CC BY
142016, т. 6, №2
УДК 612.12-074:547.022.1
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ФУЛЛЕРЕНСОДЕРЖАЩИХ НАНОКОМПОЗИТОВ НА СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ IN VITRO
О. Г. Ситникова1, С. Б. Назаров1, О. В. Алексеева2, М. М. Клычева1, Н. А. Багровская2
1Лаборатория клинической биохимии и генетики
ФГБУ «Ивановский НИИ материнства и детства имени В. Н. Городкова» Минздрава России
Адрес переписки: Иваново, ул. Победы, 20.
2Лаборатория «Химия гибридныхнаноматериалов и супрамолекулярнихсистем»
2Учреждение Российской академии наук Институт химии растворов имени Г. А. Крестова РАН
Адрес переписки: г. Иваново, ул. Академическая, 1.
E-mail: [email protected]
РЕЗЮМЕ
Исследовано влияние фуллеренсодержащих нанокомпозитов на основе полиметилметакрилата на свободнорадикальное окисление липидов в сыворотке крови in vitro методом хемилюминесценции. В эксперименте была использована сыворотка крови и образцы нанокомпозитных пленок. Установлено, что композиты с концентрацией фуллерена 0,1, 0,5, и 1 % проявляли способность к усилению свободнорадикального окисления in vitro, при - 3 % установлен антирадикальный эффект.
RESEARCH OF THE INFLUENCE OF FULLERENELIKE NANOCOMPOSITES ON FREE
RADICAL PROCESSES IN VITRO
O. G. Sitnikova, S. B Nazarov, O. B Alekseeva, M. M. Klycheva, N. A. Bagrovsky
SUMMARY
There was investigated the influence of fullerenelike nanocomposites on the basis of polymethyl methacry-late on the free radical oxidation of lipids in blood serum by in vitro chemiluminescence method. Blood serum and membrane samples were used during the experiment. It was established that composites with concentration of a fullerene 0,1, 0,5, and 1 % had showed the ability to strengthening of free radical oxidation in vitro, there was established the anti-radical effect at - 3 %.
Ключевые слова: хемилюминесценция, свободнорадикальное окисление
Одной из актуальных проблем клинической биохимии является исследование свободнорадикального окисления липидов (СРО), продукты которого оказывают повреждающее действие на мембраны клеток. Доказано, что активация эндогенных механизмов генерации АФК, накопление свободных радикалов, гидроперекисей липидов и других прооксидантов приводит к нарушению механизмов антиокси-дантной защиты и развитию окислительного стресса, который играет значительную роль в патогенезе ряда заболеваний [1, 2]. Для нормализации свободнорадикальных процессов липидов используют лекарственные препараты с антиоксидантным действием. Защитное действие антиоксидантов заключается в их способности поглощать свободные радикалы, что позволяет поддерживать биохимические процессы в организме человека на должном уровне.
В настоящее время проводится поиск новых соединений, оказывающих специфическое действие на определенные звенья свободноради-кального окисления. Особое внимание исследователей привлекают композиты полимеров с фуллеренами в связи с перспективами их широ-
фуллеренсодержащие нанокомпозиты,
кого практического применения в биологии и медицине. Так, получены данные о выраженном противовоспалительном эффекте различных фуллереновых комплексов и целесообразности их местного применения при раневом (воспалительном) процессе [3]. Известно, что фулле-рены являются активными акцепторами радикалов и могут быть использованы в качестве ловушек для активных форм кислорода [4].
В связи с этим, одной из задач научных изысканий является разработка теоретических основ создания новых модифицированных на-ноуглеродными частицами биологически активных полимерных материалов (трубок, сосудов, пластин). Среди полимеров, способных связывать наноуглеродные частицы, следует отметить полистирол и полиметилметакрилат (ПММА), которые находят применение в медицине и биотехнологии. Ранее нами выявлено влияние концентрации фуллерена в композите полистирол/фуллерен на процессы перекисно-го окисления липидов в «сливной» сыворотки крови in vitro. Установлено, что нанокомпозиты с концентрацией фуллерена 0,03 и 0,1 % мас. способны оказывать влияние на усиление
процессов пероксидации липидов и активировать антиоксидантную систему. В то время как композиты с концентрацией фуллерена 1,0 % мас. в этих условиях проявляли исключительно антиоксидантные свойства [5, 6]. Можно ожидать, что фуллеренсодержащие композиты на основе ПММА могут влияние на свободнора-дикальное окисление и обладать антиоксидант-ными свойствами. Однако влияние ПММА и на основе его композитов на свободнорадикаль-ное окисление и антиоксидантную активность в сыворотке крови in vitro не исследовалось.
Целью настоящей работы явилось исследование влияния фуллеренсодержащих нанокомпозитов на основе полиметилме-такрилата на свободнорадикальное окисление липидов в сыворотке крови in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В качестве полимерных матриц для формирования фуллеренсодержащих композиций из растворов был выбран полиметилме-такрилат (фирма Sigma-Aldrich, USA) с молекулярной массой 1,2x105. Фуллерены (С60) (продукт фирмы «Фуллереновые технологии», Санкт-Петербург) предварительно очищали по методу Виноградова Л.В. и др. (1997) [7], для удаления других форм, содержащих большее число атомов углерода и имеющих более высокую реакционную способность.
Растворы фуллеренов в толуоле готовили путем взвешивания навески фуллерена С60 на аналитических весах, которую затем переносили в колбу с толуолом, определенное количество которого также взвешивали на аналитических весах.
В полученные растворы помещали навески полимера. Затем образовавшиеся смеси перемешивали на магнитной мешалке в течение суток, пленочные композиты получали методом полива растворов полимеров с фуллереном на стеклянные подложки и высушивали при 25-28 °С до полного удаления растворителя, что контролировали постоянством массы высушенно-
го образца. Сформированные композиционные пленки ПММА имели толщину 60-80 мкм, которую определяли микрометром. Концентрация фуллеренов варьировали от 0,01 до 3,0 % мас.
В эксперименте была использована «сливная» сыворотка крови от 10 пациенток, поступивших в акушерскую или гинекологическую клиники ФГБУ «Ив. НИИ М и Д им. В. Н. Городкова» Минздрава России. В пробирки, содержащие 1 мл «сливной» сыворотки крови, помещали образцы исходной или композиционной пленок размером 1,5 см2 и массой 5 мг с определенной концентрацией фуллерена от 0,01 до 3,0 % мас. [8]. Затем пробирки инкубировали при 4 °С с целью снижения влияния микробиологических факторов в течение 1 часа. Контролем служила «сливная» сыворотка крови без композита. Определение концентрации свободных радикалов и антиоксидантную активность в исследуемых образцах проводили методом индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) на приборе «БХЛ-07» (фирма «Медозон», Нижний Новгород, Россия). В качестве индукторов ХЛ использовали пероксид водорода (Н2О2) в виде препарата «Гидроперит» и сульфат железа II (Бе804) - «Sigma-Aldrich» (США).
Метод индуцирования ХЛ перекисью водорода с сульфатом железа основан на каталитическом разложении перекиси ионами металлов с переменной валентностью. Образующиеся при этом свободные радикалы выступают инициаторами свободнорадикального окисления (СРО). В результате реакции рекомбинации перекисных радикалов, образуются молекулярные продукты и выделяются кванты света, которые и определяют наблюдаемую хемилюминесценцию. Процесс СРО вызывает вспышку интенсивности ХЛ, которая в течение 30-60 секунд затухает в результате действия системы антиоксидантов, присутствующих в пробе. Типичная кинетика такого хеми-люминесцентного сигнала приведена на рис. 1.
Рис. 1 Типичная кинетика хемилюминесценции сыворотки крови. Зарегистрированные параметры: интенсивность пика (1тах), светосумма ^ (1 за 40 сек)), тангенс угла наклона кинетической
кривой ^а).
2016, т. 6, №2
Для регистрации ХЛ в измерительную кювету биохемилюминометра вносили 0,1 мл сыворотки крови, 0,4 мл фосфатного буфера рН 7,5, 0,4 мл раствора сульфата железа (0,05 мМ), 0,2 мл 2 % раствора пероксида водорода. Кювету помещали в измерительную камеру прибора и регистрировали ХЛ в течение 40 секунд. Для оценки кинетической кривой ХЛ использовались параметры, которые отражают потенциальную способность биологического объекта к интенсивности свободнорадикальных реакций: Imax (мВ) значение максимальной интенсивности за время опыта; S (мВхсек) - свето-сумма свечения. Антиоксидантный потенциал оценивали по параметру хемилюминесценции - тангенсу угла - tga (мВ/сек) - максимального наклона кривой к оси времени, характеризующий максимальную величину спада кривой.
Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы Statistica 6,0 (Stat soft) for Windows. Учитывая характер распределения, отличный от нормального, описание представлено в виде медианы - середины распределения изучаемого признака и интерквартильного интер-
Рис. 2. Влияние модифицированных пленок с различной концентрацией фуллерена на Imax; * - различия достоверны по сравнению с ПММА (р < 0,05).
вала (ME [Q25; Q75]). Сравнение средних величин в группах проводили с использованием критерия Wilcoxona. Статистически значимыми считали различия при р<0,05 [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты интерпретировали по изменению относительных величин медиан параметров же-лезоиндуцированной ХЛ «сливной» сыворотки крови по отношению к показателям сыворотки крови, проинкубированной с ПММА и компо-
зиционными пленками на его основе с различным содержанием фуллерена. На основании этого было показано, что исходные пленки ПММА на параметры хемилюминесценции «сливной» сыворотки крови достоверного влияния не оказывали. Сравнение относительных величин изменения медиан величин I max модифицированных пленок с концентрацией наночастиц фуллерена (0,1 %, 0,5 %, 1 % мас.) в контакте со «сливной» сывороткой крови (рис. 2) выявило повышение этого показателя I max (р=0,0093), а при воздействии композита с концентрацией фуллерена 3 % мас. отмечено снижение величины быстрой вспышки I max (р=0,0051).
Аналогичные изменения установлены в изменении относительных величин медиан светосуммы свечения S (рис. 3).
Рис. 3. Влияние модифицированных пленок с различной концентрацией фуллерена на S; * -различия достоверны по сравнению с ПММА
(р < 0,05).
Полученные данные свидетельствуют об увеличении концентрации свободных радикалов и активных форм кислорода при контакте сывороткой крови нанокомпози-тов фуллерен-ПММА с концентрацией фуллерена 0,1, 0,5 и 1 % мас. и о подавлении хе-милюминесценции при воздействии композита с концентрацией фуллерена 3 % мас.
По-нашему мнению, прооксидантный эффект нанокомпозитов на его основе связан с образованием активных центров фуллерен-ПММА с достаточной концентрацией фуллерена для инициирования окислительные радикальные процессы в исследуемых пробах. Данное предположение подтверждается рядом авторов, проводивших исследования масс-спектрометрическим анализом, который показал, что введение фуллерена
приводит к изменению термических, оптических и механических свойств полимерных композитов на основе полиметил-метакрилата, что связано с образованием ковалентной связи ПММА-фуллерен [10].
Изменение относительных величин медиан tg2, отражающий антиоксидантный потенциал проб (рис. 4) показало, что этот показатель у композитов с концентрацией фуллерена 0,1, 0,5 и 1 % мас. достоверно не изменялся и составил (р=0,5408; р=0,7518; р=0,1730 соответственно), в то время как tgа концентрацией фуллерена 3 % мас. достоверно снижался. Мы считаем, что повышение концентрации фуллерена до 3 % мас. в композите оказывается достаточной для проявления антиоксидантного эффекта.
Рис. 4. Влияние модифицированных пленок с различной концентрацией фуллерена на tga; * - различия достоверны по сравнению с ПММА (р < 0,05).
Таким образом, in vitro показано, что фуллеренсодержащие нанокомпозиты на основе ПММА с концентрацией фуллерена 0,1, 0,5 и 1 % мас. обладают способностью повышать концентрацию свободных радикалов в сыворотке крови, но не оказывали антиоксидантный эффект, а модифицированные пленки концентрацией фуллерена 3 % мас. гасили химилюминесцентный сигнал.
ВЫВОДЫ
1. Фуллеренсодержащие нанокомпозиты на основе полиметилметакрилата с концентрацией фуллерена 0,1 %, 0,5 %, 1 % мас. способствовали усилению свободнорадикального окисления липидов в сыворотке крови in vitro.
2. Установлен антирадикальный эффект фуллеренсодержащих нанокомпо-зитов на основе полиметилметакрила-та с концентрацией фуллерена 3 % мас.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пристром А.М., Бенхамед М. Оксидативный стресс и сердечно-сосудистые заболевания. Лечебное дело. 2012; 1:21-28.
2. Zabtocka A., Janusz M. The two faces of reactive oxygen species. Postery Hig. Med. Dosw. http://www. phmd.pl/pub/phmd/vol_62/11558.pdf (Online). 2008; 62:118-124.
3. Венгерович Н.П, Тюнин М.А., Антоненкова Е.В. и др. Биологическая активность нанобиокомпозитов фуллерена С60. www.medline.ru Иммунология. 2011; 12:161-177.
4. Полетаева Д.А. Мембранотропные свойства водорастворимых производных фуллеренов: Автореф. Дис... канд. Биол. Наук. Москва, 2012; 26.
5. Алексеева О.В., Багровская Н.А., Ситникова О.П. и др. Исследование оптических свойств и анти-оксидантной активности фуллеренсодержащих поли-стирольных композитов. Изв. вузов. Технология легкой промышленности. 2012; 17:3:35-39.
6. Alekseeva O.V., Sitnikova O.G., Bagrovskaya N.A., Noskov A.V., Zaikov G.E., Emelina O.Yu. Polystyrene/fullerene composites as antioxidative agents //Вестник Казанского технологического университета. 2014; 17:16:151-155.
7. Виноградова JI.B., Меленевская Е.Ю., Кевер Е.Е., Шибаев Л.А., Антонова Т.А., Згонник В.Н. Синтез фуллеренсодержащих полиэтиленоксидов. Высокомо-лек. соед. А. 1997; 39:11:1733-1739.
8. Алексеева О.В., Багровская Н.А., Ситникова О.П. и др. Исследование антиоксидантной активности нанокомпозитов на основе полистирола in vitro. Жидкие кристаллы и их практическое использование. 2011; 3: 90-96.
9. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2002; 312.
10. Пинзбург Б.М., Табаров С.Х., Туйчиев Ш. и др. Влияние добавок фуллерена C60 на структуру и механические свойства тонких пленок из органического стекла. Письма в ЖТФ. 2007; 33:23:43-49.
REFERENCES
1. Pristrom А.М., Benkhamed M. Oxidative stress and cardiovascular diseases. Lechebnoye delo. 2012; 1:21-28. (In Russian).
2. Zabtocka A., Janusz M. The two faces of reactive oxygen species. Postery Hig. Med. Dosw. http://www. phmd.pl/pub/phmd/vol_62/11558.pdf (Online). 2008; 62:118-124. (In Russian).
3. Vengerovich N.G., Tyunin MA, Аntonenkova E.V. et al. The biological activity of fullerene C60 nanobiocomposites. Immunologiya. 2011; 12:161177. URL: http://www.medline.ru/public/pdf/12_013.pdf (accessed 19 November 2015).
4. Poletayeva DA Membranotropic properties of water soluble derivatives of fullerenes: Moscow, 2012; 26.
2016, т. 6, №2
5. Alekseyeva O.V., Bagrovskaya N.A., Sitnikova O.G. et al. Study of the optical properties and antioxidant activity of fullerene based polystyrene composites. Izv. vuzov. Tekhnologiya legkoy promyshlennosti. 2012, 17:3:35-39. (In Russian).
6. Alekseeva O.V., Sitnikova O.G., Bagrovskaya N.A., Noskov A.V., Zaikov G.E., Emelina O.Yu. Polystyrene/fullerene composites as antioxidative agents. Vestnik Kazanskogo tekhnologicheskogo universiteta. 2014; 17:16:151-155. (In Russian).
7. Vinogradova JI.V., Melenevskaya E.YU., Kever E.E., SHibayev L.A., Antonova T.A., Zgonnik V.N. Synthesis
of fullerene polyethylene oxides. Polymer Science Series A. 1997; 39:11:1733-1739.
8. Alekseeva O.V., Bagrovskaya N.A., Sitnikova O.G. et al. Study of antioxidant activity of fullerene-containing nanocomposites. Liquid Crystals and their Application. 2011; 3: 90-96.
9. Rebrova O.Yu. Statistical analysis of medical data. The use of the STATISTICA software package. Moscow, MediaSfera Publ., 2002; 312.
10. Ginzburg B.M., Tabarov S.KH., Tuychiyev SH. Et al. The effect of the addition of fullerene C60 on the structure and mechanical properties of thin films of organic glass. Applied Physics Letters. 2007; 33:23:43-49.
