CC BY
5УДК 661.725.031.74: 612.015.161
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАВИСИМОСТИ ВЫХОДА БИОЭТАНОЛА ОТ СТАДИЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРЕДОБРАБОТКИ МИСКАНТУСА
Байбакова О. В.
Установлено, что химическая предобработка мискантуса раствором азотной кислоты в одну стадию позволяет получать субстрат с высокой реакционной способностью к ферментолизу. Получен биоэтанол на средах ферментативных гидролизатов лигноцеллюлозного материала и технической целлюлозы мискантуса с помощью штамма БассЬвготусвз свгвуШав ВКПМ У-1693. Показано, что при сбраживании ферментативного водного гидролизата, полученного из лигноцеллюлозного материала мискантуса, выход биоэтанола в 1,1 раза выше, чем при сбраживании ферментативного водного гидролизата, полученного из технической целлюлозы мискантуса.
Ключевые слова: биоэтанол, мискантус, лигноцеллюлозный материал, техническая целлюлоза, ферментативный гидролизат, биосинтез
ВВЕДЕНИЕ
Возрастающая мировая потребность в энергии, неустойчивые и дорогие нефтяные ресурсы, а также вопросы по изменениям глобального климата побудили к разработке возобновляемых источников энергии, которые могут дополнить ископаемые топлива [1]. В связи с этим лигноцеллюлозная биомасса обладает высоким потенциалом для производства биотоплив и других ценных веществ, основанного на концепции биопереработки.
Преобразование растительньной биомассы позволяет получать биоэтанол второго поколения. Этот процесс включает три основных этапа. Первое, это производство растительной биомассы и её предобработка. Выбор биомассы сырья будет зависеть от локальной доступности, определяющей, что будет использоваться: излишки соломы злаковых (кукуруза, пшеница и сорго) или специализированная энергетическая культура (просо, мискантус). Предобработка включает механические, тепловые и химические воздействия, цель которых максимизировать воздействие на химические связи биомассы гли-козидными гидролазами или эстеразами, которые ведут их гидролиз. Без предобработки выход моносахаридов из нативной биомассы, составляет порядка 20 %. Это объясняется тем, что структура лигноцеллюлозной матрицы, как древесного, так и недревесного сырья, является очень прочной. Эффективная химическая предобработка может повысить выход до 80 %%. В литературе описана предварительная химическая обработка при нормальном давлении раствором серной или соляной кислоты, позволяющая повысить
скорость ферментолиза не менее, чем в два раза по сравнению с исходным сырьём [1].
Далее проводится ферментативное оса-харивание. На этом этапе требуется несколько ферментов превращения углеводных полимеров в раствор сбраживаемых моносахаридов. Необходимые ферменты должны обладать высокой скоростью гидролиза на натуральных субстратах и быть стабильными. При гидролизе целлюлоза и гемицеллюлоза превращаются в мономеры с образованием смеси гексозно-пентозных редуцирующих веществ (РВ), лигнин при этом не участвует в процессе и является балластом.
Последняя стадия преобразования растительной биомассы в этанол - сбраживание ферментативного гидролизата. Необходимо, чтобы на этой стадии обеспечивалось быстрое и эффективное сбраживание всех имеющихся сахаров [2].
Целью данной работы являлось исследование зависимости выхода биоэтанола от стадий химической предобработки мискантуса.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве сырья выбрана биомасса энергетического растения мискантус. Мискантус китайский (веерник китайский, Miscanthus sinensis Anders.) - древовидная трава семейства злаковых, авторская форма которой выведена и адаптирована для Сибири сотрудниками Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). Химическая предобработка осуществлялась в одну или две стадии.
Ранее в ИПХЭТ СО РАН были проведены фундаментальные исследования фермен-
толиза технической целлюлозы (ТЦ) мискан-туса [3], а полученный ферментативный гид-ролизат превращён в биоэтанол [4].
ТЦ мискантуса была получена азотнокислым способом в две стадии: измельчённое сырьё обрабатывается разбавленным раствором азотной кислоты при атмосферном давлении, а затем - разбавленным раствором гидроксида натрия [5]. После отжима и промывки до нейтральной реакции полученная ТЦ направлялась на ферментативный гидролиз. Способ выбран в силу доступности, простоты исполнения, дешевизны используемых реактивов, возможности выполнения на стандартном емкостном оборудовании.
Однако получение субстрата в две стадии - это достаточно сложно, поэтому с целью сокращения стадий химической предобработки целлюлозосодержащего сырья, предобработку мискантуса провели в одну стадию разбавленным раствором азотной кислоты при температуре 90-96 оС, исключая стадию обработки гидроксидом натрия. Был получен продукт, названный лигноцеллюлозным материалом (ЛЦМ), так как обработка в одну стадию позволяет удалить из сырья значительную часть гемицеллюлоз, но не удаляет лигнин.
ТЦ и ЛЦМ были получены на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН. Характеристики данных субстратов представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Характеристики субстратов
Характеристики м.д., % ЛЦМ ТЦ
Целлюлоза по Кюршнеру 88,6 -
а-целлюлоза - 93,6
Зола 4,8 1,0
Пентозаны 7,9 1,7
Лигнин 10,8 1,7
Ферментолиз проводился в водной среде в ферментёре авторской конструкции Павлова И.Н. [6]. В качестве биокатализаторов в работе использовались ферментные препараты: «Целлолюкс-А» (производитель ПО «Сиббиофарм», г. Бердск) и «Брюзайм BGX» (производитель «Polfa Tarchomin
Pharmaceutical Works S.A.», Польша, для компании «Diadic International Inc.», США). Препарат «Целлолюкс-А» позиционируется на рынке как целлюлаза для расщепления некрахмалистых полисахаридов, «Брюзайм BGX» как гемицеллюлаза.
Активная кислотность поддерживалась на уровне 4,6-4,7 ед. рН. Концентрация субстрата - 90 г/л. Мультиэнзимную композицию вносили следующим образом: «Целлолюкс -А» - 0,04 г/г субстрата, «Брюзайм BGX» -
0,2 г/г субстрата. Гидролиз проводили при температуре (46±2) °С, в течение 72 ч при постоянном перемешивании. Через каждые 8 ч отбирали пробу суспензии 2 мл для определения концентрации моносахаров в пересчете на глюкозу.
Выход редуцирующих веществ (РВ) (отношение массы РВ к массе субстрата) рассчитан с учетом коэффициента, связанного с присоединением молекулы воды к ангидрог-люкозным остаткам соответствующих мономерных звеньев в результате ферментативного гидролиза.
Концентрацию сахаров в пересчете на глюкозу определяли спектрофотометричес-ки с помощью реактива на основе 3,5-динитросалициловой кислоты (спектрофотометр «иЫ1СО» иУ-2804, США) в пересчёте на глюкозу. Активная кислотность измерялась потенциометрически (рН-метр СИесег-1), крепость бражек (объемная доля спирта) определялась ареометром для спирта в дистилляте, полученном после предварительной перегонки спирта из бражки, согласно ГОСТ Р 51135-98-2003 [7]. По крепости полученных бражек и концентрации РВ в исходной среде рассчитывался выход этанола. Теоретическая концентрация этанола рассчитана по стехио-метрическому уравнению брожения, а выход этанола - как отношение экспериментальной концентрации этанола к теоретической. Общая численность дрожжей выявлялась с использованием камеры Горяева. Морфофи-зиологические характеристики дрожжей (количество почкующихся, упитанных и мёртвых клеток) определялись согласно методикам, принятым в спиртовой отрасли.
Гидролизаты ТЦ и ЛЦМ после фильтрации и пастеризации без выдержки при 100 °С охлаждались и направлялись на сбраживание с помощью дрожжей БаооЬаготуоез сегеч'мае У-1693 Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (г. Москва). Штамм был выделен из ферментера Котласского целлюлозно-бумажного комбината и использовался для производства этанола. Особенностью штамма является его устойчивость к вредным примесям гидролизатов.
В гидролизаты было внесено по 10 % суспензии дрожжей, находящихся в экспоненциальной фазе развития и имеющих следующие характеристики: общее количество - 141,5 млн КОЕ/мл, из них почкующихся - 27,6 %.
Спиртовое брожение на средах ферментативных водных гидролизатов технической целлюлозы и лигноцеллюлозного материала мискантуса проводилось в анаэробных условиях при 28 °С в течение трех суток.
Отбор проб для определения РВ, объемной доли этанола, микробиологических показателей проводился ежесуточно.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Зависимости концентрации РВ от стадий химической предобработки субстрата представлены на рисунке 1.
70
О 8 16 24 32 40 48 56 64 72 Продолжительность процесса, ч
^ ТЦ ^^ЛЦМ
Рисунок 1 - Зависимости концентрации РВ от стадий химической предобработки субстрата.
Полученные результаты показали, что наибольшей реакционной способностью обладает лигноцеллюлозный материал, полученный обработкой азотной кислотой. Гидролиз проходил с большей скоростью и сопровождался большим накоплением РВ в гидро-лизате (65,4 г/л в сравнении с 56,7 г/л для технической целлюлозы).
Это можно объяснить химическим составом исходного сырья. При химической предобработке мискантуса в одну стадию выше массовая доля пентозанов, чем при химической предобработке в две стадии (7,9 % для ЛЦМ и 1,7 % для ТЦ, см. таблицу 1). Поэтому сумма гидролизуемых компонентов для ЛЦМ несколько больше, чем для ТЦ (96,5 % против 95,3 %). Таким образом, химическая предобработка мискантуса в одну стадию позволяет получать субстрат с высокой реакционной способностью к ферментолизу, вторую стадию химической предобработки можно исключить.
Результаты спиртового брожения ферментативного водного гидролизата (ФВГ) ЛЦМ представлены в таблице 2.
Выход этанола рассчитан по стехиомет-рическому уравнению. Сравнение синтеза этанола, полученного при сбраживании ферментативных водных гидролизатов ЛЦМ и ТЦ,
показывает, что для ЛЦМ выход биоэтанола в 1,1 раза больше, чем для ТЦ. При использовании в качестве субстрата ЛЦМ этанол синтезируется с выходом 70,9 % от теоретического, а для ТЦ выход этанола снижается незначительно и составляет 62,7 % от теоретического.
Таблица 2 - Выход этанола и экономический
коэффициент брожения в зависимости от стадий химической предобработки субстрата
Показатель ЛЦМ ТЦ
Концентрация субстрата на стадии ферментативного гидролиза, г/л 65,4 56,7
Крепость бражки, об. % 3,0 2,3
Остаточная концентрация РВ в бражке, г/л 14,1 5,5
Выход этанола, % от теоретического 70,9 62,7
При сбраживании ферментативного гидролизата ТЦ остаточная концентрация РВ в бражке в 2,6 раза меньше, чем при сбраживании гидролизата ЛЦМ. Это можно объяснить тем, что в ЛЦМ значительно больше массовая доля пентозанов по сравнению с ТЦ М, которые при ферментолизе гидролизу-ются до пентоз, не сбраживаемых дрожжами БасМаготусвв свгв^^'ав У-1693.
Полученные образцы этанола сконцентрированы методом простой перегонки, дополнительной очистке не подвергались. Оценка качества полученных образцов биоэтанола была выполнена методом газожидкостной хроматографии, полученные результаты приведены на рисунке 2. В опытных образцах последовательность выхода обнаруженных веществ соответствует действующей нормативной документации [8]. Присутствие в следовых количествах ацетона, 2-бутанола и кротональдегида идентифицируют этанол как непищевой [8].
Довольно высокая концентрация альдегидов в опытных образцах биоэтанола от 3600 до 6100 мг/дм3 и эфиров (1000 мг/дм3 для ТЦ) связана с природой сырья, поскольку исключено накопление фракции альдегидов (фурфурола и оксиметилфурфурола) в процессе ферментативного гидролиза, так как процесс проводился при температуре (46±2) °С и рН 4,7.
Массовая концентрация сивушного масла в опытных образцах ниже, чем в спирте-сырце из пищевого сырья (2500-3500 мг/дм3 против 5000 мг/дм3 [9]), что можно объяснить отсутствием белков и пептидов в опытных гидролизатах ТЦ.
Рисунок 2 - Хроматограммы анализа биоэтанола из гидролизатов: а) ЛЦМ М; б) ТЦ М.
ВЫВОДЫ
Таблица 3 - Содержание примесей в опытных образцах биоэтанола, полученного из ФВГ ЛЦМ М и ТЦ М
Показатель ЛЦМ М ТЦ М
Массовая концентрация альдегидов в пересчёте на безводный спирт, мг/дм3 6100 3600
Массовая концентрация эфиров в пересчёте на безводный спирт, мг/дм3 70 1000
Массовая концентрация сивушного масла в пересчёте на безводный спирт, мг/дм3 2500 3500
Массовая доля метанола в пересчёте на безводный спирт, об. % 0,002 0,001
Важно, что в обоих образцах объёмная доля метанола крайне мала 0,0010,002 об. %, что намного ниже 0,13 об. %, регламентированных для спирта-сырца из всех видов пищевого сырья (за исключением мелассы) [9], и менее 0,1 об. % - для спирта этилового технического [10].
Таким образом, ферментативный гидролиз ЛЦМ и ТЦ позволяет получить доброкачественный гидролизат с низким содержанием вредных примесей и обуславливает низкое содержание побочных и вторичных продуктов спиртового брожения в бражках.
Выявлено, что химическая предобработка мискантуса раствором азотной кислоты в одну стадию позволяет получать субстрат с высокой реакционной способностью к фер-ментолизу.
Показано, что при сбраживании ферментативного водного гидролизата ЛЦМ мискантуса выход биоэтанола в 1,1 раза выше, чем для ТЦ мискантуса.
Установлено, что образцы биоэтанола, полученные из ЛЦМ и ТЦ мискантуса, характеризуются низким содержанием метанола.
Работа выполнена при поддержке совместного интеграционного проекта № 11 фундаментальных исследований ИПХЭТ СО РАН и ИХ Коми НЦ УрО РАН «Химическая, механохимическая и ферментативная деструкция целлюлозосодержащего сырья для получения ценных продуктов».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hu F., Ragauskas A. Pretreatment and lignocellu-losic chemistry // Bioenerg. Res. - 2012. - № 5. - P. 1043-1066.
2. Wagschal K. Plant cell walls to ethanol // Bio-chem. J. - 2012. - № 442. - P. 241-252.
3. Макарова Е.И. Результаты ферментации целлюлозы мискантуса в ацетатном буфере и водной среде // Химия в интересах устойчивого развития.
- 2013. - Т. 21, № 2. - С. 219-225.
4. Скиба Е.А., Будаева В.В., Павлов И.Н., Макарова Е.И., Золотухин В.Н., Сакович ГВ. Получение ферментативных гидролизатов технических целлюлоз мискантуса и их спиртовое брожение // Биотехнология. - 2012. - № 6. - С. 42-53.
5. Гисматулина Ю.А., Будаева В.В. Химический состав российского мискантуса и качество целлюлозы, полученной из него // Химия в интересах устойчивого развития. - 2013. - Т. 21, № 5. - С. 539-544.
6. Павлов И.Н. Установка для исследования биокаталитического превращения продуктов переработки недревесного сырья // Катализ в промышленности. - 2014. - № 1. - С. 66-72.
7. ГОСТ Р 51135-2003. Изделия ликероводочные. Правила приемки и методы анализа. Технические требования. Введ. 1998-03-02. - М.: ИУС, 2003. - 116 с.
8. ГОСТ Р 51786-2001. Водка и спирт этиловый из пищевого сырья. Газохроматографический метод определения подлинности. - М.: Изд-во стандартов, 2001. - 8 с.
9. ГОСТ Р 52193-2003. Спирт этиловый-сырец из пищевого сырья. Технические условия. - М.: Изд-во стандартов, 2005. - 4 с.
10. ГОСТ 17299-78. Спирт этиловый технический. Технические условия. - М.: Изд-во стандартов, 1978. - 4 с.
УДК 547.458.81
ПОЛУЧЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ АЗОТНОКИСЛЫМ СПОСОБОМ НАПРЯМУЮ ИЗ СОЛОМЫ ЛЬНА-МЕЖЕУМКА
Гисматулина Ю.А.
Определен химический состав соломы льна-межеумка. Получена целлюлоза азотнокислым способом напрямую из соломы льна-межеумка. Выделенная целлюлоза характеризуется высоким качеством: а-целлюлоза 84,63 %, нецеллюлозные компоненты: зольность и массовая доля остаточного лигнина 0,07 % и 1,40 % соответственно. Степень полимеризации целлюлозы 500. ИК-спектр целлюлозы из соломы льна-межеумка показал наличие всех характеристических частот, характерных для целлюлозы: 3570-3125 см1, 2940-2860 см-1, 1631 см-1, 1433 см-1, 1373 см-1,1338 см-1, 1163 см-1, 1112 см-1, 1059 см-1. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности создания основ технологии переработки отходов масличного льна - соломы льна-межеумка - без разделения на волокно и костру в целлюлозу и продукты ее химической модификации с использованием недорогих и нетоксичных реактивов и стандартного оборудования при атмосферном давлении.
Ключевые слова: солома льна-межеумка, зольность, жировосковая фракция, целлюлоза по Кюршнеру, азотнокислый способ, альфа-целлюлоза, остаточный лигнин, степень полимеризации.
ВВЕДЕНИЕ
Основным видом природного волокнистого сырья для производства целлюлозных материалов многие десятилетия был и остается до сих пор хлопок. Однако для России хлопок является на 100 % импортируемым сырьем. Таким образом, проблема обеспечения широкого промышленного применения волокнистых материалов, способных составить альтернативу хлопку, чрезвычайно важна. В России для промышленного освоения производства целлюлозы из недревесных источников интерес представляет лен-межеумок, посевы которого ежегодно наращиваются в Алтайском крае, в Центральной России, в южных регионах страны и Тверской
области [1, 2]. Семена используются для производства льняного масла, обладающего ценными пищевыми и лечебными свойствами, а отходы переработки (солома и короткое волокно) из-за отсутствия технологии выделения целлюлозы не находят применения. Урожайность такого низкосортного волокнистого сырья в Алтайском крае составляет 1,2 т/га.
Исследования по переработке биомассы, в том числе льна-межеумка, в спектр конкурентоспособных продуктов и энергию в последнее время обладают высокой популярностью [3]. Биорефайнери (англ. «ЫогеНпегу») использует ежегодно возобновляемое растительное сырье для выработки биополимеров и их производных, а также индивидуальных
