CC BY
39
Для корреспонденции
Хундерякова Наталья Васильевна - кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник подразделения ИТЭБ РАН
Адрес: 142290, Российская Федерация, Московская область,
г. Пущино, Институтская ул., д. 3
Телефон: (495) 632-78-69
E-mail: nkhunderyakova@gmail.com
https://orcid.org/0000-0003-4248-0279
Хундерякова Н.В.1, Белослудцева Н.В.1, Хмиль Н.В.1, Мосенцов А.А.1, Степанов М.Р.2, Ананян М.А.2, Миронова Г.Д.1
Исследование влияния водорастворимой формы дигидрокверцетина при его введении per os на энергетический обмен в лимфоцитах крови крыс с экспериментальной кардиомиопатией
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, г. Пущино, Московская область, Российская Федерация
2 Общество с ограниченной ответственностью «Продвинутые Технологии», 119333, г. Москва, Российская Федерация
1 Institute of Theoretical and Experimental Biophysics of Russian Academy of Sciences, 142290, Pushchino, Moscow Region, Russian Federation
2 Advanced Technologies Ltd., 119333, Moscow, Russian Federation
Кардиомиопатии относятся к наиболее тяжелым патологиям миокарда, которые характеризуются резистентностью к терапии и высокой смертностью вследствие нарастающей сердечной недостаточности и аритмии. Патологические изменения в клетках миокарда при кардиомиопатиях связаны с дисфункцией митохондрий, приводящей к избыточному образованию активных форм кислорода и развитию окислительного стресса. В этой связи изучение терапевтического потенциала применения эффективных антиокси-дантов при кардиомиопатиях, а также механизмов их действия на функционирование митохондрий актуально и представляет высокую практическую значимость.
Цель исследования - определить влияние перорального 14-дневного введения природного антиоксиданта дигидрокверцетина в водорастворимой форме (ДГК-ВФ) на активности ключевого маркера дыхания митохондрий сукцинат-
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 20-015-00029A). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Хундерякова Н.В., Белослудцева Н.В., Хмиль Н.В., Мосенцов А.А., Степанов М.Р., Ананян М.А., Миронова Г.Д. Исследование влияния водорастворимой формы дигидрокверцетина при его введении per os на энергетический обмен в лимфоцитах крови крыс с экспериментальной кардиомиопатией // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 6. С. 50-58. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-6-50-58 Статья поступила в редакцию 03.06.2021. Принята в печать 26.10.2021.
Funding. The reserch was supported by the Russian Foundation for Basic Research (Grant No. 20-015-00029A). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
For citation: Khunderyakova N.V., Belosludtseva N.V., Khmil N.V., Mosentsov A.A., Stepanov M.R., Ananyan M.A., Mironova G.D. Effect of per os administration of dihydroquercetin aqueous form on energy exchange in blood lymphocytes of rats with experimental cardiomyopathy. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2021; 90 (6): 50-8. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-6-50-58 (in Russian) Received 03.06.2021. Accepted 26.10.2021.
Effect of per os administration of dihydroquercetin aqueous form on energy exchange in blood lymphocytes of rats with experimental cardiomyopathy
Khunderyakova N.V.1, Belosludtseva N.V.1, Khmil N.V.1, Mosentsov A.A.1, Stepanov M.R.2, Ananyan M.A.2, Mironova G.D.1
дегидрогеназы (СДГ) и цитоплазматического маркера гликолиза лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в лимфоцитах крови, а также на уровень перекисного окисления липидов в сыворотке крови крыс в норме и при экспериментальной кардио-миопатии.
Материал и методы. Исследование проводили на половозрелых крысах-самцах линии Вистар (масса тела 220-240 г). Для моделирования кардиомиопатии у животных применяли гидрохлорид изопреналина (двукратное подкожное введение в дозе 150 мг на 1 кг массы тела, с перерывом в 24 ч). ДГК-ВФ добавляли в питьевую воду в течение 14 сут в дозах 15 или 30 мг на 1 кг массы тела крыс. Активность СДГ и ЛДГ в лимфоцитах измеряли с помощью высокочувствительного цитобиохимического метода на мазке крови по восстановлению нитросинего тетразолия хлорида до темно-синего диформазана. Содержание малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови, митохондриях сердца и печени крыс определяли спектрофотометрическим методом с помощью тиобарбитуровой кислоты. Митохондрии выделяли из тканей крыс общепринятым методом дифференциального центрифугирования. Дыхание митохондрий регистрировали полярографическим методом.
Результаты. Экспериментальная кардиомиопатия у крыс сопровождалась увеличением содержания МДА в 2 раза в сыворотке крови, а также статистически значимым повышением активности СДГ и ЛДГ в лимфоцитах крови. Курсовое пероральное применение ДГК-ВФ при кардиомиопатии в дозе 15 мг на 1 кг массы тела крыс приводило к значительному снижению уровня МДА в сыворотке крови, но не изменяло активность СДГ и ЛДГ в лимфоцитах крови по сравнению с животными с кардиомиопатией, не получавшими ДГК-ВФ. В контрольной группе животных применение ДГК-ВФ в дозе 15 мг/кг достоверно увеличивало активность ЛДГ в лимфоцитах крови, но не оказывало статистически значимого влияния на активность СДГ, а также параметры митохондриального дыхания и окислительного фосфори-лирования, уровень МДА в митохондриях сердца и печени. Увеличение вводимой дозы ДГК-ВФ до 30 мг/кг оказывало меньшее влияние на изменения указанных параметров у контрольных животных.
Заключение. Полученные данные показывают, что при экспериментальной кардиомиопатии у крыс курсовое применение ДГК-ВФ в дозе 15 мг на 1 кг массы тела оказывает антиоксидантное действие, препятствующее развитию перекисного окисления липидов в сыворотке крови, а у контрольных животных может модулировать энергетический обмен в сторону усиления гликолиза в лимфоцитах крови.
Ключевые слова: сукцинатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, лимфоциты, митохондрии, перекисное окисление липидов, водорастворимая форма дигидрокверцетина, изопреналин-индуцированная кардиомио-патия
Cardiomyopathies are among the most severe myocardial pathologies, which are characterized by resistance to therapy and high mortality due to increasing heart failure and arrhythmia. Cardiomyocyte pathological changes upon cardiomyopathies are associated with mitochondrial dysfunction, leading to excessive formation of reactive oxygen species and the development of oxidative stress. In this regard, the study of the therapeutic potential of antioxidants in cardiomyopathies, as well as the mechanisms of their action on the functioning of mitochondria, is relevant and of high practical importance.
The aim of this study was to determine the effect of oral 14-day administration of dihydroquercetin in a water-soluble form (DHQ-WF) on the activity of the key marker of mitochondrial respiration [succinate dehydrogenase (SDH)] and the cytoplasmic marker of glycolysis [lactate dehydrogenase (LDH)] in blood lymphocytes, as well as on the serum level of lipid peroxidation (LPO) in control rats and rats with experimental cardiomyopathy.
Material and methods. Adult male Wistar rats (body weight 220-240 g) were used for the study. Isoprenaline hydrochloride was used to induce cardiomyopathy (IIC) in animals (twice subcutaneous injection at a dose of 150 mg/kg body weight, with a break of 24 hours). DHQ-WF was added to the drinking water for 14 days at the dose of 15 or 30 mg/kg body weight. SDH and LDH activity in lymphocytes was measured using a highly sensitive cytobiochemical method on a blood smear according to the reduction of nitrotetrazolium blue chloride to diformazan of dark blue color. The content of malone dialdehyde (MDA) in the blood serum, heart and liver mitochondria was determined spectrophotometrically using thiobarbituric acid. Mitochondria were isolated from rat tissues by the conventional method of differential centrifugation. Mitochondrial respiration was recorded using a polarographic method. Results. Experimental cardiomyopathy in rats was accompanied by a twofold increase in blood serum MDA level, as well as by a significant increase in SDH and LDH activity in blood lymphocytes. The oral administration of DHQ-WF in cardiomyopathy at a dose of 15 mg/kg body weight led to a significant decrease in serum MDA level, but did not reduce the activity of SDH and LDH in blood lymphocytes, compared with animals with cardiomyopathy that did not receive DHQ-WF. In the control group of animals, the use of DHQ-WF at a dose of 15 mg/kg body weight significantly increased blood lymphocyte LDH activity, but did not have a statistically significant effect on SDH activity and the parameters of mitochondrial respiration and oxidative phosphorylation, the level of MDA in heart and liver mitochondria. Increasing the dose of DHQ-WF administered to 30 mg/kg had less effect on changes in these parameters in control animals.
Conclusion. The data obtained indicate that in experimental cardiomyopathy in rats, the course application of DHQ-WF at a dose of 15 mg/kg of body weight acts as an effective antioxidant that prevents the development of lipid peroxidation in blood serum, and can modulate energy metabolism towards the enhancement of glycolysis in blood lymphocytes in control animals. Keywords: succinate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, lymphocytes, mitochondria, lipid peroxidation, water-soluble form of dihydroquercetin, isoprenaline-induced cardiomyopathy
В настоящее время установлено, что кардиомиопатии относятся к наиболее тяжелым патологиям миокарда, которые характеризуются резистентностью к проводимой терапии, а также высокой смертностью
вследствие нарастающей сердечной недостаточности и аритмии [1, 2]. Основные изменения при кардиомиопа-тиях связаны с развитием в миокарде окислительного стресса. Считается, что митохондриальная дисфункция
является одной из основных причин поражения миокарда при окислительном стрессе. Основными признаками нарушения функционирования митохондрий при кардиомиопатии считаются снижение активности комплексов дыхательной цепи и гиперпродукция активных форм кислорода [2]. Известно, что митохондрии являются основными источниками активных форм кислорода и при дисфункции этих органелл, как правило, применяют антиоксиданты, в частности дигидрокверцетин (ДГК) [3]. Недавние исследования показали, что ДГК в дозах 20 и 40 мг на 1 кг массы тела проявляет защитное действие у мышей с интоксикацией бензпиреном [4, 5]. В исследовании на беременных самках крыс репродуктивная токсичность фталатов купировалось при пероральном применении ДГК в дозах 10 и 20 мг на 1 кг массы тела [6]. ДГК препятствовал развитию окислительного стресса и диабетической катаракты у крыс с сахарным диабетом, вызванным стрептозотоцином, при пероральном введении в дозах 10, 25 и 50 мг на 1 кг массы тела в течение 60 дней.
Недавно в фармакологической практике было установлено, что ДГК в водорастворимой форме (ДГК-ВФ) оказывает антиоксидантное действие, превышающее таковое известных природных антиоксидантов, таких как витамин С, витамин Е и кверцетин [3, 7]. Данное вещество более активно по сравнению с обычно используемым ДГК, мало растворимым в воде, оно не накапливается в печени и после введения более длительно (до 7,5 ч) сохраняется в крови у крыс по сравнению с нерастворимой формой. После нескольких недель кормления старых мышей ДГК-ВФ наблюдалось восстановление активности митохондриальных ферментов до уровня активности, наблюдаемой у молодых животных [7].
Цитобиохимическое (ЦБХ) измерение в лимфоцитах крови активности ключевого фермента митохондрий сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и цитоплазматического маркера гликолиза лактатдегидрогеназы (ЛДГ), участвующей в распаде глюкозы до молочной кислоты в анаэробных условиях, отражает физиологическое состояние организма в норме и при патологиях [8-10]. Высокая чувствительность ЦБХ-метода достигается благодаря специальным условиям инкубации лимфоцитов, приближенным к внутриклеточным, что сохраняет натив-ную сетевую структуру митохондрий. При использовании ЦБХ-метода в экспериментальных и клинических исследованиях показана корреляция активности СДГ лимфоцитов крови с функциональным состоянием внутренних органов и тяжестью заболевания при миопатии и онкологических заболеваниях у людей и аутоиммунном артрите у крыс [11, 12].
В связи с вышесказанным изучение терапевтического потенциала ДГК-ВФ как эффективного природного ан-тиоксиданта при кардиомиопатиях, сопровождающихся окислительным стрессом, а также исследование механизмов его действия на функционирование митохондрий в клетках крови и миокарда является актуальным и представляет высокую практическую значимость.
Цель исследования - определить влияние перораль-ного 14-дневного введения ДГК-ВФ на активности ключевого маркера дыхания митохондрий СДГ и цитоплаз-матического маркера гликолиза ЛДГ в лимфоцитах крови, а также уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) в сыворотке крови крыс в норме и при экспериментальной кардиомиопатии.
Материал и методы
Содержание и рацион животных
В экспериментах использовали половозрелых крыс-самцов с массой тела 220-240 г аутбредной линии Ви-стар, содержащихся в стандартных условиях вивария ИТЭБ РАН. Животные получали сухой гранулированный комбикорм (ООО «Лабораторкорм», Россия) с содержанием белка 19%, жира - 5%, углеводов - 60%, клетчатки -4%, золы - 9%, кальция - 1,9%, фосфора - 1,1% (295 ккал в 100 г) с добавлением 2% очищенного пищевого, съедобного природного мела и 0,1% пророщенного зерна овса и имели свободный доступ к воде.
В качестве источника ДГК-ВФ была использована биологически активная добавка к пище «Таксифолин аква» (свидетельство о государственной регистрации № RU.77.99.11.003.E.003036.07.18, ООО «Продвинутые технологии», РФ) с содержанием ДГК 3 мг/мл. Животные, рассаженные в индивидуальные клетки, получали по 10 мл свежеприготовленной смеси биологически активной добавки к пище и питьевой воды из расчета 15 или 30 мг ДГК-ВФ на 1 кг массы тела ежедневно (в ночное время) в течение 14 дней.
Предварительные эксперименты были проведены на контрольных животных с целью выбора оптимальной дозы ДГК-ВФ. Для этого крысы были разделены на 3 группы (по 5 животных в каждой): 1) контроль (ин-тактные животные); 2) контроль + ДГК-ВФ, 15 мг - крыс ежедневно поили ДГК-ВФ в дозе 15 мг на 1 кг массы тела в течение 14 сут; 3) контроль + ДГК-ВФ, 30 мг - крыс ежедневно поили ДГК-ВФ в дозе 30 мг на 1 кг массы тела в течение 14 сут. Данные дозировки были выбраны с учетом более высокой (по сравнению с человеком) интенсивности метаболизма у крыс и соответствуют использованным в исследованиях, выполненных на сходных биологических моделях [4-6].
Исследования проводили в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных (Страсбург, 1986) и Хельсинкской Декларацией (2000), они были одобрены этической комиссией ИТЭБ РАН (протокол № 14/2020 от 17.02.2020).
Модель изопреналин-индуцированной кардиомиопатии у крыс
После проведения предварительных исследований на крысах контрольных групп в работе была воспроизведена модель кардиомиопатии у крыс с помощью гидрохлорида изопреналина (Sigma, США) [13]. Крысы были разделены на 4 группы (по 5 животных): 1) кон-
троль (интактные животные); 2) контроль + ДГК-ВФ -крыс ежедневно поили ДГК в дозе 15 мг на 1 кг массы тела в течение 14 сут; 3) изопреналин-индуцированная кардиомиопатия (ИЗК) - животным подкожно вводили изопреналин, растворенный в физиологическом растворе, в дозе 150 мг на 1 кг массы тела, двукратно с перерывом в 24 ч; 3) ИЗК + ДГК-ВФ - животные получали 2 инъекции изопреналина по указанной схеме и добавку ДГК-ВФ в составе питьевой воды в дозе 15 мг на 1 кг массы тела в течение 14 сут, начиная со дня первой инъекции изопреналина. Крыс умерщвляли методом краниоцервикальной дислокации на следующий день после окончания курсового приема ДГК-ВФ.
Цитобиохимическое определение активности сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в лимфоцитах на мазке крови
Суммарную оксигеназную активность митохондрий (СДГ) и гликолитическую в цитозоле (ЛДГ) в лимфоцитах периферической крови определяли разработанным нами ЦБХ-методом (патент № 2364868, Россия) по восстановлению нитросинего тетразолия гидрохлорида (НСТ) до темно-синего диформазана [8, 9]. Активность ферментов СДГ и ЛДГ определяли на разных мазках. Каждый мазок инкубировали в отдельной кювете с субстратом (янтарной или молочной кислотой). Для приготовления мазков использовали кровь без антикоагулянта, полученную при декапитации животных. Для стандартизации процесса приготовления мазков использовали автоматическое устройство V-Sampler (Vision, Германия). Полученные мазки крови подвергали фиксации ацетоном 60% (ос. ч., Химмед, Россия), за-буференным 10 мМ HEPES (Sigma, США) (рН 5,2-5,5), в течение 30 с при комнатной температуре, после чего ополаскивали бидистиллированной водой и высушивали. Именно благодаря мягкой фиксации меняется проницаемость мембраны иммобилизованных клеток, через которую проникают субстраты и НАД. Таким образом, цитохимические и гистохимические методы позволяют выявить физиологические изменения активности окислительно-восстановительных ферментов. Фиксированные мазки инкубировали в водяном термостате в течение 1 ч при температуре 37 °С и небольшом перемешивании в среде инкубации, содержащей 125 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 1,22 мМ НСТ (Dudley Chemteal Corporation, США), рН 7,2±0,05. Среда инкубации была дополнена 5 мМ молочной кислотой, 5 мМ малоновой кислотой (МАЛ) и 0,5 мМ НАД в случае определения активности ЛДГ или 5мМ янтарной кислотой для определения активности СДГ При ЦБХ-исследованиях показано уменьшение восстановления НСТ на эндогенных субстратах при добавлении избирательного ингибитора СДГ (МАЛ), поэтому в пробу для определения активности ЛДГ добавляли 5мМ МАЛ, чтобы устранить окисление микромолярных концентраций эндогенной янтарной кислоты. По окончании процесса стекла ополаскивали дистиллированной водой и высушивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Ядра клеток окрашивали 0,05%
раствором водного нейтрального красного в течение 8 мин, затем предметные стекла промывали в течение 5-10 с в дистиллированной воде. Высушенные на воздухе мазки подвергали микроскопическому анализу не позднее чем за 1 мес после получения.
Микроскопирование мазков после окрашивания проводили на микроскопе Leica-DM 2000 с цветной фотокамерой Leica DFC 425 (Leica, Германия) при увеличении 1000х под масляной иммерсией. Из каждого мазка набирали 100 лимфоцитов. Для поиска и захвата клеток использовали разработанную компьютерную программу «BloodRunner» (свидетельство RU № 2010616976, от 19.10.2010, Россия). Для количественного морфологического анализа цветных изображений была разработана специализированная компьютерная программа «Cell Composer» (свидетельство RU № 2012618186, от 10.10.2012, Россия). Таким образом, в соответствии с принципом работы программы, основанным на обсчете площадных характеристик клеток и их компартментов, вычисляли среднюю площадь окраски диформазана (в мкм2) в выборке из 100 лимфоцитов, анализируемых от каждого животного.
Определение малонового диальдегида в сыворотке крови и митохондриях сердца и печени
Концентрацию малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови крыс определяли с использованием диагностического набора реактивов (ООО «Агат-Мед», Россия). Для получения сыворотки пробирку с цельной кровью инкубировали при 37 °С в течение 1 ч, используя водяной термостат TW-2.02 (Elmi, Россия). Над-осадочную часть собирали в чистые микропробирки и центрифугировали с помощью центрифуги Eppendorff Minispin (Eppendorff, Германия) при 1500g в течение 10 мин. Полученную сыворотку переносили в пробирки и замораживали при -80 °С для дальнейшего анализа. Концентрацию МДА в митохондриях сердца и печени крыс определяли стандартным спектрофотометриче-ским методом по образованию окрашенного комплекса с тиобарбитуровой кислотой при 535 нм [14]. Анализ проводили, используя 1 и 3 мг митохондрий сердца и печени соответственно. Концентрацию МДА выражали в нмоль/мг митохондриального белка.
Измерение дыхания митохондрий из сердца крыс
Митохондрии выделяли из ткани сердца крыс общепринятым методом дифференциального центрифугирования. Концентрация белка в результирующей суспензии митохондрий сердца и печени крыс составляла 30-40 и 60-70 мг/мл соответственно. Дыхание митохондрий регистрировали с помощью респирометра Oxygraph-2K (Oroboros Instruments, Австрия) при 26 °C и постоянном перемешивании. Среда инкубации содержала 100 мМ KCl, 100 мМ маннита, 25 мМ сахарозы, 5 мМ KH2PO4, 0,5 мМ ЭГТА, 5 мМ глутамата калия, 5 мМ малата калия, 10 мМ Hepes/KOH (pH 7,4). Концентрация белка в кювете составляла 0,5 мг/см3. Скорость
А/А
Б/В
ь
0 15 30 ДГК-ВФ, мг/кг / DHQ-WF, mg/kg
ДГК
0 15 30 -ВФ, мг/кг / DHQ-WF, mg/kg
Рис. 1. Содержание малонового диальдегида (МДА) в митохондриях сердца (А) и печени (Б) крыс контрольной группы после курсового введения водной формы дигидрокверцетина per os в дозах 15 и 30 мг на 1 кг массы тела животного (M±m, n=5)
Fig. 1. The level of malone dialdehyde (MDA) in heart (A) and liver (B) mitochondria of control rats after a course of per os administration of water-soluble form of dihydroquercetin at the doses of 15 and 30 mg per kg body weight (M±m, n=5)
дыхания митохондрий определяли в трех метаболических состояниях: V3 - скорость фосфорилирующего окисления в присутствии 200 мкМ АДФ, V4 - скорость дыхания после фосфорилирования добавленного АДФ, VдНФ - скорость разобщенного дыхания в присутствии 50 мкМ 2,4-динитрофенола. Время фосфорилирования и коэффициент фосфорилирования АДФ/О рассчитывали в соответствии с ранее описанной методикой [15].
Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 4 и Excel 6.0 и представлены как среднее значение (M) ± стандартная ошибка среднего (m). Анализ на нормальность распределения данных проводили с помощью критерия Шапиро-Уилка. Поскольку полученные данные укладывались в нормальное распределение величин, статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа
(Т\«о^ау АЫОУА) по фактору «Дигидрокверцетин» и по фактору «Изопреналин». Для последующего сравнения средних дисперсионного комплекса использовали тест Ньюмана-Кеулса. Различия между средними значениями считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Применение некоторых антиоксидантов в высоких концентрациях может оказывать отрицательное влияние на функционирование клеток, в частности подавлять активацию внутриклеточных сигнальных путей, запускаемых активными формами кислорода [3]. В связи с этим в начале работы было исследовано влияние двух доз ДГК-ВФ на уровень МДА и показатели функционирования митохондрий сердца и печени контрольных животных. Для этого крысам контрольных групп перорально вводили ДГК-ВФ в составе питьевой воды в течение 14 сут в дозах 15 и 30 мг на 1 кг массы тела. Применение ДГК-ВФ в концентрации 15 мг/кг приводило к незначительному снижению содержания МДА, отражающего уровень ПОЛ, в митохондриях сердца (рис. 1А) и печени (рис. 1Б) крыс, однако это изменение не достигало уровня статистической значимости. Увеличение концентрации до 30 мг/кг не усиливало данный эффект у контрольных животных.
В следующей части работы исследовали влияние ДГК-ВФ на скорость дыхания и показатели эффективности окислительного фосфорилирования в митохондриях сердца крыс контрольной группы. Как видно из табл. 1, использование ДГК-ВФ в двух дозах не приводило к статистически значимым изменениям биоэнергетических параметров митохондрий сердца крыс, однако при использовании дозы 15 мг/кг наблюдалась тенденция к увеличению скорости дыхания митохондрий в фосфо-рилирующем состоянии (У3), а доза 30 мг/кг не усиливала этот эффект.
Результаты ЦБХ-исследования показали, что при применении ДГК-ВФ в дозе 15 мг/кг активность цитозольной ЛДГ повысилась на 36%, а повышение дозы ДГК-ВФ до 30 мг/кг отменяло этот эффект (табл. 2). В то же время
Таблица 1. Показатели энергетического обмена в изолированных митохондриях сердца крыс контрольной группы при 14-дневном введении водной формы дигидрокверцетина (ДГК-ВФ) per os (M±m, n=5)
Table 1. Indicators of energy metabolism in isolated mitochondria of the heart of rats of the control group after 14-day administration of the water-soluble form of dihydroquercetin (DHQ-WF) per os (M±m, n=5)
Показатель Indicator Доза ДГК-ВФ, мг на 1 кг массы тела The dose of DHQ-WF, mg/kg body weight
0 15 30
V3, нмоль O2 x мин-1 x мг белка-1 / V3, nmol O2xmin-1xmg protein''1 74,8±7,3 84,1 ±7,8 77,7±6,0
V4, нмоль O2 x мин-1 x мг белка-1 / V4, nmol O2 x min-1 x mg protein-1 13,1 ±1,7 14,3±0,7 13,7±0,8
VnH0, нмоль O2 x мин-1 x мг белка-1 / VDNF, nmol O2 x min-1 x mg protein-1 72,9 ±7,7 81,8±10,4 75,6±6,3
Время фосфорилирования, с / Phosphorylation time, sec. 64,0±5,7 55,0±7,7 59,0±6,9
Коэффициент АДФ/O / ADP/O coefficient 2,76±0,09 2,86±0,2 2,9±0,1
П р и м е ч а н и е. V3, V4, УдНФ - скорости дыхания митохондрий сердца крыс в разных функциональных состояниях. N o t e. V3, V4, VDNF, - respiratory rates of rat heart mitochondria in different functional states.
Таблица 2. Показатели оксигеназной активности митохондрий (сукцинатдегидрогеназы, СДГ) и гликолитической активности в цитозоле (лактатдегидрогеназы, ЛДГ) в лимфоцитах периферической крови, определенные цитобиохимическим методом на мазках, при 14-дневном введении водной формы дигидрокверцетина (ДГК-ВФ) per os у крыс контрольной группы (M±m, n=5)
Table 2. Indicators of mitochondrial oxygenase activity (succinate dehydrogenase, SDH) and cytosol glycolytic activity (lactate dehydrogenase, LDH) in peripheral blood lymphocytes after 14-day administration of the water-soluble form of dihydroquercetin (DHA-WF) per os in rats of the control group (M±m, n=5)
Показатель Indicator Доза ДГК-ВФ, мг на 1 кг массы тела / The dose of DHQ-WF, mg/kg of body weight
0 15 30
Активность СДГ, мкм2 / Activity of SDH, jm2 1,24±0,30 1,49±0,09 1,30±0,19
Активность ЛДГ, мкм2 / Activity of LDH, jm2 2,55±0,24 3,35±0,20* 3,01 ±0,70
П р и м е ч а н и е. * - статистически значимое (p<0,05) отличие от показателя контрольной группы в отсутствие ДГК-ВФ. N o t e. * - the differences are statistically significant (p<0.05) compared to the control group in the absence of DHA-AF.
статистически значимых изменений в активности СДГ в лимфоцитах крови контрольных животных при применении ДГК-ВФ в двух исследуемых дозах не обнаружено. Таким образом, ДГК-ВФ в дозе 15 мг/кг при 14-дневном приеме усиливала активность ключевого фермента гликолиза ЛДГ, но не влияла на активность фермента дыхательной цепи митохондрий СДГ в лимфоцитах крови у контрольных животных. Усиление гликолиза в лимфоцитах крови у крыс контрольной группы, вызванное действием ДГК-ВФ, соответствует данным литературы о том, что ДГК повышает адаптационную устойчивость клеток и усиливает процессы роста пролиферирующих клеток, в том числе лимфоцитов [16, 17].
В связи с тем, что повышение дозы не усиливало эффекты ДГК-ВФ на исследуемые параметры, в дальнейшем мы использовали ДГК-ВФ в более низкой дозе
(15 мг на 1 кг массы тела) на модели кардиомиопатии у крыс, сопровождающейся развитием окислительного стресса.
При кардиомиопатии активность СДГ и ЛДГ в лимфоцитах крови увеличивалась соответственно на 25 и 33% по сравнению с контролем (рис. 2А, Б). Выявленное повышение активности ЛДГ в лимфоцитах при кардио-миопатии согласуется с данными литературы о том, что сердечно-сосудистые патологии, включая кардиомио-патии, приводят к усилению гликолиза и накоплению лактата в крови животных [18-21]. В то же время применение ДГК-ВФ не оказывало влияния на повышенную активность цитозольной ЛДГ и митохондриальной СДГ в лимфоцитах крыс с кардиомиопатией (см. рис. 2А, Б).
В следующей части работы исследовали влияние ДГК-ВФ на окислительный обмен у крыс с экспери-
А/А
Б/B
В/С
ь rm адь for
2-1
1,5-
1-
0,5-
чд с
О СЧ
Œ CD Ср Me
it з
в ¡g
ds
ь m2 адь ifor2
"S
6п
4-
§1
2-
*, § fi
Контроль Контроль+ ИЗК ИЗК+
Control ДГК-ВФ IIC ДГК-ВФ Control+ IIC+ DHQ-WF DHQ-WF
Контроль Контроль+ Control ДГК-ВФ Control+ DHQ-WF
ИЗК IIC
ИЗК+ ДГК-ВФ
IIC+ DHQ-WF
Контроль Control
Контроль+ ИЗК ДГК-ВФ IIC Control+ DHQ-WF
*, §, #
ИЗК+ ДГК-ВФ
IIC+ DHQ-WF
4
§
*
0
0
0
Рис. 2. Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) (А) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (Б) в лимфоцитах на мазке, концентрация малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови (В) крыс после курсового введения водной формы дигидрокверцетина (ДГК-ВФ) per os в дозе 15 мг/кг в четырех экспериментальных группах: контроль, контроль + ДГК-ВФ, ИЗК, ИЗК + ДГК-ВФ (M±m, n=5)
Статистически значимое (p<0,05) отличие от показателя группы: * - контроль; § - контроль + ДГК-ВФ; # - ИЗК. ДФ - окраска диформазана.
Figure 2. Succinate dehydrogenase (SDH) (A) and lactate dehydrogenase (LDH) (B) activity in peripheral blood lymphocytes on a smear, and malone dialdehyde (MDA) serum level (C) in experimental rats after a course of per os administration of the water-soluble form of dihydroquercetin (DHQ-WF) at the dose of 15 mg per kg body weight in four experimental groups: control, control + DHQ-WF, IIC, IIC + DHQ-WF (M±m, n=5)
Statistically significant (p<0.05) difference from the group indicator: * - control; § - control + DHQ-WF; # - IIC.
ментальной кардиомиопатией. Концентрация конечного продукта окислительной деградации липидов МДА в сыворотке крови крыс при кардиомиопатии увеличивалась в 2 раза (рис. 2В). Курсовое применение ДГК-ВФ при кардиомиопатии приводило к статистически значимому снижению уровня МДА в сыворотке крови на 45%, что подтверждает мощное антиоксидантное действие ДГК-ВФ.
Заключение
Таким образом, развитие кардиомиопатии у крыс сопровождается значительным увеличением содержания МДА в сыворотке и митохондриях сердца, а также повышением активности СДГ и ЛДГ в лимфоцитах крови. Курсовое пероральное введение ДГК-ВФ в дозе 15 мг на
Сведения об авторах
1 кг массы тела крысам при кардиомиопатии приводит к снижению уровня МДА в сыворотке крови, но не влияет на повышенную активность СДГ и ЛДГ в лимфоцитах крови крыс. В контрольной группе животных ДГК-ВФ в дозе 15 мг на 1 кг массы тела увеличивает активность ЛДГ в лимфоцитах крови, а повышение дозы до 30 мг на 1 кг массы тела аннулирует этот эффект. Полученные данные указывают на то, что ДГК-ВФ действует как эффективный антиоксидант, препятствующий развитию ПОЛ в сыворотке крови крыс при кардиомиопатии, а также дополнительно может модулировать энергетический обмен в сторону усиления гликолиза в лимфоцитах крови у контрольных животных. В дальнейшем это может найти применение при разработке комплексных подходов к лечению кардиомиопатий и других сердечнососудистых патологий, сопровождающихся митохондри-альной дисфункцией и окислительным стрессом.
Хундерякова Наталья Васильевна (Natalia V. Khunderyakova) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник подразделения ИТЭБ РАН (Пущино, Московская область, Российская Федерация) E-mail: nkhunderyakova@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-4248-0279 Белослудцева Наталья Валерьевна (Natalia V. Belosludtseva) - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник подразделения ИТЭБ РАН (Пущино, Московская область, Российская Федерация) E-mail: nata.imagination@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-5707-6557
Хмиль Наталья Васильевна (Nataliya V. Khmil) - научный сотрудник подразделения ИТЭБ РАН (Пущино, Московская область, Российская Федерация) E-mail: Nat-niig@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-3335-9269
Мосенцов Алексей Андреевич (Aleksei A. Mosentsov) - младший научный сотрудник подразделения ИТЭБ РАН (Пу-щино, Московская область, Российская Федерация) E-mail: makcvel.95@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-3336-9659
Степанов Михаил Рубенович (Mikhail R. Stepanov) - сотрудник ООО «Продвинутые Технологии» (Москва, Российская Федерация)
E-mail: stepanson2008@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-1872-9487
Ананян Михаил Арсенович (Mikhail A. Ananyan) - генеральный директор ООО «Продвинутые Технологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: nanoindustry@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-1588-1475
Миронова Галина Дмитриевна (Galina D. Mironova) - доктор биологических наук, заведующая лабораторией подразделения ИТЭБ РАН, заслуженный деятель науки РФ (Пущино, Московская область, Российская Федерация) E-mail: mironova40@mai.ru https://orcid.org/0000-0001-7432-0902
Литература
1. Maron B.J., Ommen S.R., Semsarian C., Spirito P., Olivotto I., Maron M.S. Hypertrophic cardiomyopathy: present and future, with translation into contemporary cardiovascular medicine // J. Am. Coll. Cardiol. 2014. Vol. 64, N 1. P. 83-99. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jacc.2014.05.003
2. Леонтьева И.В., Николаева Е.А. Митохондриальные кардиомиопатии // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2016. Т. 61, № 3. С. 22-30. DOI: https://doi. org/10.21508/1027-4065-2016-61-3-22-30
3. Li J., Dong J., Ouyang J., Cui J., Chen Y., Wang F., Wang J. Synthesis, characterization, solubilization, cytotoxicity and anti-
oxidant activity of aminomethylated dihydroquercetin // Med. Chem. Commun. 2016. Vol. 8, N 2. P. 353-363. DOI: https://doi. org/10.1039/c6md00496b
4. Islam J., Shree A., Vafa A., Afzal S.M., Sultana S. Taxifolin ameliorates benzo[a]pyrene-induced lung injury possibly via stimulating the Nrf2 signalling pathway // Int. Immunopharmacol. 2021. Vol. 96. Article ID 107566. DOI: https://doi.org/10.1016Zi.intimp.2021.107566
5. Li Z., Yu Y., Li Y., Ma F., Fang Y., Ni C. et al. Taxifolin attenuates the developmental testicular toxicity induced by di-n-butyl phthal-ate in fetal male rats // Food Chem. Toxicol. 2020. Vol. 142. Article ID 111482. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2020.111482
6. Liu F., Ma Y., Xu Y. Taxifolin shows anticataractogenesis and attenuates diabetic retinopathy in STZ-diabetic rats via suppression of aldose reductase, oxidative stress, and MAPK signaling pathway // Endocr. Metab. Immune Disord. Drug Targets. 2020. Vol. 20, N 4. P. 599-608. DOI: https://doi.org/10.2174/1871530319666191018122 821
7. Зинченко В.П., Ким Ю.А., Таpаxовcкий Ю.С., Бpонников Г.Е. Биологическая активность водорастворимых наноструктур дегидрокверцетина с циклодекстринами // Биофизика. 2011. Т. 56, № 3. С. 433-438.
8. Кондрашова М.Н., Хундерякова Н.В., Захарченко М.В., Ячкула Т.В., Плясунова С.А., Сухоруков В.С. и др. Метод определения функционального состояния митохондрий в организме у человека по показателям активности ферментов и микроскопического вида лимфоцитов крови на мазке (Цитобиохимический метод) // Медицинский алфавит. Современная лаборатория. 2016. Т. 3, № 19. С. 83-85
9. Хундерякова Н.В., Захарова Н.М. Оценка активности сук-цинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в лимфоцитах крови у якутских сусликов Spermophilus undulatus при гибер-нации и в активном состоянии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2020. Т. 169, № 4. С. 426-430. DOI: https://doi.org/10.1007/s10517-020-04906
10. Frelikh G.A., Yanovskaya E.A., Polomeeva N.Yu., Timofeev M.S., Slepichev V.A., Bryushinina O.S. et al. Determination of mito-chondrial functional state in vital tissues by cytobiochemical analysis of peripheral blood lymphocytes // Open J. Endocr. Metab. Dis. 2013. Vol. 3, N 2. P. 10-13. DOI: https://doi.org/10.4236/ ojemd.2013.32A002
11. Khunderyakova N.V., Yachkula T.V., Zakharchenko M.V., Plyasu-nova S.A., Sukhorukov V.S., Baranich N.I. et al. Cytobiochemical biomarkers of the state of mitochondria in humans // J. World Mitochondria Soc. 2017. Vol. 2. N 2. P. 118. DOI: https://doi. org/10.18143/JWMS_v2i2_1930
12. Скупневский С.В., Пухаева Е.Г., Бадтиев А.К., Руруа Ф.К., Батагова Ф.Э., Фарниева Ж.Г. Функциональные особенности лимфоцитов периферической крови в динамике аутоиммунного артрита у крыс // Международный журнал при-
кладных и фундаментальных исследований. 2019. № 12. С. 82-87.
13. Siddiqui M.A., Ahmad U., Khan A.A., Ahmad A., Badruddeen A., Khalid M. et al. Isoprenaline: a tool for inducing myocardial infarction in experimental animals // Int. J. Pharm. 2016. Vol. 6, N 2. P. 138-144.
14. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction // Anal. Biochem. 1979. Vol. 95, N 2. P. 351-358. DOI: https://doi.org/10.1016/0003-2697(79)90738-3
15. Venediktova N.I., Gorbacheva O.S., Belosludtseva N.V., Fedo-tova I.B., Surina N.M., Poletaeva I.I. et al. Energetic, oxidative and ionic exchange in rat brain and liver mitochondria at experimental audiogenic epilepsy (Krushinsky-Molodkina model) // J. Bioenerg. Biomembr. 2017. Vol. 49. P. 149-158. DOI: https://doi. org/10.1007/s10863-016-9693-5
16. Ward P.S., Thompson C.B. Metabolic reprogramming: a cancer hallmark even warburg did not anticipate // Cancer Cell. 2012. Vol. 21. P. 297-308. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccr.2012.02.014
17. Pavlova N.N., Thompson C.B. The emerging hallmarks of cancer metabolism // Cell Metab. 2016. Vol. 23. P. 27-47. DOI: https://doi. org/10.1016/j.cmet.2015.12.00
18. Kolwicz S.C. Jr, Tian R. Glucose metabolism and cardiac hypertrophy // Cardiovasc. Res. 2011. Vol. 90, N 2. P. 194-201. DOI: https://doi.org/10.1093/cvr/cvr071
19. Drent M., Cobben N.A., Henderson R.F., Wouters E.F., van Dieijen-Visser M. Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation // Eur. Respir. J. 1996. Vol. 9, N 8. P. 1736-1742. DOI: https://doi.org/10. 1183/09031936.96.09081736
20. Luengo A., Li Z., Gui Dan Y., Spranger S., Matheson N.J., Vander Heiden M.G. Increased demand for NAD+ relative to ATP drives aerobic glycolysis // Mol. Cell. 2021. Vol. 81. P. 691-707. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.12.012
21. Аметов А.С., Кониева М.Ю., Лукьянова И.В. Сердечнососудистая система при тиреотоксикозе // Consilium Medi-cum. 2003. Т. 5, № 11. С. 660-663.
References
Maron B.J., Ommen S.R., Semsarian C., Spirito P., Olivotto I., Maron M.S. Hypertrophic cardiomyopathy: present and future, with translation into contemporary cardiovascular medicine. J Am Coll Cardiol. 2014; 64 (1): 83-99. DOI: https://doi.org/10.1016/j. jacc.2014.05.003
Leonty'eva I.V., Nikolaeva E.A. Mitochondrial cardiomyopathies. Rossiyskiy vestnik perinatologii i pediatrii [Russian Bulletin of Perinatology and Pediatrics]. 2016; 61 (3): 22-30. DOI: https://doi. org/10.21508/1027-4065-2016-61-3-22-30 (in Russian) Li J., Dong J., Ouyang J., Cui J., Chen Y., Wang F., Wang J. Synthesis, characterization, solubilization, cytotoxicity and antioxidant activity of aminomethylated dihydroquercetin. Med Chem Commun. 2016; 8 (2): 353-63. DOI: https://doi.org/10.1039/ c6md00496b
Islam J., Shree A., Vafa A., Afzal S.M., Sultana S. Taxifolin ameliorates benzo[a]pyrene-induced lung injury possibly via stimulating the Nrf2 signalling pathway. Int Immunopharmacol. 2021; 96: 107566. DOI: https://doi.org/10.1016/j.intimp.2021.107566 Li Z., Yu Y., Li Y., Ma F., Fang Y., Ni C., et al. Taxifolin attenuates the developmental testicular toxicity induced by di-n-butyl phthal-ate in fetal male rats. Food Chem Toxicol. 2020; 142: 111482. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2020.111482
Liu F., Ma Y., Xu Y. Taxifolin shows anticataractogenesis and attenuates diabetic retinopathy in STZ-diabetic rats via suppression of aldose reductase, oxidative stress, and MAPK signaling pathway. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 2020; 20 (4): 599-608. DOI: https://doi.org/10.2174/18715303196661910181 22 821
10.
11.
Zinchenko V.P., Kim Yu.A., Tarakhovsky Yu.S., Bronnikov G.E. Biological activity of water-soluble nanostructures of dehydroquer-cetin with cyclodextrins. Biofizika [Biophysics]. 2011; 56 (3): 433—8. (in Russian)
Kondrashova M.N., Khunderyakova N.V., Zakharchenko M.V., Yachkula T.V., Plyasunova S.A., Sukhorukov V.S., et al. Method for determining the functional state of mitochondria in the human body by indicators of enzyme activity and microscopic appearance of blood lymphocytes on a smear (Cytobiochemical method). Meditsinskiy alfavit. Sovremennaya laboratoriya [Medical Alphabet. Modern Laboratory]. 2016; 3 (19): 83-5. (in Russian) Khunderyakova N.V., Zakharova N.M. Evaluation of succinate dehydrogenase and lactate dehydrogenase activity in blood lymphocytes in Yakut ground squirrels Spermophilus undulatus during hibernation and in an active state. Byulleten' eksperimental'noi biologii i meditsiny [Bulletin of Experimental Biology and Medicine]. 2020; 169 (4): 426-30. DOI: https://doi.org/10.1007/s10517-020-04906 (in Russian)
Frelikh G.A., Yanovskaya E.A., Polomeeva N.Yu., Timofeev M.S., Slepichev V.A., Bryushinina O.S., et al. Determination of mito-chondrial functional state in vital tissues by cytobiochemical analysis of peripheral blood lymphocytes. Open J Endocr Metab Dis. 2013; 3 (2): 10-3. DOI: https://doi.org/10.4236/ojemd.2013.32A002 Khunderyakova N.V., Yachkula T.V., Zakharchenko M.V., Plyasunova S.A., Sukhorukov V.S., Baranich N.I., et al. Cytobiochemical biomarkers of the state of mitochondria in humans. J World Mitochondria Soc. 2017; 2 (2): 118. DOI: https://doi.org/10.18143/ JWMS v2i2 1930
1.
7.
8
2
9
4
6.
12. Skupnevsky S.V., Pukhaeva E.G., Badtiev A.K., Rurua F.K., Batagova F.E., Farnieva Zh.G. Functional features of peripheral blood lymphocytes in the dynamics of autoimmune arthritis in rats. Mezhdunarodniy zhurnal prikladnykh i fundamental'nykh issledovaniy [International Journal of Applied and Fundamental Research]. 2019; (12): 82-7. (in Russian)
13. Siddiqui M.A., Ahmad U., Khan A.A., Ahmad A., Badruddeen A., Khalid M., et al. Isoprenaline: a tool for inducing myocardial infarction in experimental animals. Int J Pharm. 2016; 6 (2): 138-44.
14. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem. 1979; 95 (2): 351-8. DOI: https://doi.org/10.1016/0003-2697(79) 90738-3
15. Venediktova N.I., Gorbacheva O.S., Belosludtseva N.V., Fedoto-va I.B., Surina N.M., Poletaeva I.I., et al. Energetic, oxidative and ionic exchange in rat brain and liver mitochondria at experimental audiogenic epilepsy (Krushinsky-Molodkina model). J Bioenerg Biomembr. 2017; 49: 149-58. DOI: https://doi.org/10.1007/s10863-016-9693-5
16. Ward P.S., Thompson C.B. Metabolic reprogramming: a cancer hallmark even warburg did not anticipate. Cancer Cell. 2012; 21: 297-308. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccr.2012.02.014
17. Pavlova N.N., Thompson C.B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metab. 2016; 23: 27-47. DOI: https://doi. org/10.1016/j.cmet.2015.12.00
18. Kolwicz S.C. Jr, Tian R. Glucose metabolism and cardiac hypertrophy. Cardiovasc Res. 2011; 90 (2): 194-201. DOI: https://doi. org/10.1093/cvr/cvr071
19. Drent M., Cobben N.A., Henderson R.F., Wouters E.F., van Dieijen-Visser M. Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation. Eur Respir J. 1996; 9 (8): 1736-42. DOI: https://doi.org/10.1183/09031936.96.09081736
20. Luengo A., Li Z., Gui Dan Y., Spranger S., Matheson N.J., Vander Heiden M.G. Increased demand for NAD+ relative to ATP drives aerobic glycolysis. Mol Cell. 2021; 81: 691-707. DOI: https://doi. org/10.1016/j.molcel.2020.12.012
21. Ametov A.S., Konieva M.Yu., Luk'yanova I.V. Cardiovascular system in thyrotoxicosis. Consilium Medicum [Consilium Medicum]. 2003; 5 (11): 660-3. (in Russian)
