CC BY
76УДК 577.114
ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И ХИМИЧЕСКОГО СТРОЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ
Е.К. Гладышева
Методами инфракрасной спектроскопии и ядерного магнитного резонанса исследованы структура и химическое строение образцов бактериальной целлюлозы, полученных на синтетической питательной среде и среде ферментативного гидролизата технической целлюлозы плодовых оболочек овса с помощью продуцента Мedusomyces gisevii. Методом ИК-спектроскопии установлена химическая чистота бактериальной целлюлозы: образцы не содержат примесей, характерных для растительной целлюлозы, т.к. отсутствуют полосы поглощения, указывающие на ароматические соединения. ИК-спектры образцов бактериальной целлюлозы, полученных на синтетической питательной среде и среде ферментативного гидролизата технической целлюлозы плодовых оболочек овса идентичны. Методом ЯМР-спектроскопии подтверждена идентичность химического строения опытных образцов бактериальной целлюлозы и растительной целлюлозы.
Ключевые слова: бактериальная целлюлоза, Мedusomyces д'^еу'и, инфракрасная спектроскопия, метод ядерного магнитного резонанса, ферментативный гидролизат плодовых оболочек овса.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время активно ведутся исследования по поиску новых материалов, с широким спектром применения. Одним из таких материалов является бактериальная целлюлоза (БЦ).
БЦ, в отличие от растительной целлюлозы, синтезируется микроорганизмами в чистом виде без примесей лигнина и других сопутствующих компонентов [1]. БЦ имеет более высокий модуль Юнга при меньших размерах волокна, чем у растительной целлюлозы [2]. Сетчатая структуры БЦ позволяет поглощать в себя воду в 100 раз больше собственного веса [3]. Рентгенографические исследования БЦ показывают более высокую степень кристалличности и преобладание низкосиммеи-ричной реакционноспособной фазы 1а, в отличие от растительной целлюлозы в которой преобладает фаза 16 [4, 5].
БЦ используется в пищевой, целлюлозо-бумажной, электронной, биотехнологической и химической промышленностях. Сетчатая на-нофибрилярная структура позволяет применять БЦ как основу для раневых покрытий. Такое свойство как биосовместимость позволяет применять БЦ при протезировании кровеносных сосудов и при восстанновлении хрящей. Нанокомпозиты БЦ возможно использовать при восстановлении костных тканей [6].
Однако производство БЦ дорогостоящий процесс, т.к. в качестве питательной среды используется пищевое сырье. Замена пище-
вого сырья на непищевое позволит значительно снизить себестоимость БЦ.
В ИПХЭТ СО РАН разработана технология получения гидролизатов из таких возобновляемых целлюлозосодержащих растительных ресурсов, как биомасса энергетического растения мискантуса (сорта Соранов-ский, выведенного в Институте цитологии и генетики СО РАН) и плодовых оболочек овса (многотоннажного отхода сельского хозяйства в Алтайском крае). Гидролизаты получают в мягких условиях путём ферментативного гидролиза. Показано, что ферментативные гидролизаты являются биологически доброкачественными, пригодными для получения продуктов микробиологического синтеза (на примере биоэтанола) и не нуждаются в дополнительной технологической обработке для освобождения их от вредных примесей [7]. Также в лаборатории ИПХЭТ СО РАН разработан способ получения БЦ, где в качестве питательной среды используется ферментативный гидролизат плодовых оболочек овса, мискантуса и льна-межеумка [8].
В данной работе БЦ получена на синтетической питательной среде и на среде ферментативного гидролизата технической целлюлозы плодовых оболочек овса (ТЦ ПОО). Структура и химическое строение образцов БЦ изучены методами инфракрасной спектроскопии, и ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В экспериментах использовались: синтетическая питательная среда, приготовленная растворением глюкозы в экстракте черного чая (12 г чая на 1 л воды) и среда ферментативного гидролизата ТЦ ПОО. В качестве инокулята использовалась семидневная сим-биотическая культура Мedusomyces gisevii, выращенная на глюкозной среде и на среде ферментативного гидролизата ТЦ ПОО, доза внесения составляла 10 %. Начальная концентрация субстрата в обеих питательных средах составила 20 г/л, уровень активной кислотности саморегулировалcя симбиозом [9]. Выбор концентрации глюкозы и активной кислотности обоснован в работе [10]. Культивирование проводилось в статических условиях при 27 °С в течение 14 суток.
Гель-плёнка, образующаяся в результате биосинтеза, в процессе роста загрязнялась остатками компонентов питательной среды, метаболитами и клетками микроорганизмов. Очистка плёнок может быть проведена разными способами: растворами кислот и щелочей, энзимной обработкой, при этом может изменяться диаметр и распределение микрофибрилл БЦ [11].
В данной работе образцы пленок были очищены следующим способом: в течение двух суток образцы выдерживались в 2 %-ном растворе NaOH для удаления клеток, затем пленка промывались в дистиллированной воде до нейтральной реакции, далее обрабатывались в течение суток в 2 %-ном растворе HCl для удаления красящих веществ чая, затем пленка промывалась дистиллированной водой до нейтральной реакции среды. Плёнки, высушивались при комнатной температуре в расправленном состоянии.
Структура и химическое строение БЦ исследовалась на инфракрасном спектрофотометре «Инфралюм ФТ-801» в таблетках KBr и на спектрометре «Bruker avance 400» с высокотемпературными датчиками высокого разрешения твердого дела (до 300 °C).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В таблице 1 представлено сравнение полос поглощения функциональных групп в образцах БЦ, полученных на синтетической среде и на среде ферментативного гидроли-зата ТЦ ПОО с литературными данными для бактериальной целлюлозы, выращенной с помощью продуцента Acetobacter [12].
Таблица 1 - Отнесение полос поглощения функциональных групп в образце бактериальной целлюлозы.
Отнесение полос поглощения БЦ1 БЦ2 БЦ [12]
V OH-групп, участвующих в межмолекулярных и внутримолекулярных ^связях 3429 3432 3408
V связей в группах ^ и 2920 2854 2921 2897
V присутствия аминокислот 2537 2135 2540 2135 -
б связей HOH обусловлено присутствием прочно связанной воды 1638 1541 1643 1532 1635
б групп 1430 1431 -
б групп OH в CH2OH 1375 1376 1370
б групп в CH2OH 1282 1249 1281 1248
б групп OH - 1204,3 -
V связей C-O (характерные для полисахаридов полосы, обусловленные наличием ацетильных связей C-O-C и связей С-О в спиртах) 1165 1060 1102 1163 1060
р-1,4 связи 899 899 899
* V - валентные колебания, б - деформационные колебания, БЦ1 получена на синтетической питательной среде, БЦ2 - на среде ферментативного гидролизата ТЦ ПОО
Интенсивная полоса в области 32003600 см-1 обусловлена валентными колебаниями OH-групп. Менее интенсивная полоса в области 2800-3000 см-1 указывает на валентные колебания групп В спектре
целлюлозы интенсивная полоса с максимумом при 1641 см-1 принадлежит деформационным колебаниям Oн-групп прочно связанной воды. Полосы в интервале 1500-1200 см-1 чувствительные к химическим и структурным
Е.К. ГЛАДЫШЕВА
превращениям. Полосы поглощения в области 1000-1200 см-1 обусловлены в основном
валентными колебаниями C-O-C и C-O в
-1
спиртах. Полоса при 899 см- подтверждает наличие р-1,4 связей [13]. ИК-спектры показывают, что БЦ не содержит примесей, в частности лигнина, присутствующего в растительной целлюлозе, так как отсутствуют полосы поглощения, характерные для ароматических соединений (лигнина). В отличие от литературных данных [12], в спектре присут-
ствуют слабые полосы при 2135 и 25372540 см-1, указывающие на наличие аминокислот, которые могут принадлежать остаткам клеток дрожжей и бактерий [14]. ИК-спектр образца БЦ. полученного на среде ферментативного гидролизата ТЦ ПОО идентичен ИК-спектру образца БЦ, полученного на синтетической питательной среде.
На рисунке 1 представлены ЯМР-спектры образцов БЦ, полученных на двух питательных средах.
3C CP/MAS NMR
CD . .
о о со т— ОЗ со
I I I I
БЦ полученная на синтетической питательной среде
БЦ полученная на среде ферментативного гидролизата
-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-г-
250 200 150 100 50
Рисунок 1 - ЯМР(13С)-спектры образцов БЦ, полученных на разных питательных средах
300
0
-50
ppm
Как показано на рисунке 1, резонансные линии для образцов бактериальной целлюлозы соотносятся с углеродами С1 - 106,1 м.д., С4 - 90,0 м.д. и С6 - 64,0 м.д. со стороны слабого поля, за исключением кластера ре-зонансов при 70-80 м.д., которые принадлежат углеродам С2, С3 и С5. Можно сделать вывод, что образцы БЦ полученные на синтетической среде и на среде ферментативного гидролизата ТЦ ПОО имеют идентичные химическое строение и структуру.
Сравнение опытных ЯМР-спектров с данными, приведенными в литературе для растительных целлюлоз [13] показало совпадение химических сдвигов с разницей ±1 м.д., что является достаточным для подтверждения идентичности структуры и химического строения образцов БЦ и растительной целлюлозы.
ВЫВОДЫ
Методами инфракрасной спектроскопии и ядерного магнитного резонанса исследованы структура и химическое строение образцов БЦ, полученных на синтетической питательной среде и среде ферментативного гидролизата ТЦ ПОО с помощью продуцента Мedusomyces gisevii. Методом ИК-спектроскопии установлена химическая чистота БЦ: образцы не содержат примесей, характерных для растительной целлюлозы, т.к. отсутствуют полосы поглощения, указывающие на ароматические соединения. ИК-спектры образцов БЦ, полученных на синтетической питательной среде и среде ферментативного гидролизата ТЦ ПОО идентичны. Методом ЯМР-спектроскопии подтверждена идентичность химического строения опытных образцов БЦ и растительной целлюлозы.
Автор выражает благодарность и глубокую признательность сотруднику Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института катализа им. Г.К. Борескова Сибирского отделения Российской академии наук (ИК СО РАН), доктору химических наук Степанову Александру Гэи-горьевичу в проведении исследований Бц методом ЯМР-спектроскопии.
Работа выполнена при финансовой поддержке ведущей научной школы РФ НШ-6322.2014.10.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Belgacem, M. N. Monomers, Polymers and Composites from Renewable Resources / M. N Belgacem, A. Gandini. - Amsterdam : Elsevier. - 2008. -553 p.
2. Hsieh, Y.-C. An estimation of the Young's modulus of bacterial cellulose filaments / Y.-C. Hsieh, H. Yano, M. Nogi, S. J. Eichhor // Cellulose. - 2008. -№ 15. - P. 507-513.
3. Meftahi, A. The effects of cotton gauze coating with microbial cellulose / A. Meftahi, R. Khajavi, A. Rashidi, M. Sattari, M. E. Yazdanshenas, M. Torabi // Cellulose. - 2010. - № 17. - P. 199-204.
4. Шипина, О. Т. Рентгенодифракционный анализ различных видов целлюлозы / О. Т. Шипина, З. Т. Валишина, А. В. Косточко // Вестник технологического университета. - 2015. - Т. 18, № 17. -С. 166-170.
5. Гладышева, Е. К. Результаты рентгенографических исследований бактериальной целлюлозы / Е. К. Гладышева // Фундаментальные исследования. - 2015. - № 7-2. - С. 240-244.
6. Гладышева, Е. К. Обоснование выбора питательной среды для синтеза бактериальной целлюлозы / Е. К. Гладышева // Вестник Алтайской науки. - 2014. - № 1. - P. 307-310.
7. Скиба, Е. А. Изучение устойчивости штамма Saccharomyces oerevisiae ВКПМ Y-1693 к ферментативным гидролизным средам / Е. А. Скиба, О. В. Байбакова // Ползуновский вестник. - 2013. -№ 3. - С. 214-219.
8. Будаева В. В., Гладышева Е. К., Скиба Е. А., Сакович Г. В. Способ получения бактериальной целлюлозы - заявка на изобретение. Регистра-ционный № 2015129304 от 16.07.2015.
9. Гладышева Е. К., Судакова О. А. Культивирование Medusomyces gisevii J.Lindau при различных значениях активной кислотности / Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности: материалы VII Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием, 21-23 мая 2014 г., г. Бийск. - Бийск : Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2014. - С. 284-286.
10. Гладышева, Е. К. Изучение биосинтеза бактериальной целлюлозы культурой Medusomyces gisevii J. Lindau на средах с различной начальной концентрацией глюкозы / Е. К. Гладышева // Фундаментальные исследования. - 2015. - № 2-1. -С. 13-17.
11. Виноградова В. Р., Болотова К. С. Влияние химической и ферментативной обработки бактериальной целлюлозы на ее структуру и состав / Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности: материалы VII Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием (21-23 мая 2014 г., г. Бийск). - Бийск : Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2014. - С. 216-218.
12. Xueqiong, Yin. Comparison of succinylation methods for bacterial cellulose and adsorption capacities of bacterial cellulose derivatives for Cu2+ ion / Xueqiong Yin, Changjiang Yu, Xiaoli Zhang, Jianxin Yang, Qiang Lin, Jinbang Wang, Qingmei Zhu // Polymer Bulletin. - 2011. - № 67. - С. 401-412.
13. Новый справочник химика и технолога. Сырье и продукты промышленности органических и неорганических веществ. Ч. II. - Спб. : НПО «Профессионал», 2006. - 1142 с.
14. Беллами, Л. Новые данные по ИК спектрам сложных молекул / Л. Беллами. - М. : Мир, 1971. - 320 с.
Гладышева Е.К. - аспирант, младший научный сотрудник лаборатории биоконверсии, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения Российской академии наук (ИПХЭТ СО РАН), evg-gladysheva@yandex.ru, тел. (3854) 30-59-85.
