CC BY
40
С.П. Ярков, С.И. Третья ков, Л.А. Башарова, С.Н. Скопинская, Е.К. Шаулина, E.H. Храмов
Исследование возможности иммунохроматографической индикации микроорганизмов-биодеструкторов
ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения» ФМБА России, г. Москва
S.P. Yarkov, S.I. Tretyakov, L.A. Basharova, S.N. Skopinskaya, E.K. Shaulina, E.N. Khramov
Lateral flow assay test in detection of biodegrading microorganisms
FSUE "State Scientific Research Institute of Biological Engineering" FMBA
Ключевые слова: иммунохроматография, наноча-стицы коллоидного золота, индикация, микроорганизмы биодеструкторы.
В целях создания средства быстрой идентификации микробных загрязнений микроорганизмами-биодеструкторами поверхностей замкнутых гер-мообъемов были получены конъюгаты наночастиц коллоидного золота с поликлональными антителами к антигенам спор микроорганизмов рода Bacillus, плесневых грибов рода Aspergillus, дрож-жеподобных грибов Candida albicans, бактерий E. coli серотипов O+K. На основе полученных конъ-югатов были сконструированы иммунохрома-тографические тесты и изучены их аналитические характеристики (чувствительность и специфичность) по отношению к представителям микроорганизмов-биодеструкторов, контамини-рующих замкнутые обитаемые гермообъемы.
Исследования микрофлоры замкнутых обитаемых объектов свидетельствуют о накоплении и развитии на различных поверхностях конструкционных материалов оборудования и приборов микроорганизмов -биодеструкторов, жизнедеятельность которых может привести к разрушению и выходу из строя оборудования [1]. Накопление такого биоматериала в высоких концентрациях может представлять опасность для здоровья людей, длительно находящихся в замкнутых гермообъемах — помещениях орбитальных космических станций, космических кораблях, совершающих длительные полеты, в перспективе и планетных обитаемых
Keywords: lateral flow assay, colloidal gold nano-particles, indication, biodegrading microorganisms.
In order to create a mean for the rapid identification of the microbial contamination by the biodegrading microorganisms, residing on the surfaces of closed germ cells, were developed conjugates of gold nanoparticles with polyclonal antibodies to antigenes of microorganisms of species Bacillus(spores), mushrooms of species Aspergillus, yeast-like mushrooms Candida albicans, bacteria E. coli serotypes O+K. On the basis of the received conjugates were designed lateral flow assay tests and investigated analytical parameters (sensitivity and specificity) in relation with known biodegrading microorganisms, residing in closed manned germetic isolated volumes.
етанций, a íaHHe нpн нpoнзвoдcтвe ^cco^ ньк paбoт, длигельтом нpeбывaннн в год-вoдныx aннapaтax. Cвoeвpeмeннoe выяв-лeниe микpoбнoгo зaгpязнeния внyтpeнниx нoвepxнocтeй зaмкнyтыx oбитaeмыx oбъe-мoв нoзвoлит ^инять нpeвeнтивныe мepы для дeзинфeкции или изoляции кoлoний ми-кpoopгaнизмoв и coxpaнeния гигиeничecкиx ycлoвий тpyдa.
Для выявлeния кoлoний микpoopгa-низмoв, иx идeнтификaции нa paнниx cra-дияx paзвития микpoбнoй кoнтaминaции лecooбpaзнo иcнoльзoвaть иммyнoxимичe-crae мeтoды ндeнтнфнкaцнн, нe тpeбyющнe ^oœ^ro oбopyдoвaння и бoльшoгo кoлнчe-
ства манипуляций для проведения анализа. На наш взгляд, таким методом мог бы стать иммунохроматографический метод выявления микроорганизмов с визуальной или приборной регистрацией, важным преимуществом которого является возможность проведения анализа в одну стадию за 10—30 минут. Дополнительные достоинства таких тестов — возможность проведения анализов в условиях микрогравитации, малый вес и небольшие габариты, исключительная простота проведения анализа, не требующая специальных навыков у оператора. Успешное применение этого метода в медицинской диагностике, санитарии, ветеринарии, охране окружающей среды, контроле качества пищевых продуктов доказывает его универсальность и перспективность [6; 7].
Ранее нами была показана возможность идентификации патогенных грибов рода Aspergillus с помощью иммунохромато-графии [4].
Целью настоящей работы стало исследование возможности иммунохроматогра-фической идентификации на уровне рода основных представителей таксономических групп микроорганизмов, способных к биодеструкции конструкционных материалов: спор бацилл, вегетативных форм микроорганизмов, дрожжеподобных грибов и плесневых грибов.
Материалы и методы
Для получения коньюгатов наночастиц коллоидного золота (НКЗ) с антителами использовали поликлональные антитела (ПКА) производства фирмы «Pierce» (США).
ПКА кролика: к грибам рода Aspergillus (кат. № РА 1-7202), к Candida albicans (кат. № РА 1-27158), к спорам Bacillus (кат. № РА 1-73032). К клеткам бактерий Escherichia coli серотипов O+K конь-югаты получали с ПКА козы (кат. № РА 1-73032). В отдельных случаях для получения конъюгата использовали ПКА кролика к Aspergillus spp., поставщик — «Antibodies-online» (США).
НКЗ получали по методу Френса [8], восстанавливая золотохлористоводородную кислоту цитратом натрия в контролируемых условиях. Средний диаметр НКЗ, рассчитан-
ный из оптического спектра, как это описано в работе [2], составил 25 нм. Конъюги-рование антител с НКЗ, получение компонентов иммунохроматографического теста, используемые при этом материалы и реактивы, а также сборка описаны нами ранее [5; 6]. В аналитической зоне иммунохроматографического теста находились ПКА к указанному микроорганизму, в контрольной зоне — антивидовые по отношению к антителам конъюгата антитела, т.е. козьи антикроличьи либо кроличьи антикозьи иммуноглобулины. Использовали антивидовые антитела, поставляемые ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения» (Россия).
Процедура анализа заключалась в нанесении микробной суспензии в буфере для проведения иммунохроматографического анализа на подложку для впитывания иммунохроматографического теста, инкубации в течение 15—20 минут при комнатной температуре и регистрации результата при появлении окрашенной полосы иммунного комплекса с НКЗ в аналитической зоне теста. Регистрацию эффекта окрашивания аналитической и контрольной зон иммунохроматогра-фическго теста проводили как визуальным путем, так и с помощью видеоцифрового анализатора хроматограмм «Рефлеком» (ООО «Синтэко-комплекс», Россия). Визуальную оценку результатов интенсивности сигнала полос проводили по крестовой системе: «—» — видимая глазом полоса розово-красного цвета отсутствует; «+» — видна полоса розово-красного цвета; «++» — четко видна полоса розово-красного цвета большей интенсивности; «+++» — видна полоса красного цвета; «++++» — видна полоса интенсивного красного цвета.
Измерение интенсивности окрашивания с помощью прибора «Рефлеком» проводили для каждой концентрации микроорганизмов троекратно, вычисляли среднее значение и среднеквадратическое отклонение при 95% доверительной вероятности. За положительные результаты анализа принимали трехкратное превышение сигнала прибора над холостым опытом.
В качестве контрольного материала использовали культуры вегетативных и спо-
ровых форм бактерий, грибов и дрожжей. Бактерии — E. coli (штаммы 1257, М17, 3115 и 9637), в. cereus var. anthracoides (штамм 250), B. subtilis (штамм 3), бактериальный препарат «Биоспорин» (B. subtilis, штамм 3, и B. licheniformis, штамм 31). Культуры грибов Aspergillus niger и Aspergillus flavus выращивали на агаризованной среде Чапека— Докса, смывали физиологическим раствором и использовали для проведения анализа. Суспензии содержали как мицелий, так и споры грибов. Использовали также дрожжевые клетки Candida albicans и Saccharomyces cerevisiae ВКМ Y-397.
Результаты исследования
Для проведения исследования микроорганизмы были разделены на четыре условные таксономические группы: вегетативные формы бактерий, споры бактерий, плесневые грибы и дрожжеподобные грибы.
Изучали аналитический отклик полученных иммунохроматографических тестов при различных концентрациях микроорганизмов, перекрестные реакции и время достижения максимального значения аналитического сигнала.
Схема построения иммунохроматогра-фического теста приведена на рисунке 1.
Оправа иммунохроматографического теста имеет два отверстия: для нанесения исследуемого образца (маркировка «S») и на-
блюдения результатов — аналитическая зона (А-зона) и контрольная зона (К-зона) с маркировками «Т» и «С». Для лучшей сохранности теста его помещают в пакет с основой из алюминиевой фольги с осушителем.
Принцип работы теста заключается в следующем. Исследуемые микроорганизмы смешиваются с буфером анализа и вносятся в отверстие для нанесения образца. При наличии в образце соответствующего микроорганизма он реагирует со специфическими антителами, конъюгированными с НКЗ, образуя окрашенный комплекс. Комплекс движется по мембране за счет капиллярных сил и реагирует с антителами к данному микроорганизму, иммобилизованными в аналитической зоне мембраны (на уровне маркировки «Т»), образуя окрашенную линию розово-красного цвета.
Несвязавшийся в аналитической зоне избыток конъюгата коллоидного золота с антимикробными антителами перемещается по мембране далее и взаимодействует с антивидовыми антителами, нанесен -ными в контрольную зону, образуя линию розово-красного цвета. Окрашенные полосы в А- и К-зонах можно обнаружить визуально. Появление в К-зоне окрашенной полосы является показателем правильности постановки эксперимента и иммунохимической сохранности теста.
Для определения чувствительности иммунохроматографических тестов изуча-
Рис. 1. Схема построения иммунохроматографического теста
1 - подложка для нанесения образца; 2 - подложка, пропитанная конъюгатом наночастиц коллоидного золота с антителами, специфичными к антигенам микроорганизмов; 3 - нитроцеллюлозная мембрана; 4 - аналитическая зона с антителами, специфичными к антигенам микроорганизмов; 5 - контрольная зона с антивидовыми антителами; 6 - впитывающая подложка; 7 - пластиковая оправа. Стрелкой указано направление тока жидкой
пробы, содержащей аналит
Рис. 2. Иммунохроматограммы суспензий E. coli M17
Концентрация микроорганизмов в КОЕ/мл: 1 - 0; 2 - 5x10«; 3 - 1х107; 4 - 2,5х107, 5 - 5х107, 6 - 1х108
ли зависимости окрашивания аналитических зон теста от концентрации микроорганизмов, при этом порог чувствительности определяли как визуально по крестовой системе, так и с помощью видеоцифрового анализатора иммунохроматограмм «Рефлеком». В последнем случае порогом чувствительности стало превышение интенсивности окрашивания аналитической зоны теста над фоном холостого опыта в три раза. Показания прибора «Рефлеком» в диапазоне 0,7—1,0 усл. ед. соответствовали наличию хорошо различимой глазом полосы розово-красного цвета в аналитической зоне. Типичные показания прибора «Рефлеком» для контрольной зоны теста лежали в диапазоне 6,5—18,0 усл. ед. в зависимости от вида теста и определяемого микроорганизма. Измерения чувствительности проходили на 25-й минуте анализа.
Внешний вид иммунохроматограм-мы суспензии микроорганизмов на примере E. coli M17 приведен на рисунке 2.
На рисунке 3 приведены типичные кривые зависимостей окрашивания аналитической зоны иммунохроматографических тестов от концентрации микроорганизмов, измеренные с помощью прибора «Рефлеком», представляющие собой линейные зависимости в полулогарифмических координатах.
Результаты определения чувствительности иммунохроматографических тестов приведены в таблице 1.
Исследования специфичности имму-нохроматографических тестов проводили пу-
тем внесения суспензии микроорганизмов, принадлежащих к другой условной таксономической группе, в концентрации, превышающей чувствительность теста в 10—20 раз. Перекрестных реакций не наблюдалось.
Развитие окраски аналитической зоны иммунохроматографического теста от времени анализа микроорганизмов рода Bacillus приведено на рисунке 4 (кривая 4).
Развитие окраски аналитической зоны иммунохроматографического теста во времени на примере грибов микромицетов приведено в таблице 2. Из данных, представленных в таблице, видно, что добавление к буферу анализа суспензии грибов A. niger или
10" 10'
Концентрация микроорганизмов, КОЕ/мл
Рис. 3. График зависимости интенсивности окрашивания аналитической зоны иммунохроматографического теста от концентрации жизнеспособных микроорганизмов, измеренной с помощью видеоцифрового анализатора «Рефлеком» 1 - B. cereus IP 5832; 2 - E. coli M17; 3 - A. niger
Таблица 1 Чувствительность иммунохроматографических тестов для выявления микроорганизмов — представителей различных условных таксономических групп
Наименование микроорганизма Единицы измерения Минимально определяемая концентрация Примечание
Вегетативные формы бактерий
E. coli M17 КОЕ/мл 5х106 Препарат «Колибактерин»
E. coli 1257 КОЕ/мл >1х109 -
E. coli 3115 м.к./мл >1х109 -
E. coli 9637 м.к./мл >1х109 -
Споры бацилл
B. cereus var. anthracoides 250 КОЕ/мл 2х106 -
B. cereus 96 КОЕ/мл 1х107 -
B. cereus IP 5832 КОЕ/мл 1х106 Препарат «Бактисубтил»
Смесь B. subtilis 3 и B. licheniformis 31 м.к./мл 1х107 Препарат «Биоспорин»
B. anthracis СТИ м.к./мл 1х107 Сибиреязвенная вакцина
B. anthracis СТИ м.к./мл 1х106 Для построения теста использовали моноклональ-ные антитела Б26 и кроличьи ПКА, специфичные к споровому антигену В. аиЛгаеЬ
Плесневые грибы микромицеты
A. niger КОЕ/мл 1х106 -
A. flavus КОЕ/мл >1х108 -
Дрожжеподобные грибы
C. albicans КОЕ/мл 1х107 -
В контрольной зоне всех иммунохро-матографических тестов наблюдалась полоса красного цвета, по интенсивности соответствующая «++++».
Полученные иммунохроматографичес-кие тесты были более активны при обнаружении A. niger по сравнению с A. flavus. Внесение суспензий спор С. albicans 15 в концентрации 3х 106 м.к./мл или спор B. subtilis 3 в концентрации 1х107 или 1х108 м.к./мл не приводило к появлению в аналитической зоне видимых глазом полос розово-красного цвета, что свидетельствует о специфичности разрабо-тайного теста, по крайней мере в отношении исследованных культур.
Представленные данные говорят о принципиальной возможности создания им-мунохроматографических тестов для выявления грибов рода Aspergillus.
Исследовали динамику интенсивности окрашивания аналитической зоны имму-нохроматографических тестов для выявления дрожжеподобных грибов C. albicans во времени при внесении образцов с различными концентрациями C. albicans от 1х106 до 5х107 КОЕ/мл спустя 5, 10, 15, 20 и 25 минут (см. рис. 4, кривые 1—3).
А. flavus приводит к появлению в аналитической зоне иммунохроматографического теста полосы розово-красного цвета. Сигнал развивался во времени и достигал максимальных значений, соответствовавших по интенсивности «++» и «+++», через 20—30 минут.
Рис. 4. График зависимости интенсивности окрашивания аналитической зоны иммунохроматографических тестов для определения C. albicans и микроорганизмов рода Bacillus от времени анализа 1 - отрицательный контроль и клетки C. albicans в концентрациях 1х106 и 5х106 КОЕ/мл; 2 - 1х107 КОЕ/мл; 3 - 5х107 КОЕ/мл; 4 - клетки B. cereus var. anthracoides 250 в концентрации 2,5х106 КОЕ/мл
Таблица 2 Результаты анализа при выявлении микромицетов рода Aspergillus визуальным методом*
Состав анализируемого образца** Время, мин/интенсивность окрашивания аналитической зоны теста
5 10 20 30
Отрицательный контроль - - - -
A. niger, 20 мкл - + ++ ++
A. niger, 40 мкл - + ++ +++
A. flavus, 20 мкл - + ++
A. flavus, 40 мкл - + + ++
C. albicans - - - -
B. subtilis 3 - - - -
Примечания: * — в эксперименте для индикации использовали иммунохроматографический тест на основе ПКА кролика к Aspergillus spp., поставщик — «Antibodies-online» (США); ** — указаны объемы смывов с культуры микромицетов рода Aspergillus, вносимых в иммунохроматографический тест.
При исследовании этих иммуно-хроматографических тестов на специфичность использовали дрожжи Saccharomyces cerevisiae, бактерии E. coli 3115 и 9637, плесневые грибы A. niger. Результаты регистрировали через 25 минут после нанесения первой капли суспензии микроорганизмов. Окрашенную линию в аналитической зоне иммунохроматографического теста наблюдали только при тестировании с образцом, содержавшим дрожжеподобные грибы C. albicans. Разработанный иммунохро-матографический тест не дает перекреста с дрожжами Saccharomyces cerevisiae, бактериями E. coli 3115 и 9637 и плесневыми грибами A. niger, взятыми в концентрации 1х108 КОЕ/мл.
Обсуждение результатов
Значительное разнообразие микроорганизмов-биодеструкторов, принадлежащих к различным таксономическим группам, весьма велико. Так, общее число разновидностей грибов, известных в настоящее время,
составляет десятки тысяч, из них около 300 являются патогенными для человека [3].
Современные иммунохимические методы, в том числе иммунохроматография, позволяют проводить высокоспецифичную идентификацию микроорганизмов. При этом для построения тестов используются моно-клональные антитела либо адсорбированные антисыворотки, содержащие специфические антитела к иммуногену.
Построение иммунохроматографичес-ких тестов с высокой специфичностью (на уровне штамма или вида) по отношению к микроорганизмам-биодеструкторам нецелесообразно ввиду низкой вероятности обнаружения конкретного микроорганизма в окружающей среде. В этой связи нами предпринята попытка исследовать возможность идентификации на уровне рода, применяя ПКА, специфичные к общим антигенам (табл. 3).
Приве денные экспериментальные результаты показывают, что иммунохромато-графические тесты, построенные на основе ПКА к общим для данного рода микро-
Таблица 3 Антитела и их иммунохимическая реакционная способность по данным производителя
Шифр антител Иммунохимическое взаимодействие Иммуноген Продуцент антител/ изотип
РА 1-7203 Споровые антигены бацилл Очищенные споры B. cereus и B. subtilis Кролик/ IgG выделены из неад-сорбированной антисыворотки
РА 1-73032 Антигены О+К бактерий E. coli. Не реагируют с представителями семейства Enterobacteriaceae Смесь клеток E. coli различных серотипов Коза/ IgG выделены из неад-сорбированной антисыворотки
РА1-7202 Растворимые белковые антигены грибов рода Aspergillus Растворимый экстракт из грибов A. fUmi-gatus, A. flavus, A. niger, A. terreus Кролик/ IgG
РА1-27158 Candida albicans и другие дрожжеподобные грибы Candida albicans тип А Кролик/ IgG
организмов антигенам, позволяют выявлять условные таксономические группы микроорганизмов-биодеструкторов. В то же время иммунохроматографические тесты демонстрируют умеренную чувствительность на уровне 5Х106—1Х109 м.к./мл. Особенно это заметно на примере иммунохромато-графического теста, сконструированного для выявления E. coli (см. табл. 1). При оценке контаминации поверхностей объектов внешней среды с помощью иммунохро-матографических тестов ( при сборе проб с 100 см2 поверхности и 100% эффективности отбора) такая чувствительность соответствует выявляемой контаминации 5х104— 1х107 м.к./см2. Вместе с тем типичная чувствительность иммунохроматографии при выявлении клеток высокопатогенных микроорганизмов, например возбудителей особо опасных инфекций, находится в диапазоне 1х105-1х106 м.к./мл [6].
Все сконструированные в данной работе тесты демонстрируют удовлетворительную специфичность и не дают перекрестных реакций, по крайней мере с перечисленными в таблице 1 микроорганизмами.
Умеренная чувствительность имму-нохроматографических тестов может быть объяснена низким содержанием доли высо-коафинных антител в IgG-фракции используемых нами кроличьих ПКА. При проведении иммунохроматографии контакт между реагентами, нанесенными на мембраны, непродолжителен, и в первую очередь в имму-нохимических реакциях участвуют высоко-афинные антитела. Для иллюстрации этого предположения нами был проведен эксперимент с тестом, в котором в качестве антител конъюгата использовали специфическое по отношению к споровому антигену возбудителя сибирской язвы (B. anthracis) мо-ноклональное антитело SA26, а в аналитическую зону теста наносили кроличьи ПКА к возбудителю сибирской язвы, не взаимодействующие с другими представителями рода Bacillus. Чувствительность этого теста в 10 раз превышала чувствительность теста, построенного на основе ПКА для общих антигенов бацилл.
Другой причиной, которая может затруднить иммунохроматографическое выяв-
ление плесневых и дрожжеподобных грибов, является то, что они представляют собой сложные клеточные структуры, в которых многие растворимые антигены недостаточно экспонированы на поверхности. Микромицеты рода Aspergillus склонны к спорообразованию в неблагоприятных условиях, и выделение ими водорастворимых антигенов во внешнюю среду может быть затруднено. Одним из путей повышения чувствительности индикации этих микроорганизмов может быть предварительное культивирование на питательных средах.
Длительность анализа, при котором достигается максимальная чувствительность, для бактерий составляет 20—25 минут, а для плесневых и дрожжевых грибов — 30 минут и более (см. рис. 4), причем для бактерий график зависимости интенсивности окрашивания аналитической зоны выходит на плато, а для дрожжеподобных грибов С. albicans плато не наблюдается, график стремится вверх. Вероятно, это связано с большим размером этих микроорганизмов (2—10 мкм) по сравнению с бактериями (размеры B. subtilis, например, составляют 0,75 х3 мкм) [3] и особенностями перемещения этих микроорганизмов по аналитической мембране иммунохроматографи-ческого теста под действием капиллярного тока жидкости при проведении иммунохроматографического анализа.
Заключение
Полученные иммунохроматографические тесты на основе поликлональных иммуноглобулинов кролика и козы взаимодействуют с антигенами микроорганизмов-биодеструкторов, в том числе патогенных и условно патогенных для человека, — споровых форм бацилл, вегетативных форм бактерий, плесневых и дрожжеподобных грибов — и позволяют выявлять их в концентрациях 5х106—1х109 м.к./мл, что соответствует поверхностной контаминации 5х104— 1 х 107 м.к./см2.
Перекрестных реакций между различными условными таксономическими группами микроорганизмов при использовании стрип-тестов не наблюдалось. Время достижения максимального значения аналитиче-
ского сигнала не превышало 25—30 минут при комнатной температуре.
Благодарности. Авторы выражают глубокую благодарность ведущему научному сотруднику ФГУП «ГосНИИБП» кандидату биологических наук О.Б. Пудовой за помощь в проведении работы, а также кандидату биологических наук И.В. Курбатовой, сотруднику Института медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марци-новского Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, за предоставленные культуры грибов A. niger и A. flavus и возможность работы с ними.
Исследование проведено в рамках Государственного контракта с ФМБА России от 24.06.2016 г. № 42.142.16.0.
Литература
1. Алехова Т.А., Александрова А.В., Загус-тина Н.А. и др. Микроскопические грибы на Российском сегменте Уеждународной космической станции // Микология и фитопатология. 2009. Т. 43. № 5. С. 9-19.
2. Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Щего-лев С.Ю., Хлебцов П. Г. Золотые нано-частицы: синтез, свойства, биомедицинское применение // Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН. М.: Наука, 2008.
3. Дьяков Ю.Т., Шнырева А.В., Сергеев А.Ю. Введение в генетику грибов. М.: Академия, 2005.
4. Скопинская С.Н., Курбатова И.В. Разработка иммунохроматографического теста для быстрого обнаружения грибов рода Aspergillus // Успехи медицинской микологии: Материалы VI Всероссийского конгресса по медицинской микологии / Под
ред. Ю.В. Сергеева. М., 2014. Т. XIII. С. 28-31.
5. Титов А.А., Шиленко И.В., Ярков С.П. и др. Разработка и оптимизация иммунох-роматографических тестов для выявления ботулинических токсинов // Прикладная биохимия и микробиология. 2012. Т. 48. № 2. С. 1-8.
6. Ярков С.П., Третьяков С.И., Башарова Л.А., Злобин В.Н. Индикация возбудителей особо опасных заболеваний с помощью иммунохроматографии и видеоцифрового анализа // Вестник РАМН. 2007. № 12. С. 22-26.
7. Ярков С.П., Шиленко И.В. Применение иммунохроматографии для выявления патогенов и диагностики заболеваний // Современные методы индикации патогенов и токсинов в объектах окружающей среды и диагностики социально значимых инфекционных заболеваний для обеспечения химической и биологической безопасности / Под ред. В.Н. Злобина. М., 2010. С. 57-118.
8. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions // Nature Physical Science. 1973. Vol. 241. No. 1. P. 20-22.
Контакты:
Ярков Сергей Петрович, ФГУП «ГосНИИ БП» ФМБА России; начальник отдела спектральных методов исследования, доктор биологических наук, старший научный сотрудник.
Тел. раб.: (495) 491 86 83, (495) 491 73 72. E-mail: diasol@dol.ru, niibp@dol.ru
