CC BY
76
© КАРАЧЁВА Ю.В., ПРОХОРЕНКОВ В.И., ГАЙДАШ А.А., НОВИКОВ А.И., БАБЕНКО О.А., ЧИГОДАЙКИН Г.П.
УДК 616.52-091
УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОЖИ ПРИ БУЛЛЕЗНЫХ
ДЕРМАТОЗАХ (СООБЩЕНИЕ 1)
Ю.В. Карачёва, В.И. Прохоренков, А. А. Гайдаш, А.И. Новиков, О.А.
Бабенко, Г.П. Чигодайкин Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.
Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов;
Омская государственная медицинская академия, ректор - д.м.н., проф.
А.И. Новиков
Резюме. Методами электронной и атомно-силовой микроскопии изучено состояние клеток Лангерганса и коллаген-вода-протеогликанового интерфейса у больных акантолитической пузырчаткой.
Состояние клеток Лангерганса свидетельствует об их активной роли в морфогенезе данного заболевания. Выявлено увеличение толщины и гипергидротации протеогликонового слоя, формирование крупнодисперсных молекулярных агрегатов. Описаны феномены его слоистости и формирования каналов.
Ключевые слова: акантолитическая пузырчатка, электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия.
Карачёва Юлия Викторовна - к.м.н., доцент кафедры кожных и венерических болезней с курсом последипломного образования (ПО) КрасГМУ, e-mail: venera@krsk.info, тел. 8 (391) 2114101.
Прохоренков Виктор Иванович - д.м.н., проф., заведующий кафедрой кожных и венерических болезней с курсом последипломного образования (ПО) КрасГМУ, e-mail: venera@krsk.info, тел. 8 (391) 2114101.
Гайдаш Александр Александрович - д.м.н., старший научный сотрудник научного исследовательского сектора ЦНИЛ КрасГМУ, e-mail: jack200@ngs.ru, тел. 8 (391) 2201914.
Группа буллезных дерматозов весьма разнообразна как по клинической картине, так и по своей этиологической и патогенетической сущности. Пузырь как первичный морфологический элемент сыпи, в соответствии с классификацией Б. А. Беренбейна [1], встречается при акантолитической и неакантолитической пузырчатках. Расположение пузырей может иметь герпетиформный характер, например, при герпетиформном дерматите Дюринга и близких к нему дерматозах. Пузыри образуются при инфекционных и токсико-аллергических процессах таких как: буллезное стрептококковое и стафилококковое импетиго, синдром Лайелла, синдром обожженной кожи, многоформная экссудативная эритема, фотодерматозах (кожные формы порфириновой болезни, пеллагра и др.), психических, нервно-сосудистых и опухолевых процессах [1, 6]. При этом пузырь может быть основным, постоянным, клинико-морфологическим симптомом таких дерматозов, как, например, истинная (акантолитическая) пузырчатка, пемфигоид и герпетиформный дерматит. При других заболеваниях кожи пузыри являются непостоянным или необязательным клиническим симптомом (токсикодермии, многоформная экссудативпая эритема, дерматиты, паранеоплазии, меланобластоз Блоха-Сульцбергера). Кроме того, пузыри могут являться непостоянным морфологическим признаком при красном плоском лишае, склеродермии, острой красной волчанке, мастоцитозе дискератозе Дарье и других дерматозах, как известно, не являющихся пузырными в истинном значении этого определения [1]. Цель работы: изучение ультраструктурных изменений в эпидермисе и коллаген-протеогликанового комплекса основного вещества дермы для выявления специфических особенностей морфогенеза при акантолитической пузырчатке.
Материалы и методы
Электронно-микроскопические исследования кожи были проведены у 41 больного буллезными дерматозами. Из них у 19 больных диагностирована акантолитическая пузырчатка (мужчин было 5, женщин - 14, средний возраст больных - 56,4±6,2 лет): у больных был диагностирован гернетиформный дерматоз Дюринга (мужчин было 7, женщин - 9, средний возраст больных составил 32,8±8,4 лет). У детей был зарегистрирован врожденный буллезный эпидермиолиз (детей мужского пола было 2, женского- 4, средний возраст составил 6.4±3,1 лет). Контрольную группу составили 6 здоровых лиц, в возрасте от 31 до 49 лет. У всех больных отмечен дебют заболевания. Морфологические исследования проводили в период до применения специфическй терапии.
Образцы для электронной микроскопии погружали в охлажденный до 4С° 1,5% раствор глутаральдегида, приготовленный на буфере РВБ, и фиксировали в 1% осмиевой кислоте. Тканевые блоки заключали в аралдит. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме LKB-8800, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата, докрашивали цитратом свинца. Электронно-микроскопические исследования оценивали на микроскопе JEM-1008. Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах с применением стрептавидин-биотинового метода («БАКО», Дания, LSAB2 Sуstems, HRP). В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела СРРЗ, CD1a+, Ki67 («БАКО», Дания). Биотинилированные антитела второго слоя и стрептавидин, меченный пероксидазой, вводили в систему визуализации «LSAB2 Sуstems, HRP» («БАКО», Дания). В качестве хромогена использовался 3,3-диаминобензидинатетрахлорид, входящий в коммерческий набор детекции. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера в течение 2 мин.
Для изучения структурных характеристик системы коллаген- протеогликаны использовали колебательную ИК-спектроскопию комбинационного рассеяния. Электронная микроскопия выполнена методом сканирующей зондовой микроскопии на аппарате Philips-515, (диаметр пучка 10 нм, ускоряющее
напряжение 15 кв). Атомно-силовая микроскопия поверхности основного вещества дермы производилась с применением зондовой нанолаборатории ШТЕОКА с использованием кремниевых зондов серии N8011 (КТ-МБТ)
Результаты и обсуждение Как свидетельствуют результаты электронно-микроскопических исследований изменения в коже при акантолитичесакой пузырчатке (АП) складываются из следующих главных компонентов: отек и расширение межклеточного пространства, лизис тонофиламентов и десмосом, регрессии эухроматина и фибриллярной трансформации ядрышек кератиноцитов. Указанные изменения создают анатомические предпосылки для полного высвобождения кератиноцитов от межклеточных контактов с формированием так называемых акантолитических клеток. Уже на этой стадии формируется характерный феномен «разведения шестерен», описанный О. Бгаип-Еа1со [1], когда вследствие прогрессирующего отека кератиноциты расходятся, тонофиламенты натягиваются, подрываются, десмосомы расслаиваются и морфологическая картина приобретает вид шестерен с дефектными и расцепленными зубьями. Сохранившиеся тонофиламенты, расположенные в цитоплазме, собираются полукругом вблизи ядра. В зоне расширений отмечается не только уменьшение количества десмосом, истончение и разрушение тонофибрилл, но залегает детрит, состоящий из электронорыхлых и неоднородных частиц. По мере развертывания патологического процесса деструирующий отек полностью окружает, подвергшийся атаке кератиноцит, и частичное расцепление тонофибрилл превращается в более характерный для хронического состояния феномен «зубчатого колеса». Базальная мембрана практически на всем протяжении сохраняет трехслойное строение. Базальные кератиноциты прикреплены к мембране посредством полудесмосом, численная плотность которых находится в пределах нормы. Однако имеются очаги, на территории которых они полностью отсутствуют. Интересным морфологическим обстоятельством являются линейные расширения контактов между базальными кератиноцитами, освободившееся пространство между
которыми заполнено отечной жидкостью, детритом, либо
цитоплазматическими выростами дендритных клеток (клеток Лангерганса). Это сильно деформирует места контакта эпидермиса с дермой, придает этим участкам ветвистый вид за счет множественных и довольно широких цитоплазматических выростов дендритных клеток, простирающихся глубоко в дерму. В матриксе базальной мембраны появляются очаги разрыхления. В местах повышенной миграционной активности дендритных клеток очаги разрыхления трансформируются в сквозные дефекты, «пломбированные» цитоплазматической мембраной прилежащего дендроцита (рис. 1). Помимо очагов разрыхления мембранного матрикса обнаруживаются и простые дефекты базальной мембраны, представленные простыми, как правило, сквозными отверстиями диаметром до 100 нм. На месте наиболее крупных дефектов образуются патологические наносоустья между межклеточным пространством эпидермиса и интерстицием дермы.
Дендритные клетки явно пребывают в состоянии повышенной функциональной активности. Морфологически это проявляется, прежде всего, в виде гиперплазии отростков, что нередко наблюдается в местах начального акантолиза. Здесь на фоне сохранившихся структур аппарата межклеточных контактов располагаются ветвящиеся цитоплазматические выросты дендроцитов. Электронно-микроскопически они представлены фрагментами цитоплазмы, практически лишенных органелл. Тонкая структура гиалоплазмы в этих отростках идентична таковой в цитоплазме клеток Лангерганса. Межщелевые цитоплазматические выросты не вступают в плотные контакты с кератиноцитами, а как бы свободно залегают между тонофибриллами в межклеточном пространстве. Проникновение цитоплазматических отростков в межклеточные щели нередко осложняется их деструкцией и лизисом. Многие кератиноциты окружены подобным тандемом, состоящим наполовину из тонофиламентов и цитоплазматических выростов дендритных клеток. Возможно, что это является одной из начальных стадий акантолиза, вызванного в данном случае повышенной активностью
антигенпрезентирующих клеток Лангерганса. Подтверждением этому является выраженная гиперплазия гранул Бирбека в клетках Лангерганса. Гранулы располагаются не только в ядросодержащих участках цитоплазмы, но и в их многочисленных выростах. При этом клетки Лангерганса залегают как бы в собственном интерстициальном ложе, куда не проникают тонофиламенты, но в пределах, которого цитоплазматические выросты формируют простые, слегка интердигитирующие контакты с моноцитами. Электронно-микроскопически клетки Лангерганса легко узнаваемы: они имеют эксцентрично расположенное лапчатое ядро с множественными глубокими инвагинатами и хорошо диспергированным эухроматином, в цитоплазме 1-2 лизосомы, содержащие электронплотное вещество, от крупного тела отходят широкие и довольно длинные отростки. В цитоплазме активных клеток выявляются хорошо развитый гранулярный эндоплазматический ретикулум и четко оформленный аппарат Г ольджи, расположенный чаще в подъядерных участках. С кератиноцитами клетки Лангерганса контактируют посредством простых контактов. Нередко цитоплазматические мембраны сближаются до 3-5 нм, что является минимально возможным расстоянием для этой формы межклеточных взаимодействий. Края клеток фестончатые за счет множественных инвагинаций и узких микроворсинок. Фундаментальной структурной особенностью клеток Лангерганса является, конечно же, присутствие гранул Бирбека и характерных маргинальных цитоплазматических выростов. В норме гранулы Бирбека представлены преимущественно так называемыми «барабанными палочками» и единичными «теннисными ракетками». Барабанные палочки представляют собой вытянутые структуры размером от 25 до 50 нм с аксиально расположенной тубулой, от которой частоколом отходят поперечно расположенные стерженьки. Окончания «палочек» слегка расширены. Количество этих структур колеблется в пределах 2-3 на одну клетку в стандартизированном ультратонком срезе толщиной 65-70 нм. При акантолитической пузырчатке количество гранул увеличивается до 5-7 и они приобретают чаще вид теннисных ракеток, пропорциональная численность
которых доминирует над «барабанными» формами. Морфологически «теннисные ракетки» сходны с «барабанными палочками», но у которых значительно расширен один из концов (при использовании просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения с увеличением до 200 000 в «рукоятках» ракеток встречаются аксиальные тубулы с характерным поперечным частоколом стерженьков). В норме размеры ракеток не превышают 75 нм и они располагаются преимущественно одиночно в периферических участках цитоплазмы. При акантолитической пузырчатке «ракетки» подвергаются выраженной гипертрофии достигая в своих размерах 150-200 нм и склонны к группированию с образованием кластеров, состоящих из 2-3 структур. Отдельные «ракетки» располагаются в непосредственной близости друг от друга, приобретая «целующийся» вид (рис. 2). Возможно,
«целующийся» феномен обусловлен их разделением. Значительная часть отростчатых клеток проявляет признаки высвобождения от межклеточных контактов путем сжатия и упрощения поверхности цитоплазмы. Такие клетки приобретают сферическую форму, но в отличие от моноцитов они имеют характерное лапчатое ядро. Подобная трансформация, возможно, свидетельствует о подготовке клеток к миграции.
Следует сказать, что данные о количестве и активности отростчатых клеток при пузырчатке сильно расходятся [2, 4, 5, 7]. В данной работе клетки Лангерганса интересовали нас с точки зрения их участия в процессах акантолиза и формирования пузырей. На ранних стадиях формирования пузырьки как бы случайно разбросаны по эпидермису, а кератиноциты несмотря на отдаленность находятся в одной фазе акантолиза. Дендритные клетки с фенотипом CD1a+ довольно четко выявляются при акантолитической пузырчатке как по периферии, так и в дерме микрощелей [4]. При этом относительный объем этих клеток достигает 7-8%, что практически совпадает с относительным объемом очагов расширения межклеточных пространств в эпидермисе. Вблизи каждого припузырного кератиноцита находятся отростки дендроцитов, в которых, как вышеописано, концентрируются гранулы Бирбека.
Но так происходит только в дебюте пузырчатки. В более позднем периоде, а точнее в периоде затяжного течения заболевания специфические гранулы в дендритных клетках практически не выявляются [2]. Активность гранул Бирбека так или иначе связана с антигепрезентирующей функцией дендритных клеток. С учетом того, что это наблюдается только в дебюте, можно предположить, что начало заболевания, обусловлено первичным антиген-зависимым коммитированием клеток Лангерганса, которые усиливают патогенность реакции антиген-антитело, возможно, за счёт экспрессии HLA-DR антигенов на своей поверхности с последующим каскадным разрушением межклеточных контактов. В такой ситуации события, по-видимому, развиваются по механизму реакции немедленного типа, но только в зонах контактного взаимодействия клеток Лангерганса и кератиноцитов. Отсюда и мозаичность вовлечения кератиноцитов в акантолитический процесс.
При исследовании методом атомно-силовой микроскопии основного вещества здоровой кожи видны неизмененные коллагеновые волокна с четко просматриваемой Д-периодичностью [3]. Размер периодов (доменов) колебался в пределах 61-66 нм в среднем составляя 62 нм, что согласуется с данными рентгенструктурного анализа. Наружная поверхность коллагеновых фибрилл в области главных участков выпуклая с хорошо выраженными скатами, направленных в стороны узких участков. Домены коллагеновых волокон выступали над поверхностью в виде ступенек высотой до 50±2,8 нм. Ступенчатость поверхности была обусловлена поперечным сдвигом в расположении нитей тропоколлагенов относительно короткой оси фибрилл. Средние значения показателей адгезионных сил в области главных участков D-периодов колебались в пределах 45-82 нН (в среднем 62,5±4,2 нН). Показатель адгезионных сил в интерстициальных пространствах межклеточного матрикса, образованных расщелинами между коллагеновыми волокнами колебался в пределах 90-110 нН (в среднем 100,2±8,6 нН). Это означает, что в интерстициальных щелях межклеточного матрикса находилась достаточно вязкая жидкость.
Важной структурной особенностью по данным атомно-силовой микроскопии основного вещества в здоровой коже является наличие пор [3]. Размеры пор колебались в пределах от 25 нм до 100-250 нм (в среднем 175,2±10,3 нм). Характерной морфологической особенностью пор является отсутствие структурированной стенки. Фактически поры представлены глубокими дырчатыми дефектами. Края дефектов по физическим свойствам и, в частности, по степени плотности основного вещества существенно отличаются от остального протяжения интерстициального пространства. На это указывает падение значений показателей адгезионных сил в краях нанопоровых образований (28,8±1,4 нН) и в области дна 33,3±1,2| нН (р<0,05). Такое соотношение показателей адгезионных сил свидетельствуют о том, что стенка пор образована менее смачиваемой поверхностью (возможно, за счет большей полимеризации протеогликанов), а дно пор, которое в анатомическом отношении является интерстицием, образовано рыхлой фазой основного вещества с подвижными молекулярными связями [3].
На рисунках 3-6 представлены AFM-сканы образцов кожи взятых по периферии области пузыря с дебютной акантолитической пузырчаткой. При акантолитической пузырчатке наблюдалась массовая деструкция коллагеновых волокон, а также изменялись их морфометрические и адгезионные свойства. Разрушение коллагеновых волокон происходило по механизму упорядоченной дезинтеграции доменов по линии, так называемых, узких участков фибрилл. Коллагеновые волокна распадались на фрагменты, состоящие из 2-3 доменовых останков. Поперечного распада коллагеновых волокон с расщеплением на нитчатые фрагменты протоколлагенов нами не было обнаружено. Распавшиеся коллагеновые волокна являлись источником частиц детрита размерами 50-75 нм. Некоторые из них агрегировались в крупные зерна диаметром от до 8001000 нм. Численная плотность интерстициального детрита могла достигать 50 частиц на 1 мкм поверхности образца. При этом количество частиц наноразмерного диапазона преобладало над количеством частиц мезо- и микроразмерных параметров, что свидетельствовало о трансформации геля
основного вещества в мелкодисперсный золь. В сохранившихся коллагеновых волокнах регистрировалось разнонаправленное изменение морфометрических показателей. В частности существенно уменьшался продольный размер D-периодов до 42,2±1,5 нм (p<0,05) (в контроле 64,1±2,2 нм), а толщина, наоборот, увеличивалась до 185,2±8,9 нм (p<0,01) (в контроле 92,5±6,8 нм). Укорочение и одновременное утолщение доменов свидетельствует о сжатии коллагеновых фибрилл преимущественно в продольном направлении. Морфологически такие коллагеновые волокна имеют как бы сплюснутый вид. По данным локальной силовой спектроскопии, установлено резкое падение показателей адгезионных сил коллагеновых волокон до 6,1±1,5 нН (p<0,01) (в контроле 68,2±1,7 нН). Снижение сил адгезии свидетельствует о том, что в пористых структурах коллагеновых волокон содержится меньшее количество воды в сравнении с нормой.
Учитывая указанные обстоятельства, мы полагаем, что одним из ключевых механизмом разрушения коллагеновых волокон при акантолитической пузырчатке является их продольное сжатие. При этом из узких участков коллагеновых волокон, которые более рыхлые за счет меньшей концентрации нитей тропоколллагена, может высвобождаться свободная вода. Уходящая из коллагеновых фибрилл свободная вода накапливается в основном веществе. На это указывает увеличение значений показателей адгезионных сил основного вещества до 30,5±3,1 нН (p<0,01) (в контроле - 15,0±1,5 нН), что
свидетельствует о выраженной гидратации межклеточного вещества. При акантолитической пузырчатке основное вещество кожи становится слоистым (рис. 4). При этом толщина, отдельных слоев варьирует в пределах 100-500 нм, но местами достигает 1000-1500 нм. Отечная жидкость заполняет расширенные интерстициальные щели. Указанные структурные особенности свидетельствуют о трансформации протеогликанового геля в крупнодисперсный золь, что в свою очередь способствует его канализации. Морфологически это довольно эффектный феномен, который более четко визуализируется в режиме фазового контраста. На представленных AFM-сканах
(рис.3-6) видно, что стенки каналов состоят из более плотной фазы. Диаметр каналов колеблется от 25 до 550 нм и некоторые из них размещены непосредственно вблизи коллагеновых фибрилл. При пузырчатке в стадии пузыря слой протеогликанов проявляет неоднородность, обусловленную не только зернистостью, но и пористостью за счет множественных дырчатых дефектов. Последние, в отличие от структурированных наноканалов, имеют вязкие стенки.
Таким образом, клетки Лангерганса по-видимому, играют более важную и активную роль в развитии акантолиза, чем ранее предполагалось. Возможно в дальнейшем медикаментозное или физическое воздействия на функцию клеток Лангерганса у больных пузырчаткой [8], что теоретически не исключается, и даст возможность искать альтернативные пути терапии дерматоза.
Принципиально важным является оценка состояния коллаген-протеогликанового комплекса при пузырчатке. И в этом отношении весьма эффективен метод атомно-силовой микроскопии, по данным которого межклеточный матрикс кожи на периферии пузыря, характеризуется увеличением толщины и гипергидратацией протеогликанового слоя, его озолением с формированием крупнодисперсных молекулярных агрегатов, а также структурированием в виде слоистости и формирования каналов.
ULTRA STRUCTURAL SKIN CHANGES IN BULLOUS DERMATOSES
(MESSAGE 1)
Yu.V. KARACHEVA, V.I. PROKHORENKOV, A.A. GAIDASH, A.I. NOVIKOV,
O.A. BABENKO, G.P. CHIGODAYKIN
Krasnoyarsk State Medical University named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky;
Omsk Statе Medical Academy.
Abstract. We studied condition of Langerhans cells and collagen water proteoglycan interface by electron and atomic-force microscopy in patients with pemphigus acantholytic. The status of Langerhans cells indicates their active role in the disease morphogenesis. We revealed increased thickness and hyper hydration of
proteoglycan layer, large dispersed molecular aggregates formation. The phenomena of lamination and channel formation are described.
Key words: pemphigus acantholytic, electron microscopy, atomic-force microscopy
Литература
1. Беренбейн Б.А. Дифференциальная диагностика кожных болезней. руководство для врачей. - М.: Медицина, 19S9. - С. 21S-271.
2. Буллёзные дерматозы (вопросы клинико-морфологической диагностики и морфогенеза по данным электронной и атомно-силовой микроскопии) / под ред. В.И. Прохоренкова, А.А Гайдаша, Л.Н Синицы. -Красноярск: ООО ИПЦ «КАСС», 200S. - 1SS с.
3. Гайдаш А.А, Прохоренков В.И., Новиков А.И. и др. Коллаген-протеогликановый комплекс кожи при акантолитической пузырчатке по данным атомно-силовой микроскопии и ИК-спектроскопии / Вестн. дерматол. и венерол. - 2009. - № 2. - С. 4-12.
4. Карачёва Ю.В., Прохоренков В.И., Гайдаш А.А. и др. Pоль клеток Лангерганса в патогенезе пузырчатки / Вестн. дерматол. и венерол. -200S. - № 4. - С. S-14.
5. Карачёва Ю.В., Гайдаш А.А., Новиков А.И., и др. Ультраструктурные и иммуногистохимические изменения кожи у больных герпетиформным дерматитом Дюринга / Pос. журн. кожных и венерических болезней. - 2009. - № 3. - С. 62-65.
6. Лыкова С. Г. Морфогенез, клинические особенности и аспекты дифференциальной диагностики истинной акантолитической пузырчатки.
- Новосибирск, 1996. - 93 с.
7. Nestor M. S., Cochran A. J., Ahmed A. R. Mononuclear cell infiltrates in bullous disease // J. Invest. Dermatol. - 19S7. - Vol. SS, №2. - P. 172-175.
S. Thivolet J. Pemphigus: past, present and future // Dermatology. - 1994.
- Vol. 1S9,№ 2. - P. 26-29.
Рис.1. Трансмиссионная электронная микроскопия кожи при акантолической пузырчатке. Демонстрируется контакт отростчатой клетки с базальной мембраной. Увеличение 20 000.
Рис.2. Трансмиссионная электронная микроскопия кожи при акантолитической пузырчатке. Демонстрируется гиперплазия гранулы Бирбека в клетке Лангерганса, «целующиеся теннисные ракетки».
Увеличение 2О ООО.
9-й
Рис. 3. Атомно-силовая микроскопия кожи при акантолитической пузырчатке. Размер скана 2000 нм. Очаг лизиса коллагеновых фибрилл.
Рис. 4. Атомно-силовая микроскопия кожи при акантолитической пузырчатке. Размер скана 2000 нм. Слоистый канал в протеогликановом слое.
Рис. 5. Атомно-силовая микроскопия кожи при акантолитической пузырчатке. Размер скана 1500 нм. Хорошо структурированные стенки наноканалов в слое протеогликанов.
Рис. 6. Атомно-силовая микроскопия кожи при акантолитической пузырчатке. Размер скана 2000 нм. Парафибриллярный дефект.
