CC BY
46
БИОЛОГИЯ
УДК 57.088
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ОБВОДНЕНИЯ, pH И МОДУЛЯТОРОВ ПРОТЕОГЛИКАНОВ НА МОРФОЛОГИЮ ФИБРИЛЛ И СУБВОЛОКОН КОЛЛАГЕНА
© 2007 г. Ю.Ю. Гущина 1, Р.А. Плохое 2, А.В. Зевеке 2
1 НОЦ «Физика твердотельных наноструктур» ННГУ им. Н.И. Лобачевского 2 Нижегородская государственная медицинская академия
уе81шк nngu@mail.ru
Поступила в редакцию 22.12.2006
Приведены результаты исследования морфологии коллагеновых фибрилл при обводнении (Н20, Б20, 0,9% №С1, фосфатно-солевой, фосфатно-цитратный и карбонатно-бикардонатный буфера). Установлено что pH среды не меняет Б-период нативных фибрилл коллагена. Проведено исследование отдельных субволокон из разных частей коллагеновых нитей. Установлено, что субволокна при смачивании совершают вращательное движение вокруг своей оси. Отклик наблюдается только в момент смачивания нити или при дегидратации субволокон. Проведено исследование влияния обводнения на геометрические параметры отдельных фрагментов коллагеновых фибрилл - длина фрагментов при гидратации уменьшается на 10-25%. Это говорит о том, что обводнение фибрилл приводит к перестройкам молекул тропоколлагена. При исследовании влияния модуляторов протеогликановой компоненты коллагена в 0,5% р-ре аминазина Б-период фибрилл уменьшался до 50 нм, что доказывает участие протеогликановой компоненты коллагена в формировании неизменной Б-периодичности его фибрилл.
Введение
Коллаген - самый распространенный фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани животных. Его специфические структурные функции состоят в поддержании формы клеток, тканей и органов. Стабильность и целостность межклеточного матрикса обеспечивается более чем 20 вариантами специализированного коллагена, которые формируют фибриллы и другие ансамбли [1, 2]. Нативные фибриллы коллагена имеют поперечную исчерченность, называемую О-периодичностью. Исследователи считают, что исчерченность с периодом в 67 нм является характерной для нативных фибрилл, составляющих основу соединительных тканей, фасций и сухожилий [3, 4].
Строение фибрилл коллагена исследуют большим числом методов: электронная
микроскопия [5], рентгено-структурный анализ [6, 7], ядерно-магнитный резонанс [8],
сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) [9,
10, 11]. Определенный этими методами период исчерченности фибрилл составляет 67 нм. А при изменениях гидратной оболочки фибрилл
возможно изменение их морфологии. В то же время, абсолютное большинство экспериментов с коллагеном, проведенных
вышеперечисленными методами,
предусматривали полное предварительное высушивание образцов. В настоящее время определяющей тенденцией является
исследование фибрилл и пучков коллагена в жидких средах, что является более
физиологичным, чем исследование
высушенных препаратов на воздухе. Его изучение позволяет понять закономерности
воспалительных процессов и возрастных изменений внутренних органов, костной и хрящевой ткани. Это делает коллаген главным действующим лицом в концепции ремоделирования соеденительнотканых
структур различных органов [12, 13].
Таким образом, целью представленной
работы являлось выявление изменения
морфологических особенностей фибрилл, их фрагментов и субволокон нативного коллагена при гидратации, влияние рН среды на период исчерченности молекул. А также выяснение роли протеогликанового компонента в формировании Б-периодичности коллагена.
Для решения поставленной проблемы был протеогликанов, связанных с белками
использован метод сканирующей зондовой межклеточного матрикса и клеточными
микроскопии, который позволяет исследовать мембранами.
Т-» 1 ^ л. л. 0 0,06 0,12 0,
Рис. 1. Топография и профиль поверх ’ ’ В151апсе ’
Изображение получено методом СЗМ в контактном режиме сканирования
.X[mkm) Pointl: С.090
Point2: 0.033
Di!r: -0.057
0,24 0,3 mkm
ой воде.
поверхность биологических объектов с высокой степенью разрешения, как на воздухе, так и в жидких средах.
Методика эксперимента
Для исследования морфологических особенностей фибрилл на наноуровне препараты коллагена получали из сухожилий хвоста лабораторных крыс или приготавливали из нерастворимого коллагена I типа (Sigma) на покровных стеклах. Для получения фрагментов коллагеновых фибрилл использовалась
коллагеназа (Sigma). Для исследования коллагена на макро-уровне отдельные субволокна брались из различных частей коллагеных нитей, получаемых из сухожилий хвоста лабораторных крыс.
В качестве веществ - модуляторов
протеогликановой компоненты коллагена были выбраны гепарин и аминазин. Гепарин -высокосульфатированный гликозаминогликан, чрезвычайно эффективный
комплексообразователь, модулирующий
свойства широкого спектра биологических макромолекул. Есть данные о существовании в составе коллагеновых молекул сайтов специфического высокоаффинного связывания гепарина. Аминазин обладает широким спектром свойств - это блокатор адрено- и
дофаминовых рецепторов, ингибитор
кальмодулина, протеинкиназы С, синтеза NO, клатрин-опосредованного эндоцитоза. Показано комплексообразование аминазина с рядом белков - миоглобином, гемоглобином, белками молока. При этом конформация белков изменяется. Аминазин связывает гепарин с образованием осадка, взаимодействует с гликозаминогликановыми компонентами
Исследования топографии поверхности проводилось методом СЗМ на комплексе Solver Bio (NT MDT, Россия). Высушенные препараты исследовали в неконтактном режиме сканирования, использовались кремниевые зонды жесткостью 5 N/m, радиус закругления кончика зонда составлял 10 nm. Обводненные фибриллы исследовались в контактном режиме зондами из нитрида кремния жесткостью 0,01 N/m и радиусом закругления порядка 20 nm.
Результаты и обсуждение
1. Проведенные ранее исследования показали, что при обводнении (H2O) изменяется D-периодичность фибрилл [14] и она составляет 54-57 нм. В данной работе было исследовано более 50 фибрилл и установлено, что pH среды и ее ионный состав не оказывают влияния на морфологию нативных коллагеновых фибрилл - период исчерчености в различных буферах (ФСБ (рН 7,4), ФЦБ (рН 5,2) и КББ (рН 9,6), р-ре Хенкса и дейтериевой воде также составлял 5457 нм (рис. 1).
Это позволяет констатировать
исключительную стабильность значения D-периода исчерченности фибрилл несмотря на отличия между водой и оксидом дейтерия в значениях электростатических констант.
Предполагается, что при обводнении происходит перестройка взаимной ориентации тропоколлагена внутри фибрилл. Возможно, что основной вклад в реорганизацию фибрилл, происходящую при помещении коллагена в жидкость, вносят не столько
электростатические, сколько гидрофобные силы и Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия.
2. Проведено исследование влияния обводнения на геометрические параметры
0
116 Ю.Ю. Гущина, Р.А. Плохов, А.В. Зевеке
13.84 ткт 488.20 пт
I
0.00 пг
Б. 92 ткт
13,84 шкш 8,20 пт
0 ткт
13.88 ткт 650.99 пт
I
0.00 пт
У
6.94 ткт 13.88 ткт
О ткт 6.92 ткт 13.84 ткт 0 ткт
а б
о,оо пт 692ткш ражение коллагеновых фибрилл на покрі о,ооткт жле на воздухе (а) и в №01 (б). Изображение полу чено методом СЗМ в контактном режиме сканирования
отдельных фрагментов коллагеновых фибрилл. Для этого одни и те же фрагменты исследовались на воздухе и затем в жидкой фазе. Брались фрагменты с длиной от 2 до 10 мкм. ] 0шкш 3 опытах исследовано 23 фрагмента
1 /- 0 шкш > /ГчТТ 6,92 шкш 13,84 шкш
фибрилл, и: 3 в ФЦ , ФСБ, и
13 в Н20. Проведение исследований в водной фазе в карбонатно-бикарбонатном буфере оказалось невозможным, так как не наблюдалось адгезии молекул коллагена к покровным стеклам. Во всех случаях наблюдалось уменьшение длины фрагментов на 10-25 %, увеличение высоты и ширины (рис. 2). В ходе экспериментов было подсчитано изменение объемов фибрилл - объемы обводненных фрагментов во всех случаях были больше на 50-60%.
Увеличение высоты и ширины можно объяснить насыщением фибриллы в водной среде. Достоверно определить значение высоты и ширины сложно вследствие контактных деформаций мягких обводненных фибрилл при сканировании их в контактном режиме в водной среде, т.к. величина контактных деформаций не рассчитывалась. Также исследование фибрилл
Ь, мш I
Рис. 3. Вращение коллагенового субволокна при помещении его в увлажняющую камеру
проводилось в разных режимах сканирования: на воздухе в неконтакном режиме, в жидкой среде в контактном. Геометрия зондов в этих случаях была разная и уширение исследуемых объектов разное.
3. Установлено, что отдельные субволокна из коллагеновых нитей при смачивании совершают вращательное движение вокруг своей оси, разные нити вращаются с несколько разной интенсивностью и предпочитают одно какое-то направление - либо по часовой стрелке, либо против. Замечены также и не реагирующие волокна. Такой отклик наблюдается только в момент смачивания нити (рис. 3), причем полностью насыщенная водой нить, а равно и абсолютно высушенная, не способны к вращательным движениям, при дегидратации также происходит вращение.
4. В ходе проведенных исследований установлено, что свойства поверхности фибрилл нативного коллагена I типа под влиянием водного раствора гепарина (концентрация 500 МЕ/мл) не изменялись. Значение периода исчерченности составило 5456 нм (по 8 опытам). Это подтверждает высокую стабильность свойств коллагеновых фибрилл. С другой стороны, хорошо известно свойство гепарина стабилизировать свойства биополимеров, с которыми гепарин образует комплекс.
В наших экспериментах (исследовано 15 фибрилл) воздействие аминазином (0,5% в физиологическом растворе) на нативный коллаген сопровождалось уменьшением периода исчерченности до 50-51 нм (рис. 4), что, при сопоставлении с доказательствами высокой стабильности значений Б-периодичности нерастворимого коллагена при
4.3 пт
3.225
>.15
1.075
/ “\
X(mkm)
Pointl: 0.185
Poin(2: 0.235
Dilf: 0.050
0.0S 0.16 0.24 0.32 0.4 ткгп
[iGlm
Рис. 4. Изображение и профиль поверхнос агеновой фибриллы на покровном стекле в физиологическом
растворе с аминазином. Изображение полу 3,225 тодом СЗМ в контактном режиме сканирования
т о на Это вая ь в сти
прочих видах воздействии свидетел существенном влиянии данного ве] организацию коллагеновых фибр показывает, что протеог 1,075
компонента коллагена может учавс формировании неизменной Б-перио его фибрилл.
Заключение 0
1. Установлено что при обводнении изменяется Б-периодичность фибрилл. Период исчерченности в жидкости составляет 54-56 нм, причем это значение не зависит от электростатической константы жидкости, ее pH и ионного состава, что подтверждает мнение о высокой стабильности нативного коллагена. Предполагается, что при обводнении происходит перестройка взаимной ориентации тропоколлагена внутри фибрилл. Возможно, что основной вклад в реорганизацию фибрилл, происходящую при гидратации, вносят не столько электростатические, сколько гидрофобные силы и Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия.
2. Исследование влияния обводнения на длину отдельных фрагментов коллагеновых фибрилл показало уменьшение длины фрагментов при обводнении на 10-25 % во всех опытах, что также может объясняется изменением ориентации тропоколлагена.
3. Установлено, что отдельные субволокна из коллагеновых нитей при смачивании совершают вращательное движение вокруг своей оси. Коллагеновая нить существенно гетерогенна в плане проявления свойств
вращения при изменении увлажнения: отдельные субволокна, выделенные из нити, вращаются по часовой стрелке, другие против, и обязательно есть субпопуляция невращающихся волокон.
4. Показана возможность участия в формировании неизменной Б-периодичности
0,08 0,16 0,24 0,32 0,4 ткт ТликановоГО
Б1$1алсе
Работа поддержана грантом REC-NN-001 Американского фонда гражданских исследований и развития для независимых государств бывшего Советского Союза (CRDF) и Министерства образования Российской Федерации и программы Рособразования «Развитие научного потенциала высшей школы», код 4600, минигрантом CRDF REC-NN-001- BG430.
Список литературы
1. Kadler K.E., Holmes D.F., Trotter J.A., Chapman J.A. Collagen fibril formation // Biochem. J. 1996b. 316, 1-11.
2. Myllyharju J., Kivirikko K.I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, Xies and worms. Trends Genet. 2004, 20, 33-43.
3. Mine-Yine Liu, Ming-Long Yeh and Zong-Ping Luo. In vitro regulation of single collagen fibril length by buffer compositions and temperature. Bio-Medical Materials and Engineering 15 (2005) 413-420.
4. Cisneros D.A., Hung C., Franz C.M., Muller D.J. Observing growth steps of collagen self-assembly by time-lapse high-resolution atomic force microscopy // Journal of Structural Biology 154 (2006) 232-245.
5. Hulmes D.J., Jesior J.C., Miller A., Berthet-Colominas et al. Electron microscopy shows periodic structure in collagen fibril cross sections // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981.78, 3567-3571.
6. Bear R.S. X-study of the large fibre axis period of collagen // J. Am. Chem. Soc. 1944. 66, 1297-1301.
4.3 nm
7. Hulmes D.J., Miller A. Molecular packing in collagen // Nature.1981. 293, 234-239.
8. Hulmes D.J., Wess T.J., Prockop D.J., Fratzl P. Radial packing, order, and disorder in collagen fibrils // Biophysical Journal. Vol. 68, (1995). 1661-1670.
9. Venturoni M., Gutsmann T., Fantner G.E., Kindt J.H. et al. Hansma. Investigations into the polymorphism of rat tail tendon fibrils using Atomic Force Microscopy // Biochemical and Biophysical Research Communications, 303, 2003. P. 508-513.
10. Revenko I., Sommer F., Minh D.T., Garrone R. et al. Atomic force microscopy study of the collagen fibre structure. Biol. Cell .1994.80, 67-69.
11. Gale M., Pollanen M.S., Markiewicz P., Goh M.C. Sequential assembly of collagen revealed by atomic force icroscopy // Biophys. J. 1995 68, 2124-2128.
12. Tamariz E., Grinnell F. Modulation of Fibroblast Morphology and Adhesion during Collagen Matrix Remodeling. Molecular Biology of the Cell, Vol. 13, 3915-3929, November 2002.
13. Grinnell F., Ho C.-H., Tamariz E., Lee D.J., influence on the collagen structure by AFM. Pys. Low-Skuta G. Dendritic. Fibroblasts in Three-dimensional Dim. Struct. 1/2 (2004). P. 71-75.
Collagen. Matrices. Molecular Biology of the Cell, Vol.
14, 384-395, February 2003.
14. Zeveke A.V., Plohov J.R.A., Gushina Yu.,
Ashutov A.N. The investigation of water regime
STUDY OF THE EFFECTS OF HYDRATION, pH, AND PROTEOGLYCAN MODULATORS ON THE MORPHOLOGY OF COLLAGEN FIBRILS AND SUBFIBERS
Yu. Yu. Gushchina, R.A. Plokhov, A. V. Zeveke
We present the results of studying the collagen fibril morphology in the case of hydration (H2O, D2O, 0.9% NaCl, phosphate-saline, phosphate-citrate, and carbonate-bicarbonate buffers). It is found that the pH of the medium does not change the D-period of the native collagen fibrils. Individual subfibers from different parts of collagen filaments are studied. It is found that the subfibers rotate around their axes upon wetting. The response is observed only at the moment of wetting of a filament or upon dehydration of subfibers. The effect of hydration on the geometric parameters of collagen fibrils is analyzed. The fragment lengths decrease by 10-25% upon hydration. This implies that the fibril hydration results in restructuring of the tropocollagen molecules. Analysis of the effect of modulators of the collagen proteoglycan component in the 0.5% aminazin solution showed that the D-period of fibrils decreased to 50 nm. This proves that the proteoglycan component of the collagen participates in the formation of the constant D-periodicity of its fibrils.
