Исследование влияния электропорации на сохранение жизнеспособности микромицета Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПРИКЛАДНАЯ ХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ Том 7 N 3 2017

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICO-CHEMICAL AND GENERAL BIOLOGY Оригинальная статья / Original article УДК 664; 663.05

DOI: 10/21285/2227-2925-2017-7-3-54-59

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ НА СОХРАНЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ МИКРОМИЦЕТА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

© Т.В. Выборнова*, А.А. Корнев**

*Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых добавок, Российская Федерация, 191014, г. Санкт-Петербург, пр. Литейный, д. 55. **Санкт Петербургский национальный исследовательский академический университет РАН, Российская Федерация , 194021, г. Санкт-Петербург, ул. Хлопина, д.8, корп. 3, лит. А.

Изучено влияние электрического воздействия на сохранение жизнеспособности мицелиальных грибов на примере микромицета Aspergillus niger. Объектом исследования являлся селекционированный в ФГБНУ ВНИИПД штамм A.niger ВКПМ F-171 - промышленный продуцент лимонной кислоты. Электропорацию культуральной жидкости гриба проводили через 72 ч после засева питательной среды с использованием электропораторов с генераторами экспоненциальной и квадратичной волн. Выбраны условия электропорации культуральной жидкости с использованием генератора квадратичной волны и установлены параметры электропорации, не приводящие к потере жизнеспособности гриба-продуцента. При выбранных параметрах электропорации массовая концентрация органических кислот в культуральной жидкости повышается на 12,1%. Полученные данные в дальнейшем могут быть использованы для трансформации макромолекул в клетку A.niger методом электропорации.

Ключевые слова: продуцент лимонной кислоты, Aspergillus niger, культуральная жидкость, электрическое воздействие, электропорация, жизнеспособность.

Формат цитирования: Выборнова Т.В., Корнев А.А. Исследование влияния электропорации на сохранение жизнеспособности микромицета Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2017. Т. 7, N 3. 54-59. DOI: 10/21285/2227-2925-20177-3-54-59

INVESTIGATION OF THE EFFECT OF ELECTROPORATION ON THE PRESERVATION OF VITALITY OF ASPERGILLUS NIGER MICROMYCETE - A PRODUCER OF CITRIC ACID

© T.V. Vybornova*, A. A. Kornev**

* All-Russian Scientific-Research Institute of Food Additives, 55, Liteinyi Ave., St. Petersburg, 191014, Russian Federation

**St. Petersburg National Research Academic University of Russian Academy of Sciences, 8/3, A, Khlopin St., St. Petersburg, 194021, Russian Federation

The influence of electrical impact on the preservation of the vitali-ty of mycelial fungi on the example of Aspergillus niger micromy-cete was studied. The object of the study was the A. niger VKPM F-171 strain, an industrial citric acid producer, which was select-ed at the FGBNU VNIIPD. Electroporation of the fungus culture fluid was carried out during 72 hours after seeding of the nutrient medium using electroporators with generators of exponential and quadratic waves. Using a quadratic wave generator, the electro-poration conditions of the culture liquid were selected and elec-troporation parameters established; this did not lead to any loss of vitality of the producer fungus. Using the chosen electro-poration parameters, the mass concentration of organic acids in the culture liquid is increased by 12.1%. The data obtained can be used for future transformation of macromolecules into the A. niger cell by means of electroporation. Keywords: citric acid producer, Aspergillus niger, culture liquid, electric impact, electroporation, viability

For citation: Vybornova T.V., Kornev A. A. Research into the electroporation influence on the viability preservation of the micromycete Aspergillus niger, citric acid producer. Izvestia Vuzov. Prikladnaya Khimia i Bio-tekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2017, vol. 7, no. 3, pp. 5459 (in Russian). DOI: 10/21285/2227-2925-2017-7-3-54-59

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в молекулярной биологии для многих методов исследования необходимо, чтобы чужеродные гены, белки или другие молекулы были введены в клетку через мембрану. Разрабатывается много методов трансформации ДНК и других молекул в клетки. Одним из таких методов является электро-порация - наиболее простая, высокоэффективная и воспроизводимая технология введения молекул (нуклеиновые кислоты, белки, углеводы, красители) и вирусных частиц в широкий круг прокариотических и эукариотических клеток. В этом методе электрическое поле высокой интенсивности временно нарушает ли-пидный бислой мембраны, что позволяет обеспечить поступление молекул в клетку из окружающей среды. Физической основой техники электропорации является обратимое повышение проницаемости клеточных мембран, достигаемое посредством действия на клетки короткими импульсами электрического поля высокой напряженности [1, 2].

Многочисленные исследования продемонстрировали, что электропорация может успешно использоваться для введения ДНК и других молекул в различные типы клеток, таких как клетки животных, дрожжей, бактерий, протопласты растений и грибов. Так, с помощью электропорации успешно проведена доставка ДНК с флуоресцентным геном репортера в мозговую ткань мыши [3]. Довольно часто электропорация используется для трансформации макромолекул в клетки дрожжей, особенно Sacharomyces cerevisiae [4]. Первым трансформированным грибом была Trichoder-ma harzanium, первой трансформированной бактерией - Actinobacillus actinomycetemcomi-tans [4]. Известно применение электропорации в исследованиях с плесневыми грибами Fusarium fugikuroi [5], Aspergillus niger van Tieghem ATCC 20739 [6] и др. Целью работы являлось исследование влияния электропора-ции на сохранение жизнеспособности микро-мицета A. niger - продуцента лимонной кислоты.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объектом исследования являлся селекционированный в ФГБНУ ВНИИПД промышленный продуцент лимонной кислоты гриб A. niger штамм ВКПМ F-171 [7].

Глубинное культивирование А. niger осуществляли периодическим способом по технологии концентрированных сред на сахарозо-минеральной среде с исходной массовой концентрацией ферментируемых сахаров 150 г/дм3 в качалочных колбах вместимостью 750 см3 в условиях шейкера-инкубатора Multi-tron фирмы INFOS (Швейцария) при температуре 30-32 °С в течение 5-ти сут. Состав питательной среды, г / дм : сахароза кристаллическая - 50 (на стадии получения посевного мицелия) и 150 (на стадии ферментации); NH4NO3 - 2,5; MgSO4 х 7H2O - 0,25; KH2PO4 -0,16 [8, 9].

Оценку сохранения жизнеспособности культуры A. niger в контрольных и опытных образцах после электропорации осуществляли с помощью высева культуральной жидкости на чашки Петри с сусло-агаром концентрацией 7 ° Б глубинным способом в соответствии с инструкцией 1.

Электропорацию культуральной жидкости проводили через 72 ч после засева питательной среды инокулюмом с использованием электропораторов с генераторами экспоненциальной (ВТХ ЕСМ 630 Electroporation System) и квадратичной (ВТХ ЕСМ 830 Electroporation System) волн. Для электропорации использовали кюветы BTX E^tropo^^ Cuvettes plus 0,4 В каждую кювету вносили 1 см культуральной жидкости A. niger.

В экспериментах с использованием прибора, генерирующего экспоненциальную волну, варьировали значения электрического напряжения от 500 В до 2500 В, электрического сопротивления от 25 Ом до 1600 Ом, электрической емкости от 25 мкФ до 50 мкФ. Длительность электрического воздействия рассчитывалась прибором и находилась в диапазоне от 400 мкс до 600 мкс.

В экспериментах с использованием прибора, генерирующего квадратичную волну, ва-

1 Инструкция по биологическому и химическому контролю производства пищевой лимонной кислоты / ВНИИПАКК: под ред. А.В. Галкина, Т.А. Никифоровой. СПб., 1997. 288 с.

Galkin A.V., Nikiforova T.A. Instruktsiya po biologicheckomu i khimicheskomu kontrolyu pro-izvodstva pishchevoi limonnoi kisloty [The instruction on biological and chemical control of food citric acid production ]. St. Petersburg, 1997, 228 p.

Исследование влияния электропорации на сохранение жизнеспособности..

рьировали значения электрического напряжения от 100 В до 3000 В и длительности электрического воздействия на культуру гриба-продуцента в диапазоне от 1 мс до 5000 мс. Использовали 1 импульс воздействия.

Массовую концентрацию органических кислот определяли титрованием [10].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В результате исследований по оценке сохранения жизнеспособности гриба

A. п^г после электропорации на приборе с генератором экспоненциальной волны ВТХ ЕСМ 630 установлена возможность использования максимального значения электрического напряжения 2500 В, значений электрического сопротивления до 1500 Ом и емкости до 50 мкФ при которых не происходит негативного влияния электрического воздействия на рост гриба. Через 24 ч после высева культуральной жидкости на сусло-агаровую среду в опытных образцах наблюдается рост колоний A. nigeг, зависящий от заданных параметров электропорации. Превышение значения электрического сопротивления 1500 Ом приводило к полной гибели гриба (рисунок).

Определение массовой концентрации органических кислот в культуральной жидкости продуцента после электропорации показало, что данный показатель находился на уровне

контрольного образца и составлял в контрольном варианте в среднем 46,9 г/дм , в опытном варианте 46,5 г/дм .

Использование электропоратора с генератором экспоненциальной волны ВТХ ЕСМ 630 не дает возможности изменять длительность воздействия электрического импульса. Поэтому дальнейшие исследования проводили на электропораторе с генератором квадратичной волны ВТХ ЕСМ 830.

Установлена прямая зависимость жизнеспособности гриба A. п^г от электрического напряжения и времени воздействия электрического импульса (табл.1).

Как показывают результаты исследований, для квадратичной волны возможно использование максимального электрического напряжения 3000 В, но при длительности воздействия электрического импульса, не превышающей 10 мс, или невысокого электрического напряжения 100 В, но при более длительном воздействии на грибную культуру (до 2000 мс) данным электрическим напряжением.

Установлено, что при увеличении длительности воздействия электрического импульса на A. п^г до 1000 мс при электрическом напряжении 100 В происходит повышенная в среднем на 12,1% по сравнению с контролем элиминация органических кислот из клеток продуцента (табл. 2).

1 2 3 4

Рост гриба Aspergillus niger при различных параметрах электропорации с использованием экспоненциальной волны: 1 - электрическое сопротивление не более 1000 Ом, электрическая емкость до 50 мкФ; 2 - электрическое сопротивление от 1000 до 1500 Ом, электрическая емкость до 25 мкФ; 3 - электрическое сопротивление от 1000 до 1500 Ом, электрическая емкость выше 25 мкФ; 4 - электрическое сопротивление выше 1500 Ом, электрическая емкость до 50 мкФ

Aspergillus niger growth under different parameters of electroporation with exponential wave:

1 - electric resistance under 1000 Ohm, capacity under 50 jF;

2 - electric resistance 1000-1500 Ohm, capacity under 25 jF;

3 - electric resistance 1000-1500 Ohm, capacity over 25 jF;

4 - electric resistance over 1500 Ohm, capacity under 50 jF

Таблица 1

Оценка жизнеспособности гриба Aspergillus niger на чашках Петри после электропорации с использованием квадратичной волны

Table 1

Viability of Aspergillus niger on Petri dish after electroporation with quadratic wave

Длительность Рост гриба

Электрическое электрического Aspergillus niger через

напряжение, В воздействия, мс 24 ч 48 ч

100 1000 +++ +++

100 2000 ++ +++

250 10 +++ +++

250 100 +++ +++

500 1 ++ +++

500 10 + ++

500 50 - +

500 300 - +

500 1000 - -

500 5000 - -

1000 10 +++ +++

1500 10 +++ +++

2000 10 ++ +++

2500 120 - +

3000 10 ++ +++

3000 100 - +

Примечание: «+++» рост идентичен контролю; «++» - неравномерный рост; « + » - начало роста; « -» - роста нет.

Таблица 2

Массовая концентрация органических кислот в культуральной жидкости гриба Aspergillus niger при различных параметрах электропорации (квадратичная волна)

Table 2

Mass concentration of organic acids in Aspergillus niger culture liquid under different parameters of electroporation (quadratic wave)

Варианты

Параметры электропорации

Массовая концентрация органических кислот,

г / дм

% к контролю

Контроль Опыт 1

Опыт 2

Опыт 3

Опыт 4

Е =250 В т =10 мс Е =250 В т =100 мс Е=100 В т =1000 мс Е=1000 В т =10 мс

74,4±0,7 76,7±0,4

80,8±1,0

83,4±0,7

78,3±0,4

100,0 103,1±0,5

108,6±1,3

112,1±0,9

105,4±0,5

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований выбраны условия электропорации культуральной жидкости A. п^г с использованием прибора ВТХ ЕСМ 830, генерирующего квадратичную волну, и установлены параметры электропорации, не приводящие к потере жизнеспособности микромицета A. п^г - продуцента

лимонной кислоты, а именно, электрическое напряжение - 100 В, длительность электрического воздействия - 1000 мс.

Установлено, что при использовании электрических импульсов квадратичной волны при выбранных параметрах происходит, по-видимому, за счет повышения проницаемости клеточной стенки гриба, повышенная элими-

Исследование влияния электропорации на сохранение жизнеспособности...

нация органических кислот из клетки по сравнению с контрольным вариантом в среднем на 12,1%.

Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем для трансформации макромолекул в клетку гриба A. п^г методом электропорации.

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013-2020 гг. по проекту 25.2.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК

1. Weaver G.C. Electroporation Theory: Concepts and Mechanisms // Electroporation Protocols for Microorganisms. Totowa, New Jersey: Humana Press, 1995. P. 1-26.

2. Rols M.P. Mechanism by which electroporation mediates DNA migration and entry into cells and targeted tissues // Methods Mol. Biol. 2008. V. 423. P. 19-33.

3. Saito T., Nakatsuji N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporaition. // Dev.Biol. 2001. V. 240 (1). P. 237-246.

4. Rivera A.L., Gómez-Lim M., Fernández F., Loske A.M. Genetic transformation of cells using physical methods // Journal of Genetic Syndromes & Gene Therapy. 2014. V. 5, N. 4. P. 237-242.

5. García-Martínez J., Brunk M., Avalos J., Terpitz U. The CarO rhodopsin of the fungus Fusarium fujikuroi is a light-driven proton pump that retards spore germination // Scientific Reports. 2015. V. 5. Article 7798. D0I:10.1038/srep 07798.

6. OzeKi K., Kyoya F., Hizume K., Kanda A., Hamachi M. and NunoKawa Y. Transfor-mation of intact Aspergillus niger by electroporation // General Research Laboratory, Ozeki Corporation, 4-9

Imazu Deraike cho, Nishinomiya-shi, Hyogo 663, Japan Received June 27, 1994. P. 2224-2227.

7. Пат. № 975799, СССР, МКИ5 С 12 N 15/00, С 12 Р 7/48. Штамм гриба Aspergillus niger Л-4 - продуцент лимонной кислоты / В.П. Ермакова, Е.Я. Щербакова, И.М. Василинец, В.М. Финько; заявитель и патентообладатель ЛНИИПП. № 2955606; заявл. 13.06.1980, опубл.23.11.1982, Бюл. N 43.

8. Пат. № 2428481, Российская Федерация, МПК С 12 Р 7/48. Способ получения лимонной кислоты / Т.В. Выборнова, Т.А. Никифорова, В.П. Комов, Л.Б. Пиотровский, М.А. Думнина, Е.В. Литасова; заявитель и патентообладатель ГУ ВНИИПАКК. № 2010112411; заяв.30.03.2010, опубл.10.09.2011. Бюл. № 25.

9. Никифорова Т.А., Мушникова Л.Н., Львова Е.Б. Основы микробного синтеза лимонной кислоты. СПб.: ЗАО «Полиграфическое предприятие № 3», 2005. 180 с.

10. Муратова Е.И., Зюзина О.В., Шуняева О.Б. Биотехнология органических кислот и белковых препаратов. Тамбов: Изд-во Тамбовского государственного технического университета, 2007. 80 с.

REFERENCES

1. Weaver G.C. Electroporation Theory: Concepts and Mechanisms. In: Electroporation Protocols for Microorganisms. Totowa, New Jersey: Humana Press, 1995, pp. 1-26.

2. Rols M.P. Mechanism by which electro-poration mediates DNA migration and entry into cells and targeted tissues. Methods Mol. Biol. 2008, vol. 423, pp. 19-33.

3. Saito T., Nakatsuji N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporaition. Dev. Biol. 2001, vol. 240, no. 1, pp. 237-246.

4. Rivera A.L., Gómez-Lim M., Fernández F., Loske A.M. Genetic transformation of cells using physical methods. Journal of Genetic Syndromes & Gene Therapy. 2014, vol. 5, no. 4, pp. 237-242.

5. García-Martínez J., Brunk M., Avalos J., Terpitz U. The CarO rhodopsin of the fungus Fusarium fujikuroi is a light-driven proton pump that retards spore germination. Scientific Reports. 2015, vol. 5, article 7798. doi:10.1038/srep07798

6. OzeKi K., Kyoya F., Hizume K., Kanda A., Hamachi M., NunoKawa Y. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation. General Research Laboratory, Ozeki Corporation, 4-9 Imazu Deraike cho, Nishinomiya - shi, Hyogo 663, Japan Received June 27, 1994, pp. 22242227.

7. Ermakova V.P. [et al.] Shtamm griba Aspergillus niger L-4- produtsent limonnoi kisloty [The fungus Aspergillus niger strain L-4 as a producer of citric acid]. Patent USSR, no. 975799, 1982.

8. Vybornova T.V. [et al.] Sposob polucheni-ya limonnoi kisloty [A method for producing citric acid]. Patent RF, no. 2428481, 2011.

9. Nikiforova T.A., Mushnikova L.N., L'vova E.B. Osnovy mikrobnogo sinteza limonnoi kisloty [Basis of citric acid microbial synthesis]. St. Petersburg: Poligraficheskoe predpriyatie no. 3 Publ., 2005, 180 p.

10. Muratova E.I., Zyuzina O.V., Shunyaeva O.B. Biotekhnologiya organicheskikh kislot i

belkovykh preparatov [Biotechnology of organic acids and proteinaceous preparations]. Tambov:

Критерии авторства

Выборнова Т.В., Корнев А.А. выполнили экспериментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Выборнова Т.В., Корнев А.А. имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации

Татьяна В. Выборнова

Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых добавок Научный сотрудник [email protected]

Антон А. Корнев

Санкт-Петербургский академический

университет РАН

М.н.с.

[email protected]

Поступила 28.10.2016

Publishing house of Tambov State Technical University, 2007, 80 p.

Contribution

Vybornova T.V., Kornev A.A. carried out the experimental work, on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. Vybornova T.V., Kornev A.A. have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.

Conflict of interests

The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.

AUTHORS' INDEX Affiliations

Tatiana V. Vybornova

All-Russian Scientific Research Institute of Food Additives Researcher [email protected]

Anton A. Kornev

St. Petersburg National Research Academic University of the Russian Academy of Sciences Research assistant [email protected]

Received 28.10.2016