CC BY
10
УДК 579.264:636.4
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАВИСИМОСТИ СМЕНЫ ШТАММОВ E.COLI КИШЕЧНОГО МИКРОБИОЦЕНОЗА ПОРОСЯТ
ОТ ДЕЙСТВИЯ КОЛИ-ФАГОВ INVESTIGATION OF DEPENDENCE OF THE CHANGE OF E.COLI STRAINS OF GUT MICROBIOCENOSIS IN PIGLETS BY COLI-PHAGES EFFECT
Скобликов Н. Э. к.м.н., Забашта Н. Н. к.в н., Москаленко Е. А. ГНУ СКНИИЖ Россельхозакадемии, Российская Федерация, г. Краснодар, Зимин А. А. к.б.н.
ФБУН ИБФМ им.Г.К.Скрябина РАН, Российская Федерация, г. Пущино
N. E. Skoblikov, M.D., N. N. Zabashta, Dr. Sci., Moskalenko E. A. North-Caucasus Research Institute of Animal Husbandry, Krasnodar, Russian Federation, Zimin A. A. Dr.Sci.,
Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino, Moscow Region, Russian Federation
Аннотация: в результате исследований определяемого in vitro антагонизма между штаммами E.coli кишечного микробиоценоза поросят и выделенными из тех же образцов коли-фагами, не установлено решающей роли коли-фагов в периодическом снижении коли-титра и смене штаммов E.coli.
Summary: the results of the experiments on in vitro defined antagonism between E.coli strains of intestinal microbiocaenosis in piglets and coli-phages, isolated from the same samples, did not show significant effect of coli phages in periodic decrease of coli-titer and change of E.coli strains.
Ключевые слова: поросята; кишечный микробиоценоз; E.coli; коли-фаги; возрастная динамика.
Key words: piglets; intestinal microbiocenosis; E.coli; coli-phages; age dynamics.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проектов № 11-04-96575-р_юг_ц; 12-04-90864-мол_рф_нр; 13-04-96599-р-юг-а.
Изучение микроэкологических механизмов популяционных изменений в микробиоценозах является в последнее время актуальным направлением микробиологии. Исследованиям в этой области на человеке и животных посвящено всё большее количество публикаций [2]. Ранее было установлено [1], что изменение количественных параметров популяций Е.еоН (динамика коли-титра) в кишечнике поросят имеет определённые закономерности, характеризуемые чередованием подъёмов и снижений в течение очень коротких периодов (3 - 4 дня). Для выяснения механизма колебаний коли-титра было бы существенно получение данных о том, обусловлены ли периодические снижения коли-титра в группах (и у отдельных животных) литическим действием фагов в кишечнике животных ? Для решения этого вопроса следовало получить экспериментальные данные по оценке чувствительности изолятов Е.еоН, обнаруживаемых у конкретных животных в наибольших титрах, к бактериофагам, выделенных из образцов, отобранных у тех же самых животных в этот же или последующий временной период.
Методика. Производили периодический (с интервалом от
3 до 7 дней) отбор фекалий у 12 поросят (сгруппированных в
4 группы: от I до IV) 12 раз (всего 144 образца), в возрасте от 17 до 66 дней.
Часть образца фекалий, отобранных в стерильный контейнер, взвешивали, после чего ресуспендировали в 20 мл забуфе-ренного физраствора и делали серию 10-кратных разведений в этом же растворе. Из пробирок с разведениями осуществляли первичный посев биоматериала на среду Эндо с последующим инкубированием при 37 °С в течение 24 ч. После инкубирования отбирали изолированные колонии, подозрительные на Е.еоН, учитывая их морфологические особенности и количество коло-ние-образующих единиц (КОЕ) данных бактерий. Количественная оценка (титр) содержания Е.еоН в исследуемом биоматериале осуществлялась путём подсчёта колоний после первичного посе-
ва, выражая её в lg КОЕ/г. После этого штаммы E.coli охаракте-ризовывали по спектру их физиолого-биохимических и молеку-лярно-генетических (определение плазмидного профиля) свойств.
Из другой части образца выделяли бактериофаги, специфичные к E.coli (коли-фаги), учитывая пятна лизиса (бляшки) на чувствительной культуре лабораторного штамма E.coli B. Титр коли-фагов в исследуемом биоматериале определяли путём подсчёта бляшко-образующих единиц (БОЕ) после первичного посева, выражая её в lg БОЕ/г.
Исследование литической активности выделенных бактериофагов. в отношении выделенных E.coli, проводилось по обнаружению феномена бактериолизиса на культурах бактерий, выращенных методом агаровых слоёв с использованием твёрдой и мягкой агаризованных сред LB [3]. После внесения в пробирки со средой LB по 50 мкл свежей культуры штамма E.coli, пробирки перемешивали быстрым вращением и сразу выливали на поверхность плотной среды в чашке. После застывания мягкой среды производили внесение бактериофагов уколами в маркированные участки чашки. После инкубирования при 37 °C в течение 18 ч отмечали литическую активность каждого фага в отношении штамма E. coli по появлению пятен лизиса в местах укола.
Результаты исследований и их обсуждение. Для получения данных по I группе потребовалось бы определить in vitro чувствительность изолятов E.coli, выделенных из проб 27-го, 46-го и 59-го дня в I группе к фагам из проб этих же животных, отобранных в 31, 53 и 66 дня, соответственно. Для получения данных по II группе потребовалось бы определить in vitro чувствительность изолятов E.coli, выделенных из проб 17-го и 42-го дня в II группе к фагам из проб этих же животных, отобранных в 21 и 46 дня, соответственно. Для получения данных по III группе потребовалось бы определить in vitro чувствительность изолятов E. coli, выделенных из проб 42-го дня в III группе к фагам из проб этих же животных, отобранных в 46 дней. Для получения данных по IV группе потребовалось бы определить in vitro чувствительность изолятов E.coli, выделенных из проб 21-го, 35-го и 42-го
дня в IV группе к фагам из проб этих же животных, отобранных в 24, 39 и 46 дней, соответственно.
По результатам поставленных in vitro экспериментов по определению чувствительности изолятов E.coli к выделенным у этих же животных фагам, были получены следующие данные.
В I и II группах все изоляты E.coli, составлявшие локальный пик коли-титра на 27-й день, оказались устойчивы ко всем бактериофагам, выделенным от тех же животных на 31-й день. Таким образом, можно с уверенностью предположить, что снижение коли-титра у животных I и II групп на 31-й день (сопровождающиеся, за исключением животного I - 2, качественной сменой изолятов) обусловлено не литическим эффектом фагов, а какими-либо иными причинами. Также снижения коли-титра (также сопровождающиеся качественной сменой изолятов) в I группе на 66-й день, во II группе на 21-й день и в IV группе на 39-й день наверняка обусловлены не фаговой активностью. Вообще, вероятность обусловленности снижения коли-титра литическим действием «собственных» (т.е., выделяемых у того же животного без приёма фагов извне) бактериофагов имеется лишь в отношении животных I-1 (пик коли-титра 46-го дня) и IV-1 (пик 21-го дня).
В целом, сопоставляя и анализируя данные по колебанию количества E.coli и фагорезистентности изолятов, можно отметить, что в отношении ни одного животного нет данных, подтверждающих, что колебания коли-титра и титра коли-фагов находятся в зависимости от механизмов, обеспечивающих в экосистемах популяционную динамику по типу волн «хищник-жертва».
Список литературы
1. Скобликов Н. Э., Зимин А. А. Динамика коли-
титра и титра коли-фагов у поросят первых двух месяцев жизни // "Научные достижения биологии, химии, физики": материалы международной заочной научно-практической конференции. (07
ноября 2012 г.). - Новосибирск: Изд. "Сибирская ассоциация консультантов", 2012. - С. 23-27.
2. Golomidova A, Kulikov E, Isaeva A, Manykin A, Letarov A. The Diversity of Coliphages and Conforms in Horse Feces Reveals a Complex Pattern of Ecological Interactions. Appl Environ Microbiol. - 2007 October; 73 (19): - Р. 5975-5981.
3. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
