CC BY
59
УДК 612.841.1-008.64-08:611.018.7
А.В. БЕЗУШКО1, А.С. ДУБОВИКОВ1, А.Н. КУЛИКОВ1, C.B. МУРАШОВ1, В.Ф. ЧЕРНЫШ1, М.И. БЛИНОВА2, О.И. АЛЕКСАНДРОВА2, А.А. СУЕТОВ1, И.О. ГАВРИЛЮК1
1Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6
Институт цитологии Российской академии наук, 194064, г. Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д. 4
Исследование возможности применения культивированных аутологичных лимбальных эпителиальных стволовых клеток на коллагеновом скаффолде для устранения лимбальной недостаточности в эксперименте
Безушко Анна Васильевна — врач-офтальмолог
Дубовиков Анатолий Сергеевич — клинический ординатор, тел. +7-981-781-48-23, e-mail: dubovikovanatolyi@gmail.com Куликов Алексей Николаевич — начальник кафедры офтальмологии, доктор медицинских наук, доцент, тел. +7-921-923-57-85, e-mail: alexey.kulikov@mail.ru
Мурашов Сергей Викторович — профессор кафедры офтальмологии, доктор медицинских наук доцент, тел. +7-911-226-84-15, e-mail: churashoff@mail.ru
Черныш Валерий Федорович — доцент кафедры офтальмологии, кандидат медицинских наук, доцент, тел. +7-911-739-71-92, e-mail: vfchernysh@gmail.com
Блинова Миральда Ивановна — кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биологии клетки в культуре, тел. +7-911-700-58-07, e-mail: mira.blinova@mail.ru
Александрова Ольга Игоревна — младший научный сотрудник лаборатории биологии клетки в культуре, тел. +7-965-072-86-02, e-mail: elga.aleks@gmail.com
Суетов Алексей Александрович — врач-офтальмолог, кандидат медицинских наук, тел. +7-911-757-61-33, e-mail: ophtalm@mail.ru
Гаврилюк Илья Олегович — врач-офтальмолог, тел. +7-911-029-93-81, e-mail: iluaayaks@gmail.com
Перспективной методикой лечения пациентов с лимбальной недостаточностью (ЛН) является трансплантация культивированных лимбальных эпителиальных стволовых клеток (ЛЭСК) на основе минимального забора донорской ткани на различных носителях. Целью было исследовать возможность применения культивированных аутологичных ЛЭСК на коллагеновом скаффолде (КС) для устранения ЛН в эксперименте. У 30 кроликов (60 глаз) предварительно была сформирована механическая модель ЛН. Животные были разделены на 3 группы. Первые две группы — основные, третья — контрольная. В 1-й группе коллагеновый скаффолд (КС) с культивированными ЛЭСК накладывали на обнаженную роговицу двукратно с интервалом 3 дня, а во 2-й группе — однократно. В контрольной группе КС, не содержащий культивированных клеток, применяли однократно. На 90-й день отмечали заметное повышение прозрачности роговицы в 1-й группе, в отличие от 2-й и контрольной групп, где помутнение и васкуляризация ее оставались достаточно выраженными. По данным импрессионной цитологии, в 1-й группе в 90% наблюдений обнаружен эпителий, не содержащий бокаловидных клеток. Это подтвердило и гистологическое исследование. Во 2-й группе было показано наличие бокаловидных клеток в 50% случаев, в контрольной — у всех животных. Двукратное применение КС, содержащего культивированные ЛЭСК, в эксперименте показало себя эффективным в устранении ЛН и может быть рекомендовано для ограниченных клинических испытаний.
Ключевые слова: лимбальные эпителиальные стволовые клетки, коллагеновый скаффолд, лимбальная недостаточность.
A.V. BEZUSHKO1, A.S. DUBOVIKOV1, A.N. KULIKOV1, S.V. CHURASHOV1, V.F. CHERNYSH1, M.I. BLINOVA2, O.I. ALEKSANDROVA2, A.A. SUETOV1, I.O. GAVRILYUK1
1 Military Medical Academy named after S.M. Kirov, 6 Akademika Lebedeva Str., Saint Petersburg, Russian Federation, 194044
institute of Cytology of the Russian Academy of Science, 4 Tikhoretskiy Ave., Saint Petersburg, Russian Federation, 194064
Investigation of the possibility of using cultured autologous limbal epithelial stem cells on the collagen scaffold to treat the limbal deficiency in an experiment
Bezushko A.V. — ophthalmologist
Dubovikov A.S. — clinical resident, tel. +7-981-781-48-23, e-mail: dubovikovanatolyi@gmail.com
Kulikov A.N. — Head of the Department of Ophthalmology, D. Med. Sc., tel.+7-921-923-57-85, e-mail: alexey.kulikov@mail.ru Churashov S.V. — Professor of the Department of Ophthalmology, D. Med. Sc., tel. +7-911-226-84-15, e-mail: churashoff@mail.ru
Chernysh V.F. — Associate Professor of the Department of Ophthalmology, Cand. Med. Sc., tel. +7-911-739-71-92, e-mail: vfchernysh@gmail.com
Blinova M.I. — Cand. Biol. Sc., senior research scientist, Laboratory of cell biology in culture, tel. +7-911-700-58-07, e-mail: mira.blinova@mail.ru
Aleksandrova O.I. — junior research associate, Laboratory of cell biology in culture, tel. +7-965-072-86-02, e-mail: elga.aleks@gmail.com
Suetov A.A. — ophthalmologist, Cand. Med. Sc., tel. +7-911-757-61-33, e-mail: ophtalm@mail.ru Gavrilyuk I.O. — ophthalmologist, tel. +7-911-029-93-81, e-mail: iluaayaks@gmail.com
A promising treatment method for patients with limbal stem cell deficiency (LSCD) is the transplantation of cultured limbal epithelial stem cells (LESC) obtained from minimal biopsy samples in various carriers. To investigate the possibility of using cultured autologous LESC on the collagen scaffold (CS) to eliminate LSCD in the experiment. In 30 rabbits (60 eyes) the mechanical LSCD model was created. Animals were divided into 3 groups. The 1st and the 2nd were treatment groups, the 3rd — the control group. In the 1st group collagen scaffold (CS) with cultivated LESC was placed on denuded cornea twice with the 3-days interval, in the 2nd group it was placed once. In the control group CS with no LESC was applied once. On the 90th day transparency noticeably increased in the 1st group in contradistinction to the 2nd and control groups, where vascularization and opacification were sufficiently noticeable. According to impression cytology, epithelium with no goblet cells was found in the 1st group in 90% of cases. Histological examination confirmed it. In the 2nd group the presence of goblet cells was indicated in 50% of cases, in the control group goblet cells were indicated in all the animals. Double application of CS with cultured LESC proved to be effective in LSCD treatment in the experiment and can be recommended for limited clinical trials. Key words: limbal epithelial stem cells, collagen scaffold, limbal deficiency.
Актуальность
Сосудистые помутнения роговицы чаще всего обусловлены снижением функциональной активности стволовых клеток роговичного эпителия — лим-бальных эпителиальных стволовых клеток (ЛЭСК) [1]. Локализуясь в складках, палисады Vogt, ЛЭСК поддерживают постоянный процесс обновления клеток и обеспечивают регенерацию эпителия роговицы при повреждениях. Они также являются естественным барьером для нарастания конъюн-ктивального эпителия на роговицу.
Дисфункция ЛЭСК клинически проявляется состоянием, получившим название лимбальной недостаточности (ЛН). Клинически ЛН проявляется хроническим воспалением глазной поверхности, рецидивирующими и персистирующими эрозиями роговицы с нарастанием на нее конъюнктивального
эпителия, помутнением и васкуляризацией стро-мы с формированием фиброваскулярного паннуса (сосудистого бельма), что приводит к прогрессирующему понижению остроты зрения. Зрительная реабилитация таких пациентов посредством оптической кератопластики возможна только после восстановления фенотипа роговичного эпителия (устранения ЛН).
Одним из наиболее перспективных направлений устранения ЛН является трансплантация на поврежденную роговицу ЛЭСК, культивированных на различных носителях. В качестве последних в настоящее время рассматриваются и материалы на основе коллагена, в частности коллагеновый скаф-фолд [2, 3].
Цель работы — исследовать возможность применения культивированных лимбальных эпители-
Рисунок 1. А — Формирование коллагеновых скаффолдов в лунках. Б — Накладывание мягкой контактной линзы на роговицу с размещенным на ее поверхности коллагеновым скаффолдом. В — Фиксация мягкой контактной линзы к поверхности роговицы с помощью крестообразного шва (Цветная иллюстрация на стр. 279)
альных стволовых клеток на коллагеновом скаф-фолде для устранения лимбальной недостаточности в эксперименте.
Материал и методы
Исследование выполнено на 30 половозрелых кроликах (60 глаз) породы шиншилла весом 2,5-3,5 кг.
Создание модели ЛН. Всем 30 животным проводили операцию на фоне седативного действия 0,5 мл 2%-ного раствора ксилазина гидрохлорида, а также местной анестезии посредством ретро-бульбарного введения 0,3 мл 2,0%-ного раствора лидокаина и инстилляций 0,5%-ного раствора проксиметакаина. После тотального механического удаления роговичного эпителия по всей окружности лимба иссекали ткань в виде ленты шириной 4 мм (по 2,0 мм в роговичной и конъюнктивальной его зоне) и толщиной 0,2 мм [4]. Из роговичной части этой лимбальной ткани каждого глаза брали ограниченный биоптат размером 1х2 мм для последующего культивирования.
Культивируемые клетки. ЛЭСК из биоптатов выделяли ферментативным способом по модифицированному методу Sefat с соавт. [5, 6] из фрагментов лимба. Клетки культивировали в питательной среде аМЕМ (Lonzo, Бельгия) с добавлением 10% FBS (НуС1опе, США), 1%-ного раствора антибиотиков PenStrep ^Ьсо, США) и 2 мМ глутамина ^1^аМах, США). В работе использовали клетки 3-го пассажа.
Подтверждение фенотипа культивируемых эпителиальных клеток 0-3-го пассажей осуществляли непрямым методом флюоресценции с использованием соответствующих антител. Клетки окрашивали против антител к цитокератину 19 (СК 19) и цитокератину 3/12 (СК 3/12). Клетки 3-го пассажа показали высокий уровень экспрессии СК 19 (маркер эпителиальных клеток). Уровень экспрессии СК 3/12 (маркер дифференцированных эпителиальных клеток) был достаточно высоким в первичной популяции (сразу после выделения клеток из лимба) и значительно снижался к 3-му пассажу. Полученные культивированные клетки подвергали криоконсервации.
Приготовление коллагенового скаффолда. Для приготовления КС использовали препарат «Колла-
ген I типа желирующий», являющийся раствором интактного нативного коллагена I типа. Препарат был получен в Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург) методом кислотной экстракции из сухожилий крысиного хвоста [7]. Для приготовления КС смешивали «Коллаген I типа желирующий», концентрированную (10х) среду 199 (Gibco, США) и стерильный 0.34H раствор NaOH (Sigma, США). В полученную смесь добавляли суспензию ЛЭСК с достижением конечной концентрации коллагена 2 мг/мл и переносили в лунки диаметром 15 мм в объеме 500 мкл геля на лунку. Гель инкубировали в СО2-инкубаторе при 37°С в течение 3о минут до полной полимеризации. После полимеризации геля в лунке формировался практически прозрачный КС в виде диска толщиной около 2,0 мм. В лунки добавляли питательную среду. КС готовили за 1 сутки до имплантации животным (рис. 1а).
Операция трансплантации коллагенового скаффолда с культивированными ЛЭСК на роговицу кролика. После формирования на глазах сосудистого помутнения роговицы (через 30 дней после операции по созданию модели ЛН) животные были разделены на две основные и одну контрольную группу по 10 особей (20 глаз) в каждой. Во всех группах последовательно было выполнено удаление фиброваскулярного паннуса путем поверхностной кератэктомии.
В 1-й группе КС с культивированными ЛЭСК трансплантировали на обнаженную роговицу дважды — непосредственно после выполнения поверхностной кератэктомии и на 3-й день после операции. Во 2-й группе КС с культивированными ЛЭСК трансплантировали однократно, непосредственно после выполнения поверхностной кератэктомии. В контрольной группе применили КС, не содержащий клеток. После размещения КС на поверхности роговицы выполняли его фиксацию с помощью бандажной мягкой контактной линзы, а также накладывания дополнительного фиксирующего линзу крестообразного шва (рис. 1б, в). Всем животным выполняли простую блефарорафию одним П-образным провизорным швом. Лечение в послеоперационном периоде включало инстил-ляции 0,3%-ного раствора нетилмицина 4 раза в день и геля, содержащего 5%-ный дексапантенол, 4 раза в день в течение двух недель.
Рисунок 2. Клинические изменения глазной поверхности и эпителизация роговицы в 1-й, 2-й и контрольной группах на 3-й, 7-й, 14-й, 21-й, 30-й, 60-й и 90-й день (пояснения в тексте) (Цветная иллюстрация на стр. 279)
Эпителизацию и состояние стромы роговицы оценивали при помощи биомикроскопии на 3-й, 7-й, 14-й, 21-й, 30-й, 60-й и 90-й день после операции. Чтобы судить о площади деэпителизации роговицы в процентах, применяли окрашивание глазной
поверхности 1%-ным раствором флуоресцеина натрия и проекционную сетку с учетом кривизны поверхности роговицы каждого глаза (одно деление составляло 2% от площади поверхности роговицы). Оценку степени васкуляризации роговицы прово-
0Ф
дили по 4-балльной шкале Inatomi T. [8], а интенсивность помутнения ее стромы — по 10-балльной шкале Войно-Ясенецкого В.В. [9].
С целью определения фенотипа эпителия роговицы на 30-й, 60-й и 90-й день выполняли импрес-сионную цитологию и гистологическое исследование. Забор материала осуществляли посредством аппликации на роговицу ацетат-целлюлозного диска (Mce Membrane 0,45 ^m) в четырех квадрантах. Препарат окрашивали гематоксилином и альциано-вым синим. Бокаловидные клетки определяли по голубой окраске цитоплазмы и смещенному к периферии ядру фиолетового цвета. Гистологическое исследование с окрашиванием альциановым синим и гематоксилином для обнаружения бокаловидных клеток проводили также на 30-й, 60-й и 90-й день.
Статистическую обработку результатов выполняли в программе Statistica 10.0; определяли среднее значение и стандартное отклонение. Для анализа данных, распределенных по закону отличного от нормального, применяли непараметрический критерий (U-критерий Манна — Уитни). Различия между группами считались значимыми при р<0,05.
Результаты
Во всех группах методом биомикроскопии на 3-й день после операции наблюдали частично ре-зорбировавшийся, адгезированный к поверхности роговицы КС. Васкуляризация роговицы в 1-й группе составляла 2,2 балла, во 2-й — 1,7 балла, в контрольной — 1,9 балла. При применении 1%-ного р-ра флуоресцеина натрия, КС полностью окрашивался. После оценки состояния поверхности роговицы в 1-й группе на поверхность частично резорбированного КС помещали второй КС с ауто-логичными ЛЭСК. Затем накладывали бандажную мягкую контактную линзу и фиксирующий шов.
На 7-й день в 1-й группе наблюдали адгезированный, частично резорбировавшийся КС. Во 2-й и контрольной группах КС резорбировал-ся полностью. Нарушение прозрачности роговицы составляло во 2-й группе 3,2 балла, а в контрольной — 4,5 балла. Неоваскуляризация в 1-й группе составляла 2,3 балла, во 2-й — 2,0 балла, в контрольной — 2,6 балла. Площадь окрашивания поверхности роговицы 1%-ным р-ром флуоресцеина натрия составляла во 2-й группе 61,8%, а в контрольной — 73,2%.
На 14-й день КС полностью резорбировался и в 1-й группе. Площадь деэпителизации роговицы в
1-й группе составляла 27,8%, во 2-й — 37,6%, в контрольной — 61,2%. Интенсивность ее помутнения в 1-й группе составляла 2,9 балла, во 2-й — 3,7 балла, в контрольной — 5,4 балла. Неоваскуля-ризация роговицы незначительно возросла во всех группах: в 1-й группе она составляла 2,4 балла, во
2-й — 2,8 балла, в контрольной — 3,3 балла.
На 21-й день васкуляризация и помутнение роговицы во 2-й и контрольной группах продолжали нарастать, в то время как в 1-й группе данные изменения пошли на убыль. Интенсивность помутнения роговицы в 1-й группе составляла 2,6 балла, во 2-й — 3,9 балла, в контрольной — 6,1 балла. Неова-скуляризация в 1-й группе составляла 2,1 балла, во 2-й — 3,3 балла, в контрольной — 3,7 балла. Зона деэпителизации в 1-й группе составляла 16,0%, во 2-й — 27,4%, в контрольной — 45,8% от площади всей роговицы.
На 30-й день наблюдали повышение прозрачности роговицы в 1-й и 2-й группах и ее снижение
в контрольной группе. Интенсивность помутнения роговицы в 1-й группе составляла 2,2 балла, во 2-й — 3,7 балла и в контрольной — 7,5 балла. Неоваскуляризация в 1-й группе составляла 2,0 балла, во 2-й — 2,9 балла, в контрольной — 3,7 балла. Площадь эрозии роговицы охватывала в 1-й группе — 9,6%, во 2-й — 24,4%, в контрольной — 46,2% площади роговицы.
На 60-й день в 1-й и 2-й группах также наблюдали увеличение прозрачности роговицы, а в контрольной — ее снижение. Интенсивность помутнения в 1-й группе составляла 1,5 балла, во 2-й — 3,5 балла, в контрольной — 7,7 балла. Васкуляризация в
1-й группе составляла 1,5 балла, во 2-й — 2,5 балла, в контрольной — 3,6 балла. Остаточная эрозия в 1-й группе составляла 5,2%, во 2-й — 11,6%. В контрольной группе сохранялась обширная зона эрозии — 41, 2% площади роговицы.
На 90-й день интенсивность помутнения роговицы в 1-й группе составляла 1,4 балла, во
2-й — 3,4 балла, в контрольной — 7,7 балла. Ва-скуляризация в 1-й группе составляла 0,9 балла, во 2-й — 2,3 балла, в контрольной — 3,6 балла. Площадь деэпителизации в 1-й группе в среднем составляла 1,6%, во 2-й — 9,8%. В контрольной группе сохранялась персистирующая эрозия, занимающая 41,2% площади роговицы (рис. 2).
На 30-й, 60-й и 90-й день методом импрессион-ной цитологии на глазах контрольной группы в эпителии роговицы были обнаружены многочисленные бокаловидные клетки в 100% наблюдений. Во 2-й группе были обнаружены единичные бокаловидные клетки на 30-й и 60-й день в 60%, а на 90-й день — в 50% наблюдений. В 1-й группе на 30-й день в 20% случаев были обнаружены единичные бокаловидные клетки. На 60-й и 90-й день в 10% случаев (2 глаза) были обнаружены единичные бокаловидные клетки, однако в остальных 90% наблюдений был обнаружен плоский неороговевающий эпителий роговицы, не содержащий бокаловидных клеток.
Гистологическое исследование показало наличие бокаловидных клеток в роговичном эпителии в контрольной группе на 30-й, 60-й и 90-й день также в 100% наблюдений. Во 2-й группе бокаловидные клетки были обнаружены в 50% наблюдений на 30-й, 60-й и 90-й день. В 1-й группе на 30-й, 60-й и 90-й день бокаловидные клетки в эпителии роговицы обнаружены не были.
При проведении статистического сравнения в 1-й, 2-й и контрольной группах по степени деэпи-телизации, васкуляризации и прозрачности роговицы, а также по наличию бокаловидных клеток были выявлены статистически значимые различия (p<0,05) между этими группами.
Обсуждение
Таким образом, двукратная трансплантация на поверхность роговицы КС с культивированными ЛЭСК дает возможность создать их депо, достаточное для восстановления эпителия роговичного фенотипа. Такая методика показала себя эффективной в восстановлении эпителиального покрова роговицы, с повышением ее прозрачности и снижением васкуляризации стромы. Данные результаты соотносятся с результатами предыдущих исследований, где применялись культивированные ЛЭСК на других носителях: амниотической мембране, си-ликон-гидрогелевой контактной линзе, материалах на основе коллагена и фибрина и др. [3, 10-13].
В то же время преимуществом биосинтезируемых материалов является их наибольшая доступность для потокового применения.
Вывод
Двукратное применение КС, содержащего культивированные ЛЭСК, показало себя эффективным в устранении ЛН в эксперименте и может быть рекомендовано для ограниченных клинических испытаний.
ЛИТЕРАТУРА
1. Pascolini D., Mariotti S.P.M. Global estimates of visual impairment: 2010 // British Journal Ophthalmology. — 2012. — Vol. 96. — P. 614-618.
2. Chae J.J., Ambrose W.M., Espinoza F.A. et al. Regeneration of corneal epithelium utilizing a collagen vitrigel membrane in rabbit models for corneal stromal wound and limbal stem cell deficiency // Acta Ophthalmologica. — 2015. — Vol. 93. — P. e57-66.
3. Shortt A.J., Secker G.A., Notara M.D. et al. Transplantation of ex vivo cultured limbal epithelial stem cells: a review of techniques and clinical results // Surv Ophthalmol. — 2007. — Vol. 52. — P. 483-502.
4. Безушко А.В., Дубовиков А.С., Суетов А.А., и др. Модификация экспериментальной механической модели лимбальной недостаточности // Современные технологии в офтальмологии. — 2017. — №17. — С. 26-28.
5. Sefat F., McKean R., Deshpande P. et al. Production, sterilisation and storage of biodegradable electrospun PLGA membranes for delivery of limbal stem cells to the cornea // Procedia Engineering. — 2013. — Vol. 59. — P. 101-116.
6. Колобов К.А., Дубовиков А.С., Конкиева А.В. и др. Об успешном культивировании лимбальных эпителиальных клеток рогович-
ного эпителия в эксперименте // Материалы научной конференции офтальмологов «Невские горизонты — 2016» / СПбГПМУ. — СПб: Политехника-сервис, 2016. — С. 497-499.
7. Chandrakasan G., Torchia D.A., Piez K.A. Preparation of intact monomeric collagen from rat tail tendon and skin and the structure of the nonhelical ends in solution // Journal of Biological Chemistry. — 1976. — Vol. 251. — P. 6062-6067.
8. Inatomi T., Nakamura T., Koizumi N. et al. Midterm results on ocular surface reconstruction using cultivated autologous oral mucosal epithelial transplantation // American Journal of Ophthalmology. — 2006. — Vol. 141. — P. 267-275.
9. Войно-Ясенецкий В.В. Разрастание и изменчивость тканей глаза при его заболеваниях и травмах. — К.: Вища школа, 1979. — 224 с.
10. Shimazaki J., Aiba M., Goto E. et al. Transplantation of human limbal epithelium cultivated on amniotic membrane for the treatment of severe ocular surface disorders // Ophthalmology. — 2002. — Vol. 109. — P. 1285-1290.
11. Bobba S., Chow S., Watson S., Di Girolamo N. Clinical outcomes of xeno-free expansion and transplantation of autologous ocular surface epithelial stem cells via contact lens delivery: a prospective case series // Stem Cell Res Ther. — 2015. — Vol. 6. — P. 23.
12. Rama P., Bonini S., Lambiase A., et al. Autologous fibrin-cultured limbal stem cells permanently restore the corneal surface of patients with total limbal stem cell deficiency // Transplantation. — 2001. — Vol. 72. — P. 1478-85.
13. Schwab I.R., Reyes M., Isseroff R.R. Successful transplantation of bioengineered tissue replacements in patients with ocular surface disease // Cornea. — 2000. — Vol. 19. — P. 421-6.
Работа выполнена в рамках проекта РНФ №14-50-00068
