CC BY
77
УДК 577.323, 544.174.7
Вестник СПбГУ. Сер. 4. Т. 2 (60). 2015. Вып. 3
С. В. Пастон1, В. М. Бакулев1, В. Н. Демидов2, А. И. Николаев1, Н. А. Касьяненко1
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДНК С НОВЫМ
I,10-ФЕНАНТРОЦИАНИНОВЫМ КОМПЛЕКСОМ ЦИНКА СПЕКТРАЛЬНЫМИ МЕТОДАМИ*
1 Санкт-Петербургский государственный университет, Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7—9
2 Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Российская Федерация, 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26
Координационные соединения металлов, как правило, проявляют высокую биологическую активность и являются основой для конструирования новых лекарственных препаратов, биохимических агентов и биосенсоров. Методом УФ-спектрофотометрии и спектроскопии флуоресценции проведено исследование взаимодействия ДНК в растворе с новым электрон-избыточным биядерным соединением цинка, производным 1,10-фенантролина (Zn1). Спектр поглощения Zn1 имеет максимум на 270 нм (молярный коэффициент экс-тинкции 9,3 • 104 M"1 см 1 при рН = 4) и длинноволновое плечо. Наблюдаемые изменения спектральных свойств растворов, содержащих Zn1 и ДНК, свидетельствуют о комплексооб-разовании компонентов. Насыщение связывания наступает при соотношении 1 молекула Zn1 на пару оснований ДНК. При избытке Zn1 проявляются признаки второго типа связывания. Спектр флуоресценции Zn1 представляет собой широкую асимметричную полосу в области 360—600 нм. Взаимодействие Zn1 с ДНК приводит к тушению флуоресценции лиганда. Библиогр. 14 назв. Ил. 4.
Ключевые слова: ДНК, металлокомплексы, УФ-спектрофотометрия, флуоресценция.
S. V. Paston1, V. M. Bakulev1, V. N. Demidov2, A. I. Nikolaev1, N. A. Kasyanenko1
STUDY OF DNA INTERACTION WITH NEW 1,10-PHENANTHROCYANINE-ZN COMPLEX WITH SPECTRAL METHODS
1 St. Petersburg State University, 7—9, Universitetskaya nab., St. Petersburg, 199034, Russian Federation
2 St. Petersburg State Technological Institute (Technical University)
Metal coordination compounds often reveal high biological activity and serve as a base of design of new medicaments, biochemical agents and biosensors. In our work DNA interaction with new electron-excessive bi-nuclear Zn compound, 1,10-phenanthrocyanine derivative (Zn1), is studied with the methods of UV absorption spectroscopy and fluorescence spectroscopy. The electronic-absorption spectrum of Zn1 has the maximum at 270 nm (molar extinction coefficient 9.3 • 104 M"1 cm 1 at pH = 4) and long-wavelength shoulder. The observed changes in spectral properties of DNA—Zn1 solutions are evidence of DNA-ligand complexation. The binding saturation takes place at the ratio of one Zn1 molecule to the base pair. At the Zn1 excess there is indication of a second type binding. The fluorescence spectrum of Zn1 is a wide asymmetrical band in the region of 360—600 nm. Zn1—DNA interaction leads to the Zn1 fluorescence quenching. Refs 14. Figs 4.
Keywords: DNA, metallocomplexes, UV-spectroscopy, fluorescence.
Введение. Интерес к исследованию взаимодействия природных и синтетических комплексов переходных металлов с нуклеиновыми кислотами обусловлен их высокой биологической активностью и в ряде случаев специфичностью к нуклеотидной последовательности. Многие ДНК-связывающие белки (факторы транскрипции, фосфатазы,
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 13-03-01192), а также СПбГУ (шифр проекта
II.38.644.2013, номер госрегистрации 01201356820).
эндонуклеазы и др.) содержат в своём активном центре мультиядерный металлоком-плекс [1]. На основе координационных соединений металлов конструируют противоопухолевые препараты [2-4], искусственные нуклеазы и ДНК-сенсоры [1, 5-7].
Изучение взаимодействия ДНК с низкомолекулярными лигандами в модельных системах — водно-солевых растворах — позволяет в ряде случаев выявить их биологическую активность, сделать заключение о молекулярном механизме комплексооб-разования, а также дать рекомендации для синтеза новых соединений с заданными свойствами. В представленной работе исследовалось взаимодействие ДНК в растворе с электрон-избыточным биядерным соединением цинка, содержащими производные 1,10- фенантролина.
Материалы и методы. Использовали ДНК фирмы «Sigma» из тимуса телёнка молекулярной массы M = (10,5 ± 0,6) • 106 Да. Молекулярная масса ДНК определялась по значению характеристической вязкости [п] в растворе 0,15М NaCl [8]. Использовали соль NaCl марки х.ч. Концентрация поддерживающего электролита NaCl сохранялась постоянной во всех экспериментах (0,005M). Оптическое поглощение растворов ДНК и Zn1 измеряли на спектрофотометре СФ-56 (Россия). Концентрацию ДНК в растворе (C) определяли по методу Спирина [9]. Измерения проводили при 21°С. Использовали кварцевую циллиндрическую кювету с длиной оптического пути 1 см. Люминесцентные измерения растворов проводились на флуоресцентном спектрофотометре «Hitachi-850». Спектры испускания люминесценции корректировались на спектральную чувствительность прибора.
Ниже представлена структурная формула исследуемого соединения [(phen)2Zn2+(^-phencyanine H)Zn2+(phen)2]4+(CH3COO~)4:
Соединение тетракис(1,10-фенантролин)(ц-1,10-фенантроцианин) дицинка(П) ацетат (в дальнейшем условное название 2п1), брутто-формула Zn2C8oH6oNl208, молекулярная масса 1448,5 Да, представляет собой стеклообразное вещество тёмно-коричневого цвета, которое хорошо растворяется. Хорошо растворяется при комнатной температуре в ДМСО, ДМФА с образованием интенсивно окрашенных в пурпурный цвет растворов. В воде растворяется хуже, с образованием красно-жёлтого раствора. Синтез и структура электрон-избыточных 1,10-фенантроцианиновых комплексов ^элементов описаны в [10].
Исследуемое вещество 2п1 (0,11 г) растворяли в 2,5 мл ледяной уксусной кислоты, затем добавляли 100 мл воды при непрерывном помешивании. Спектр поглощения 2п1 в водном растворе представлен на рис. 1 (кривая 2). В спектре выделяется широкая полоса с максимумом при 270 нм и длинноволновое плечо. Молярные коэффициенты
4+
X, нм
Рис. 1. Спектры поглощения растворов ДНК, содержащих Zn1, при молярном соотношении [2п1]/[ДНК] = 0,13 ^ 13,2:
С(ДНК) = 2,3 • 10~б Mbp, C(Zn1) = 0 (1); С(Zn1) = 1 • 10~6M = const в системах (2)-(9); С(ДНК) = 0 (2); с(дНК) = 7,6 • 10~7 Mbp (3); С (ДНК) = 2,3 • 10~6 Mbp (4); С(ДНК) = 7,6 • 10~6 Mbp (5); С (ДНК) = 1,5 • 10~Б Mbp (6); С (ДНК) = 2,3 • 10~Б Mbp (7); С(ДНК) = 3,8 • 10~Б Mbp (8); С (ДНК) = 7,6 • 10~Б Mbp (9)
X, нм
Рис. 2. Разностные спектры — результат вычитания из спектров поглощения растворов ДНК, содержащих Zn1, и спектров поглощения растворов Zn1 соответствующей концентрации при различных значениях К = [2п1]/[ДНК]: 26,3 (1); 13,2 (2); 6,7 (3); 4,3 (4); 2,6 (5); 1,3 (6); 0,26 (7); 0,13 (8); 0,04 (9)
экстинкции Zn1 при рН = 4 е270 = 9,3 • 104 М-1 см-1, £355 = 2,6 • 104 М-1см-1, при рН = 6 £270 = 9,2 • 104 М-1см-1, £355 = 3,0 • 104 М-1 см-1.
Результаты и обсуждение. Были получены спектры поглощения растворов ДНК, содержащих Zn1, при соотношении |2п1]/[ДНК] = 0,04 + 26, где |2п1] — молярная
концентрация Zn1; [ДНК] — концентрация ДНК в молях пар оснований (для примера см. рис. 1, 2). Видно, что результат вычитания из спектров поглощения растворов ДНК, содержащих Zn1, спектров поглощения растворов Zn1 соответствующей концентрации не совпадает со спектром ДНК. Это свидетельствует об изменении спектров одного или обоих компонентов в смешанном растворе, т. е. о наличии взаимодействия между ДНК и Zn1 в растворе.
Из графика зависимости поглощения, вычисленного из разностных спектров на длине волны 360 нм, в полосе поглощения Zn1 и вне полосы поглощения ДНК (рис. 3), видно, что процесс комплексообразования достигает насыщения при ^п1]/[ДНК] « ~ 1/2, т. е. когда 1 молекула лиганда приходится на пару оснований ДНК. Пологий максимум в зависимости .Оз50(^п1]/[ДНК]) при ^п1]/[ДНК] « 30 даёт основания предположить, что после насыщения первого типа связывания может происходить связывание второго типа, возможно димерное.
0,15-|
0,10-
0,05-
0,00-
10 15 20 С(2п1)/С(ДНК)
25
30
Рис. 3. Зависимости поглощения, вычисленного из разностных спектров на 360 нм, от молярного соотношения компонентов
5
25
20
п 154
ё
^10-
5
350 400
450 500
Я, нм
550 600
Рис. 4. Спектр флуоресценции Zn1 (1) и Zn1 в комплексе с ДНК (2): С(2п1) = 1 • 10~БМ; С(ДНК) = 7 х X 10-БМЬр; возбуждение на X = 350 нм
0
Исследуемое вещество Zn1 обладает способностью к флуоресценции. На рис. 4 (кривая 1) показан спектр испускания Zn1 при возбуждении светом с длиной волны 350 нм — в области длинноволнового плеча в спектре поглощения соединения. Присутствие в растворе Zn1 ДНК вызывает тушение флуоресценции (кривая 2). Этот эффект также свидетельствует о комплексообразовании Zn1 с ДНК. В литературе есть сведения о различных координационных соединениях металлов, производных фенантроли-на, являющихся флуорофорами, причём их связывание с ДНК может приводить как к усилению [11, 12], так и к тушению флуоресценции металлокомплексов [13, 14].
Выводы.
1. Наблюдается комплексообразование соединения Zn1 с ДНК. Насыщение связывания происходит при соотношении 1 молекула лиганда на пару оснований ДНК. При избытке Zn1 проявляются признаки второго типа связывания.
2. Взаимодействие Zn1 с ДНК приводит к тушению флуоресценции лиганда.
Литература
1. LiuCh., WangM., Zhang T., SuncH. DNA hydrolysis promoted by di- and multi-nuclear metal complexes // Coord. Chem. Revs. 2004. Vol. 248. P. 147-168.
2. Kas'yanenko N. A., AbramchukS. S., Blagodatskikh I. V. et al. Study of DNA complexation with platinum coordination compounds // Polymer Sci. (A). 2003. Vol. 45. P. 960-968.
3. Демидов В. Н., КасьяненкоН. А., АнтоновВ. С. и др. Взаимодействие с ДНК и фармакологическая активность 1,10-фенантролиновых и электрон-избыточных 1,10-фенантроцианиновых комплексов d-элементов // Рос. хим. журн. 2010. Т. 54, № 6. С. 120-135.
4. Zeglis B. M., Pierre V. C., Barton J. K. Metallointercalators and metalloinsertors // Chem. Commun. 2007. Vol. 44. P. 4565-4579.
5. Jiang Q., XiaoN., Shi P. et al. Design of artificial metallonucleases with oxidative mechanism // Coord. Chem. Revs. 2007. Vol. 251. P. 1951-1972.
6. Seng H.-L., Von S.-T., Tan K.-W. et al. Crystal structure, DNA binding studies, nucleolytic property and topoisomerase I inhibition of zinc complex with 1,10-phenanthroline and 3-methyl-picolinic acid // Biometals. 2010. Vol. 23. P. 99-118.
7. SmithJ. A., KeeneF. R., LiF., CollinsJ. G. Noncovalent DNA binding of metal complexes // Comprehensive Inorganic Chemistry II (Second Edition) From Elements to Applications. 2013. Vol. 3. P. 709-750.
8. EignerJ., Doty P. Native, denatured and renatured states of deoxyribonucleic acid //J. Mol. Biol. 1965. Vol. 12. P. 549-580.
9. Спирин А. С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. Т. 23. С. 656-662.
10. Демидов В. Н. Электрон-избыточные 1,10-фенантроцианиновые комплексы d-элементов: закономерности образования, спектральные свойства, структурно-термодинамическое подобие: автореф. дис. ... д-ра хим. наук. СПб.: Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), 2010.
11. Shahabadi N., Mohammadi S. Synthesis characterization and DNA interaction studies of a new Zn(II) complex containing different dinitrogen aromatic ligands // Bioinorg. Chem. Appl. 2012. Vol. 2012. 8 p. doi: 10.1155/2012/571913.
12. JuskowiakB., Grzybowska I., Galezowska E., TakenakaSh. Enhanced fluorescence of the Eu3+-naph-thalenediimide derivative-phenanthroline ternary complex and the determination of DNA // Analytica Chim-ica Acta. 2004. Vol. 512, iss. 1. P. 133-139.
13. Khorasani-Motlagh, Noroozifar M., Mirkazehi-Rigi S. Fluorescence and DNA-binding properties of neodymium(III) and praseodymium(III) complexes containing 1,10-phenanthroline // Spectrochimica Acta (A). 2011. Vol. 79, iss. 5. P. 978-984.
14. Hui-Juan Sun H.-J., Wang A-L., Chu H.-B., Zhao Y.-L. Fluorescent studies on the interaction of DNA and ternary lanthanide complexes with cinnamic acid-phenanthroline and antibacterial activities testing // Luminescence. 2015. Vol. 30, iss. 2. P. 131-136.
References
1. Liu Ch., Wang M., Zhang T., SuncH. DNA hydrolysis promoted by di- and multi-nuclear metal complexes. Coord. Chem. Revs., 2004, vol. 248, pp.147-168.
2. Kas'yanenko N.A., Abramchuk S.S., Blagodatskikh I.V. et al. Study of DNA complexation with platinum coordination compounds. Polymer Sci. (A), 2003, vol. 45, pp.960—968.
3. Demidov V.N., Kas'ianenko N.A., Antonov V.S. et al. Vzaimodeistvie s DNK i farmakologicheskaia aktivnost' 1,10-fenantrolinovykh i elektron-izbytochnykh 1,10-fenantrotsianinovykh kompleksov d-elementov [Interaction with DNA both pharmacological activity the 1,10-fenantrolinyc and an electron-superfluous the 1,10-fenantrotsianyc of complexes of d-elements]. Ros. khim. zhurn., 2010, vol. 54, no 6, pp.120—135. (In Russian)
4. Zeglis B.M., Pierre V.C., Barton J.K. Metallointercalators and metalloinsertors. Chem. Com,m,un., 2007, vol. 44, pp.4565—4579.
5. Jiang Q., Xiao N., Shi P. et al. Design of artificial metallonucleases with oxidative mechanism. Coord. Chem. Revs., 2007, vol. 251, pp.1951-1972.
6. Seng H.-L., Von S.-T., Tan K.-W. et al. Crystal structure, DNA binding studies, nucleolytic property and topoisomerase I inhibition of zinc complex with 1,10-phenanthroline and 3-methyl-picolinic acid. Biometals, 2010, vol. 23, pp.99-118.
7. Smith J.A., Keene F.R., Li F., Collins J.G. Noncovalent DNA binding of metal complexes. Comprehensive Inorganic Chemistry II (Second Edition) From Elements to Applications, 2013, vol. 3, pp.709—750.
8. Eigner J., Doty P. Native, denatured and renatured states of deoxyribonucleic acid. J. Mol. Biol., 1965, vol. 12, pp.549—580.
9. Spirin A.S. Spektrofotometricheskoe opredelenie summarnogo kolichestva nukleinovykh kislot [Spek-trofotometric definition of total amount of nucleinic acids]. Biokhimiia [Biochemistry ], 1958, vol. 23, pp.656— 662. (In Russian)
10. Demidov V.N. Elektron-izbytochnye 1,10-fenantrotsianinovye kompleksy d-elementov: zakonomer-nosti obrazovaniia, spektral'nye svoistva, strukturno-termodinamicheskoe podobie. Diss. dokt. khim. nauk [Electron-excess 1,10-fenantrocianinic complexes of d-elements: regularities of education, spectral properties, structural and thermodynamic similarity. Dr. chem. sci. diss.]. St. Petersburg, St. Petersburg state institute of technology (technical university), 2010. (In Russian)
11. Shahabadi N., Mohammadi S. Synthesis characterization and DNA interaction studies of a new Zn(II) complex containing different dinitrogen aromatic ligands. Bioinorg. Chem. Appl., 2012, vol. 2012. 8 p. doi: 10.1155/2012/571913.
12. Juskowiak B., Grzybowska I., Galezowska E., Takenaka Sh. Enhanced fluorescence of the Eu3+-naphthalenediimide derivative-phenanthroline ternary complex and the determination of DNA. Analytica Chimica Acta., 2004, vol. 512, iss. 1, pp.133-139.
13. Khorasani-Motlagh, Noroozifar M., Mirkazehi-Rigi S. Fluorescence and DNA-binding properties of neodymium(III) and praseodymium(III) complexes containing 1,10-phenanthroline. Spectrochimica Acta (A)., 2011, vol. 79, iss. 5, pp.978-984.
14. Hui-Juan Sun H.-J., Wang A-L., Chu H.-B., Zhao Y.-L. Fluorescent studies on the interaction of DNA and ternary lanthanide complexes with cinnamic acid-phenanthroline and antibacterial activities testing. Luminescence, 2015, vol. 30, iss. 2, pp.131-136.
Статья поступила в редакцию 19 мая 2015 г.
Контактная информация
Пастон Софья Владимировна — кандидат физико-математических наук, доцент; e-mail: svpaston@list.ru
Бакулев Владимир Михайлович — кандидат физико-математических наук.
Демидов Виктор Николаевич — доктор химических наук, доцент.
Николаев Антон Игоревич — студент.
Касьяненко Нина Анатольевна — доктор физико-математических наук, профессор; e-mail: nkasyanenko@mail.ru
Paston Sofia V. — Candidate of Physics and Mathematics; Associate Professor; e-mail: svpaston@list.ru
Bakulev Vladimir M. — Candidate of Physics and Mathematics.
Demidov Viktor N. — Doctor of Chemistry, Associate Professor.
Nikolaev Anton I. — student.
Kasyanenko Nina A. — Doctor of Physics and Mathematics, Professor; e-mail: nkasyanenko@mail.ru
