CC BY
8
УДК 616.15-074:615.9-07:615.2:57.082.2
ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ИЗУЧЕНИИ СУБХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧНОСТИ ПРЕПАРАТА
1-КАРНИТИН
Сабирзянова Л.И.1 - к.вет.н., Коновалова Г.В.2 - зав. отделом доклинических исследований, Токарь В.В.2 - зам. заведующего отделом доклинических исследований
1ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины» 2ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных
средств для животных и кормов»
Ключевые слова: L-карнитин, лабораторные животные, доклинические исследования, субхроническая токсичность, гематологические показатели
Keywords: L-carnitine, laboratory animals, preclinical studies, subchronic toxicity, hematological indicators
Использование ^карнитина в кормлении сельскохозяйственных
животных на данный момент представляет особый научно-практический интерес в животноводстве. ^карнитин в организме млекопитающих находится во всех органах и тканях, использующих жирные кислоты как главный источник энергии. При увеличении нагрузок на организм (лактация, стельность, стрессы, болезни) повышаются потребности организма животного в ^карнитине, в связи с чем возникает необходимость его поступления с кормовыми добавками или с кормом [3].
^карнитин в клинической практике достаточно широко применяют - его используют при нейропатических расстройствах, диабете, сепсисе, кардиомиопатии, циррозе печени, недоедании, эндокринных расстройствах, старении. Описанные эпидемиологические и экспериментальные исследования использования ^карнитина в качестве терапевтического средства подтверждают целесообразность его применения в лечебной практике в ветеринарии [1,4].
В Российской Федерации на сегодняшний день нет зарегистрированной инъекционной лекарственной формы левокарнитина для ветеринарного применения, поэтому основной целью нашей работы было проведение доклинических исследований !-карнитина
для ветеринарного применения, в частности субхронической токсичности на лабораторных животных.
Материал и методы
исследований. Изучение параметров субхронической токсичности
инъекционной лекарственной формы ^карнитина проводили согласно требованию Приказа Министерства сельского хозяйства Российской Федерации от 6 марта 2018 года № 101 "Об утверждении правил проведения доклинического исследования
лекарственного средства для
ветеринарного применения, клинического исследования лекарственного препарата для ветеринарного применения, исследования биоэквивалентности
лекарственного препарата для
ветеринарного применения", «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005), ГОСТ 33215-2014 [2, 4, 5]. Все эксперименты провед ен ы с соблюдением правил, определенных Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей.
Исследования токсичности были проведены в виварии Санкт-Петербургского государственного
университета ветеринарной медицины, в октябре 2021 года. В исследовании
участвовали аутбредные крысы (самки) (n=30) массой 190-210 г, закупленные в Федеральном государственном унитарном предприятии «Питомник лабораторных животных «Рапполово».
Перед исследованием все животные были подвергнуты профилактическому карантинированию в течение 14 дней. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного два раза в день. Оценивали поведение, общее состояние, заболеваемость, смертность. Перед началом исследования животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, были распределены на группы по принципу аналогов.
В ходе исследования использовали клетки для содержания лабораторных мышей и крыс М-5 (475x350x200 мм) 3W со съемным поддоном. Для кормления животных использовался комбикорм полнорационный для лабораторных животных ЛБК-120 (Тосненский комбикормовый завод), соответствующий ГОСТу 34566-2019. Профильтрованная водопроводная вода давалась в стандартных автоклавированных поилках. Для внутримышечных введений использовали шприцы инсулиновые BD Micro-Fine Plus 0,5млШ-100 30G (0,30 мм х 8 мм) [2]. При изучении субхронической токсичности при внутримышечном введении, l-карнитин вводили в 2 уровнях доз. Дозы определялись на основании результатов опыта по острой токсичности: 1/5 и 1/10 от максимальной переносимый дозы. Первая подопытная группа (n=10) получала лекарственный препарат внутримышечно в дозе 0,08 мг/кг (1/5 от 2000мг/кг). Вторая подопытная группа (n=10) получала лекарственный препарат внутримышечно в дозе 0,04 мг/кг (1/10 от 2000мг/кг). Контрольная группа (n=10) получала внутримышечно натрия хлорид 0,09 % в объеме, эквивалентном среднему объему вводимого препарата на голову 1/5 от 2000 мг/кг. Препарат вводят внутримышечно ежедневно в течение 42 дней (субхроническое исследование проводится в период трехкратно превышающий максимальный период
применения в соответствии с проектом инструкции). Убой и отбор проб биологического материала от 5 животных из каждой группы проводили на следующий день после окончания введения препарата (43 день), убой и отбор биологического материала от оставшихся животных - через 10 суток после окончания введения (53 день). В таблицах ниже указан используемый статистический критерий Манна-Уитни, средние значения признаков в каждой группе, стандартное отклонение среднего SEM, коэффициент вариации Cv%, статистическая значимость или Р-значение (столбец «Р»). Решение о значимости различий средних или медиан в двух группах принимается по Р-значению. Рассчитанное для каждого признака Р-значение мы сравнивали с пороговым уровнем значимости, 0,05. Если Р-значение <0,05, то статистически значимые различия показателей в двух группах выявлены.
Гематологические исследования проводили сразу после забора цельной крови с ЭДТА с использованием автоматического анализатора Micros 60. Количество лейкоцитов включало: общее количество лейкоцитов (WBC, 10 3 /мкл), лимфоциты, нейтрофилы (включая нейтрофильные и базофильные
гранулоциты), моноциты и эозинофилы. Лимфоциты, нейтрофилы, моноциты выражали в гига на литр и в процентах.
Дополнительно готовили мазки крови по Паппенгейму. Для этого мазки клеток окрашивали смесью растворов краски Май-Грюнвальда и Романовского -Гимза. Дифференцировку
полиморфноядерных (PMN) лейкоцитов проводили вручную с помощью световой микроскопии (Микроскоп AXIOSTAR PLUS ZEISS (CARL ZEISS) (GERMANY) и видеокамеры Pixera pro 150 ES, на основе их морфологических и цитохимических характеристик окрашивания. Клетки PMN классифицировали как зрелые клетки, когда ядра были разделены, по крайней мере, на два морфологически различных сегмента (сегментарные нейтрофилы) или классифицировали как незрелые клетки.
На образце подсчитывали 100 клеток, лейкоцитарную формулу в мазках крови, окрашенных по Паппенгейму,
трехпольным методом по Филипченко.
Результат исследований. При проведении оценки субхронической токсичности от лабораторных животных отбирали цельную кровь в одноразовые пластиковые пробирки, маркировали и
отправляли в лабораторию на клиническое исследование. Ниже приведены результаты гематологических
исследований у первой опытной группы и группы контроля, отобранных на следующий день после окончания внутримышечных инъекции 1-карнитина в дозе 0,08 мг/кг. на 43 день (Таблица 1).
Таблица 1 - Сравнение морфологических показателей крови подопытной группы крыс 1 с контрольной группой на 43 день эксперимента
Показатель Группа 1 Контрольная группа P
M±SEM Cv,% M±SEM Cv,%
Гематокрит л/л 49,2±3,4 15,3 54,8±1,9 7,6 0,2477
Гемоглобин, г/л 120,2±3,2 6,0 118,6±3,1 5,8 0,9166
Лейкоциты, 10*9/л 12,4±1,4 26,2 10,4±2,4 52,8 0,5309
Лимфоциты 684±3,0 9,8 66,4±1,9 6,4 0,6004
Моноциты 6,6±1,1 36,5 5,6±0,4 16,0 0,6654
Нейтрофилы Палочкоядерные, % 1,4±0,5 81,4 1,4±0,2 39,1 1,0
Нейтрофилы Сегментоядерные, % 20,2±2,1 22,8 24,0±1,7 15,9 0,1732
Тромбоциты, 10*9/л 182,0±7,2 8,9 158,6±9,5 13,4 0,2963
Эозинофилы, % 0,4±0,2 136,9 1,2±0,7 136,9 0,4884
Эритроциты, 10*12/л 7,6±0,4 10,7 7,7±0,2 6,8 0,9155
Таблица 2 - Сравнение подопытной группы 1 с контрольной группой по морфологическим
показателям крови на 53 день эксперимента
Показатель Группа 1 Контрольная группа Р
M±SEM Cv,% M±SEM Cv,%
Гематокрит л/л 53,0±2,0 8,4 48,4±1,4 6,5 0,115
Гемоглобин, г/л 119,8±3,2 5,9 116,0±3,7 7,2 0,4005
Лейкоциты, 10*9/л 11,4±0,9 18,0 15,3±1,5 22,2 0,0947
Лимфоциты 75,2±2,2 6,6 70,8±2,8 8,9 0,2073
Могоциты 1,2±0,2 37,3 1,2±0,2 37,3 0,8808
Нейтрофилы Палочкоядерные, % 0,6±0,4 149,1 1,2±0,2 37,3 0,2123
Нейтрофилы Сегментоядерные, % 20,8±1,5 15,7 22,0±1,9 19,6 0,6723
Тромбоциты, 10*9/л 113,0±3,0 6,0 152,0±12,7 18,6 0,057
Эозинофилы, % 0,2±0,2 223,6 0,6±0,2 91,3 0,2703
Эритроциты, 10*12/л 6,7±0,2 5,3 7,7±0,5 15,8 0,1719
После введения внутримышечных инъекций 1-карнитина в дозах 0,08 мг/кг (1/5 от 2000 мг/кг) мы исследовали морфологические показатели у первой опытной группы и группы контроля через
10 суток после окончания введения препаратов (53 день) (Таблица 2). Исследование морфологических
показателей после введения
внутримышечной инъекции !-карнитина в
дозах 0,04 мг/кг (1/10 от 2000 мг/кг) у первой опытной группы и сравнение её с группой контроля, проводили на следующий день после окончания введения препаратов (43 день) (Таблица 3).
Результаты исследования
морфологических показателей крови у
лабораторных животных после
внутримышечных инъекций 1-карнитина в дозах 0,04 мг/кг (1/10 от 2000 мг/кг) у первой опытной группы и группы контроля через 10 суток после окончания введения (53 день) (Таблица 4).
Таблица 3 - Сравнение показателям крови на 43
подопытной группы 2 с контрольной группой по морфологическим день эксперимента
Показатель Группа 2 Контрольная группа P
M±SEM Cv,% M±SEM Cv,%
Гематокрит л/л 54,2±1,0 4,0 54,8±1,9 7,6 0,6674
Гемоглобин, г/л 119,6±2,4 4,5 118,6±3,1 5,8 0,8335
Лейкоциты, 10*9/л 16,8±2,1 28,1 10,4±2,4 52,8 0,0947
Лимфоциты 71,2±1,9 6,1 66,4±1,9 6,4 0,1732
Моноциты 5,2±1,2 53,4 5,6±0,4 16,0 0,2343
Нейтрофилы Палочкоядерные, % 1,6±0,5 71,3 1,4±0,2 39,1 0,7382
Нейтрофилы Сегментоядерные, % 20,0±1,0 11,7 24,0±1,7 15,9 0,0907
Тромбоциты, 10*9/л 152,6±10,7 15,6 158,6±9,5 13,4 0,6004
Эозинофилы, % 0,4±0,2 136,9 1,2±0,7 136,9 0,4884
Эритроциты, 10*12/л 7,6±0,2 5,8 7,7±0,2 6,8 0,7518
Таблица 4 - Сравнение подопытной группы 2 с контрольной группой по морфологическим показателям крови на 53 день эксперимента._
Показатель Группа 2 Контрольная группа P
M±SEM Cv,% M±SEM Cv,%
Гематокрит л/л 51,2±0,6 2,5 48,4±1,4 6,5 0,0705
Гемоглобин, г/л 120,6±0,9 1,7 116,0±3,7 7,2 0,3457
Лейкоциты, 10*9/л 14,2±1,2 19,3 15,3±1,5 22,2 0,8345
Лимфоциты 63,8±2,1 7,5 70,8±2,8 8,9 0,1412
Могоциты 1,4±0,2 39,1 1,2±0,2 37,3 0,6005
Нейтрофилы 1,2±0,2 37,3 1,2±0,2 37,3 0,8808
Палочкоядерные, %
Нейтрофилы Сегментоядерные, % 24,0±1,3 12,1 22,0±1,9 19,6 0,4633
Тромбоциты, 10*9/л 157,2±7,6 10,8 152,0±12,7 18,6 1,0
Эозинофилы, % 0,6±0,2 91,3 0,6±0,2 91,3 0,9025
Эритроциты, 10*12/л 7,3±0.3 9,3 7,7±0,5 15,8 0,6723
Заключение. В результате проведенных исследований хронической токсичности на лабораторных животных лекарственного препарата 1-карнитин для ветеринарного применения при
внутримышечном введении установлено, что дозировка 1/5 и 1/10 от максимальной переносимой дозы, вводимая на
протяжении сорока двух дней не вызывает внешних признаков токсикоза и гибели крыс. Шерстный покров был чистым и блестящим. Животные опытных групп охотно потребляли корм и воду; отсутствовали возбуждение или угнетение, мышечные подергивания, тремор, парезы, выделения из носа, глаз, ротовой полости
или иные признаки интоксикации. Токсических эффектов при применении препарата в течение 42 дней выявлено не было.
Статистически достоверных
отклонений в гематологических показателях крови животных опытных и контрольных групп обнаружено не было.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Влияние L-карнитина на иммунологические, интегральные и биохимические показатели мышей, получающих рацион с избытком жира и фруктозы / Н. Трусов, К. Мжельская, В. Шипелин [и др.] // Российский физиолологический журнал им. И. М. Сеченова. - 2019. - № 5. - С. 619633.
2. ГОСТ 33215-2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур (Переиздание): межгос. стандарт: изд. офиц.: дата введения 2016-07-01. -Москва: Стандартинформ, 2019. - 13 с.
3. Клементьева, Ю. И. Использование L-карнитина в защищённой форме в рационах высокопродуктивных коров / Ю. И. Клементьева. - Текст:
электронный // Сборник научных трудов СКНИИЖ. - Московская область, 2014. -URL:
https://cyb erleninka.ru/arti cle/n/ispolzovanie-l-karnitina-v-zaschischyonnoy-forme-v-ratsionah-vysokoproduktivnyh-korov (дата обращения: 08.05.2022).
4. Приказ МСХ РФ от 06.03.2018 г. № 101 «Об утверждении правил проведения доклинического исследования лекарственного средства для ветеринарного применения, клинического исследования лекарственного препарата для ветеринарного применения, исследования биоэквивалентности лекарственного препарата для ветеринарного применения.
5. Хабриев, Р. У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических лекарственных средств / Р. У. Хабриев // 2-изд., перераб. и доп. - Москва: ОАО "Издательство "Медицина", 2005. - 832 с.
6. Effects of a Dietary L-Carnitine Supplementation on Performance, Energy Metabolism and Recovery from Calving in Dairy Cows / J. Meyer, S. U. Daniels, S. Grindler [et al.] // Animals (Basel). - 2020. - Vol. 10 - № 2. - P. 342.
ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ИЗУЧЕНИИ СУБХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧНОСТИ ПРЕПАРАТА
l-КАРНИТИН
Сабирзянова Л.И., Коновалова Г.В., Токарь В.В.
Резюме
Данная статья специализирована на доклинических исследованиях инъекционного препарата l-карнитин. Предметом исследования служили аутбредные крысы (n=30) самки массой 190-210 грамм. Все лабораторные животные были разделены на 3 группы: 2 опытные и 1 контрольная. В качестве основного рациона крысы получали полнорационный комбикорм для лабораторных животных ЛБК-120. Крысам опытных групп вместе с основным рационом вводили внутримышечно инъекционный препарат l-карнитин в дозах, определенных условиями исследования. По завершению эксперимента установили, что высокие дозы l-карнитина при внутримышечном введении не вызывают значимых изменений гематологических показателей крови.
STUDIES OF HEMATOLOGICAL PARAMETERS LABORATORY ANIMALS IN THE STUDY OF SUBCHRONIC TOXICITY OF THE DRUG l-CARNITINE
Sabirzyanova L.I., Konovalova G.V., Turner V.V.
Summary
This article is specialized in preclinical studies of the injectable drug l-carnitine. The subject of the study was outbred rats (n=30) females weighing 190-210 grams. All laboratory animals were divided into 3 groups: 2 experimental and 1 control. As the main diet, rats received a complete compound feed for laboratory animals LBK-120. The rats of the experimental groups, along with the main diet, were injected intramuscularly with the injectable drug l-carnitine in doses determined by the study conditions. At the end of the experiment, it was found that high doses of l-carnitine with intramuscular administration did not cause significant changes in hematological blood parameters.
