamoto N., Niimi S., Katori N., Saito Y., Ishii-Watabe A. Elucidation of the statistical factors that influence anti-drug antibody cut point setting through a multi-laboratory study. Bioanalysis. 2019; 11 (6): 509-24. DOI: https://doi.org/10.4155/bio-2018-0178

49. Zhang J., Arends R.H., Kubiak R.J., Roskos L.K., Liang M., Lee N., Chen C. C-K., Yang H. A new method for identification of outliers in immunogenicity assay cut point data. J Immunol Methods. 2020; 484-5: 112817 DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2020.112817

50. Macpherson A.J., McCoy K.D., Johansen F.E., Brandtzaeg P. The immune geography of IgA induction and function. Mucosal Immunol. 2010; 1 (1): 11-22. DOI: https://doi.org/10.1038/mi.2007.6

Authors' information

Zhanna I. Avdeeva - MD, PhD, Prof., Chief Expert of the Department for the Expertise of Allergens, Cytokines and Other Immunomodulators of the Center for Expertise of MIBP of the NCESMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: avdeeva@expmed.ru http://orcid.org/0000-0002-9377-1378

Солдатов Александр Алексеевич - д-р мед. наук, начальник Управления экспертизы противовирусных МИБП Центра экспертизы и контроля МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

E-mail: soldatov@expmed.ru http://orcid.org/0000-0001-6624-2692

Алпатова Наталья Александровна - д-р биол. наук, главный эксперт лаб. иммунологии Испытательного центра МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: alpatova@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-6807-508X

Бондарев Владимир Петрович - д-р мед. наук, проф., зам. директора Центра экспериментальной физиологии ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, Москва, Российская Федерация

E-mail: vbondarev@cspfmba.ru http://orcid.org/0000-0001-6472-6386

Мосягин Вячеслав Дмитриевич - д-р мед. наук, проф., начальник Управления экспертизы аллергенов, цитокинов и других иммуномодуляторов Центра экспертизы и контроля МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: mosyagin@expmed.ru http://orcid.org/0000-0003-0269-8337

Коровкин Алексей Сергеевич - канд. мед. наук, директор Центра экспертизы и контроля МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

E-mail: korovkinas@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-3241-1053

Меркулов Вадим Анатольевич - д-р мед. наук, проф., зам. ген. директора по экспертизе лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: merkulov @expmed.ru http://orcid.org/0000-0003-4891-973X

Aleksandr A. Soldatov - MD, PhD, Head of the Department for Expertise of Antiviral MIBP of the Center for the Expertise and Control of MIBP of the NCESMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: soldatov@expmed.ru http://orcid.org/0000-0001-6624-2692

Natalia A. Alpatova - Dr.Sci, PhD, Chief Expert of the Lab. of Immunology of the NCESMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: alpatova@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-6807-508X

Vladimir P. Bondarev - MD, PhD, Prof., Deputy Director of the Center for Experimental Physiology of the CSP of the FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: vbondarev@cspfmba.ru http://orcid.org/0000-0001-6472-6386

Vyacheslav D. Mosyagin - MD, PhD, Prof., Head of the Department for the Expertise of Allergens, Cytokines and Other Immunomodulators of the Center for the Expertise and Control of MIBP of the NCESMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mosyagin@expmed.ru http://orcid.org/0000-0003-0269-8337

Alexey S. Korovkin - PhD, Director of the Center for the Expertise and Control of MIBP of the NCESMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: korovkinas@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-3241-1053

Vadim A. Merkulov - MD, PhD, Prof., Deputy General Director for the Expertise of medicines of the NCESMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: merkulov@expmed.ru http://orcid.org/0000-0003-4891-973X