CC BY
21
УДК 602.66:612.017.12
Исследование структурных и иммунологических свойств химерных белков, содержащих участки MPER ВИЧ-1
А. П. Рудометов1*, Н. Б. Рудометова1, Д. Н. Щербаков1,4, А. А. Ломзов2,3, О. Н. Каплина1,
Н. С. Щербакова1, А. А. Ильичев1, А. Ю. Бакулина1,3, Л. И. Карпенко1
1ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Роспотребнадзора, 630559, Кольцово Новосибирской обл.
2Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090,
Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8
3Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 1
4Алтайский государственный университет, 656049, Барнаул, просп. Ленина, 61
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 28.05.2019
Принята к печати 07.08.2019
DOI: 10.32607/20758251-2019-11-3-56-65
РЕФЕРАТ Разработка безопасной и эффективной вакцины против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) могла бы способствовать прекращению пандемии ВИЧ/СПИДа, представляющей серьезную проблему здравоохранения во всем мире. Значительная часть исследований в области вакцинопрофилактики ВИЧ-1 направлена на разработку иммуногенов и стратегий иммунизации, способных вызывать формирование антител, обладающих нейтрализующей активностью в отношении широкого спектра изолятов ВИЧ-1 (bNAbs). Цель данной работы заключалась в создании иммуногенов, способных направить иммунный ответ на мембрано-проксимальную наружную область (MPER) ВИЧ-1, один из районов связывания bNAbs. Сконструированы два иммуногена, представляющие фрагменты MPER в составе двух белков-носителей: белка YkuJ Bacillus subtilis и искусственного полипептида TBI. С помощью метода кругового дихроизма показано, что вторичная структура иммуногенов согласуется с их теоретическими моделями. Антигенная структура белков MPER-TBI и YkuJ-MPER охарактеризована с помощью bNAbs, узнающих MPER ВИЧ-1 (2F5, 4E10 и 10E8). Иммуногенность полученных рекомбинантных белков показана на кроликах. Установлено, что полученные сыворотки кросс-реактивны в отношении иммуногенов, содержащих MPER. Конструкции, созданные и охарактеризованные в данной работе, могут быть использованы для фокусирования гуморального иммунного ответа на MPER, который считается одним из регионов уязвимости ВИЧ-1. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ВИЧ-1, рекомбинантные иммуногены, эпитопы нейтрализующих антител, bNAbs, MPER. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека первого типа; bNAbs - нейтрализующие антитела широкого спектра действия (broadly neutralizing antibodies); BSA - бычий сывороточный альбумин; MPER - мембрано-проксимальная наружная область (membrane-proximal external region); МКА -моноклональное антитело; PBS - фосфатно-солевой буфер.
ВВЕДЕНИЕ
Для прекращения пандемии ВИЧ/СПИДа необходимо иметь безопасную и эффективную вакцину против ВИЧ-1 [1, 2]. Надежду на появление такой вакцины дало открытие антител, способных нейтрализовать широкий спектр изолятов ВИЧ-1 (broadly neutralizing antibodies, bNAbs) [3, 4]. Установлено, что пассивное введение отдельных bNAbs или их
комбинаций может обеспечить полную защиту животных моделей от ВИЧ-инфекции [5, 6]. Несмотря на появление bNAbs в организме при естественном течении ВИЧ-инфекции, вызвать формирование таких антител при вакцинации оказалось нетривиальной задачей, решить которую пока не удалось [7]. В настоящее время можно выделить ряд направлений, в рамках которых ведутся разработки имму-
ногенов, направленных на индукцию bNAbs [4, 8, 9]. Одно из таких направлений - включение в состав белков-носителей (скаффолдов) консервативных областей ВИЧ-1 (регионов уязвимости), с которыми взаимодействуют нейтрализующие антитела широкого спектра действия [10, 11].
Одним из регионов уязвимости ВИЧ-1 является мембрано-проксимальная наружная область (MPER) gp41, необходимая для слияния вирусной мембраны с клеточной [12]. Известен ряд bNAbs к этой области, таких, как 2F5, 4E10, Z13, Z13e1, m66.6, CH12, 10E8 и DH511.2 [13, 14].
Ранее был предпринят ряд попыток, направленных на разработку иммуногенов, способных вызвать наработку bNAbs, нацеленных на MPER [15], но лишь некоторые из них обеспечили индукцию нейтрализующих антител, при этом с низкой эффективностью и ограниченной широтой нейтрализации [16, 17]. Причины этого могут быть самыми разными, среди них аутореактивность анти-MPER-антител [18], изменение конформации района MPER в процессе проникновения вируса в клетку [14], участие липидной мембраны в формировании комплекса с анти-MPER-антителами [19]. Более того, высокая гидрофобность MPER [20] и стерические ограничения, накладываемые фрагментом gp120 [21], делают его слабо имму-ногенным.
В данной работе мы провели исследование, направленное на разработку и характеристику реком-бинантных иммуногенов YkuJ-MPER и MPER-TBI, предназначенных для фокусирования иммунного ответа на регион уязвимости ВИЧ-1 - MPER.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Моноклональные антитела, штаммы бактерий, ферменты
МКА 4E10 (№ 10091), 10E8 (№ 12294), 2F5 (№ 1475) получены в рамках программы предоставления реактивов NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (США). Штамм Escherichia coli BL21(DE3) pLysS (Invitrogen) предоставлен отделом «Коллекции микроорганизмов» ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (Кольцово, Россия). Эндонуклеазы рестрикции XbaI, FauNDI, Sfr274I, EcoRI, Zsp2I, KpnI и Т4 ДНК-лигаза приобретены в компании «СибЭнзим» (Новосибирск, Россия).
Получение гена химерного белка YkuJ-MPER
Для выбора белка-носителя YkuJ проведен поиск в классификаторе белковых структур SCOP. Для оценки вероятности аутоиммунных реакций проведен анализ гомологии аминокислотной последовательности YkuJ и белков человека с использо-
ванием базы данных UniProt и программы BLAST. При проектировании химерного белка YkuJ-MPER N- и C-концы выбранного белка-носителя были заменены на фрагменты последовательности MPER региона ВИЧ-1.
Ген химерного белка YkuJ-MPER синтезирован компанией «Евроген» (Москва, Россия), а затем клонирован в составе плазмидного вектора рЕТ21а (Novagen) по сайтам рестрикции FauNDI и Sfr274I.
Получение гена полипептида MPER-TBI
Иммуноген MPER-TBI получен путем замены С- и N-концевых участков полипептида TBI_tag [22] на районы, соответствующие районам MPER в составе YkuJ-MPER. Образующие дуплексы олигонуклеотиды, кодирующие последовательности ELLELDKWASLANWFIITNLLWLIK и IALLLDAWASLWNWFDITNWLWYI и содержащие липкие концы, аналогичные тем, которые образуются при обработке плазмидного вектора эн-донуклеазами рестрикции EcoRI и Zsp2I или KpnI и Sfr274I соответственно, синтезированы компанией «Евроген» (Москва, Россия). Олигонуклеотидные дуплексы клонировали по уникальным сайтам в составе рекомбинантной плазмиды pET-TBI_tag, кодирующей полипептид TBI_tag. Первый олигону-клеотидный дуплекс клонировали по сайтам EcoRI и Zsp2I, при этом был заменен участок env (255-266), входящий в состав TBI_tag. Второй олигонуклеотид-ный дуплекс клонировали по сайтам KpnI и Sfr274I, при этом были заменены участки gag (351-361), gag (211-305) и gag (99-109) полипептида TBI_tag. Таким образом получена рекомбинантная плазмида pET-MPER-TBI. Структуры целевых плазмид pET-YkuJ-MPER и pET-MPER-TBI подтверждены секвениро-ванием в ЦКП «Геномика» СО РАН (Новосибирск, Россия).
Построение моделей взаимодействия YkuJ-MPER с Fab-фрагментами антител 10Е8, 2F5 и 4E10
Для построения моделей использовали программы Modeller и PyMOL. С помощью программы PyMOL совмещали структуры YkuJ из PDB (2FFG) и структуры фрагментов MPER из комплексов MPER с Fab-фрагментами антител 2F5 (2PR4), 4E10 (2FX8) или 10E8 (4G6F). Результат такого совмещения использовали как шаблон при моделировании по гомологии в программе Modeller. Затем для проверки возможности соединения YkuJ-MPER с моноклональными антителами на полученные модели с помощью программы PyMOL накладывали соответствующие структуры комплексов MPER с Fab-фрагментами антител.
Наработка и очистка рекомбинантных белков YkuJ-MPER и MPER-TBI
Бактериальные штаммы-продуценты белков YkuJ-MPER и MPER-TBI получали путем трансформации химически компетентных клеток E. coli BL21 плазми-дами pET-YkuJ-MPER и pET-MPER-TBI и культивировали их как описано ранее [22]. Рекомбинантные белки очищали с помощью металл-хелатной хроматографии на колонке с Ni-NTA (Qiagen, Германия) согласно инструкции производителя. Рефолдинг очищенных белков проводили с помощью диализа против четырех смен PBS с понижающейся концентрацией мочевины (6, 4, 2, 1 М), последний этап диализа проводили против физиологического раствора. Степень очистки целевого белка оценивали с помощью электрофореза в 15% ПААГ с последующей фиксацией и окрашиванием Кумасси G250. Количественный анализ содержания белков проводили путем спектрофо-тометрического измерения концентрации при 280 нм (NanoDrop-2000, Thermo Fisher Scientific).
Предсказание вторичной структуры MPER-TBI
Для предсказания вторичной структуры иммуногена MPER-TBI использовали алгоритм PSSfinder на сервере GeneSilico Metaserver [23].
Круговой дихроизм
Спектры кругового дихроизма (КД) белков YkuJ-MPER и MPER-TBI зарегистрированы при 25°C в физиологическом растворе с использованием тер-мостатируемой 1-мм кюветы на спектрополяриметре J-600 (JASCO, Япония). Все спектры были записаны в диапазоне 195-260 нм с шагом 1 нм и усреднены после трех измерений. Концентрации образцов в физиологическом растворе были приведены к одинаковой оптической плотности на длине волны 214 нм.
Для определения доли а-спиралей, ß-листов, поворотов и неупорядоченной формы минимизировали разницу между теоретическими и экспериментальными кривыми. Теоретические кривые представляли в виде линейной комбинации базовых спектров различных компонент вторичных структур, взятых из программы CCA+ [24].
Дот-блот-анализ
Дот-блот-анализ проводили с использованием системы SNAP i.d. (Millipore, США) как описано ранее [22]. На нитроцеллюлозную мембрану (Amersham, Австрия) наносили по 2 мкл двукратных последовательных разведений белков YkuJ-MPER и MPER-TBI (стартовая концентрация 0.2 мг/мл). В качестве первичных использовали МКА 4E10, 10E8 и 2F5 (разбавленные 1 : 10000 в PBS, 1% BSA). В качестве вторичных использовали антитела кролика против IgG
человека (Sigma, США), конъюгированные со щелочной фосфатазой (разбавленные 1 : 5000 в PBS, 1% BSA). Иммунный комплекс визуализировали, добавляя NBT/BCIP-субстратный раствор (Sigma, США).
Получение и анализ сывороток животных, иммунизированных белками YkuJ-MPER и MPER-TBI
В экспериментах использовали 4-месячных кроликов-самок (вес 1.6-2 кг) породной принадлежности шиншилла. Животных содержали в отдельных клетках (виварий ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) в условиях содержания на стандартном рационе со свободным доступом к пище и воде. Эксперименты были одобрены на заседании Биоэтической комиссии ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (протокол № 3 от 25.04.2018 г.) и выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации.
Животные были случайным образом разделены на две группы (три кролика в каждой группе). Препараты белков вводили четырехкратно на 1-й, 14-й, 28-й и 42-й дни. При первой иммунизации кроликам подкожно вводили по 500 мкг YkuJ-MPER либо MPER-TBI с полным адъювантом Фрейнда. При второй - по 500 мкг образца в комплексе с неполным адъювантом Фрейнда, при последующих иммунизациях - по 800 мкг образца без адъюванта. Перед каждой иммунизацией и через 2 недели после последней иммунизации проводили забор образцов крови, из которых получали сыворотки.
Иммуноферментный анализ
Специфическую активность сывороток кроликов, иммунизированных белками YkuJ-MPER и MPER-TBI, оценивали с помощью ИФА как описано ранее [22]. Белки YkuJ-MPER и MPER-TBI (5 мкг/мл) сорбировали в лунках 96-луночного планшета (Greiner bio one, Германия). Образцы сывороток вносили в пятикратном последовательном разведении. Затем добавляли антитела козы против IgG кролика (разбавленные в PBS 1 : 10000), конъюгированные с пе-роксидазой хрена (Sigma, США), планшет промывали и вносили раствор субстрата TMB (Amresco, США). Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм на ИФА-ридере (Model 680 Micro plate reader, Bio-Rad, США). Все эксперименты проводили в трех повторах. При определении титра сывороток максимальным разведением считали разведение, значение оптической плотности (ОП) которого превышало в 2 раза ОП отрицательного контроля (при том же разведении). Графики построены с помощью программы GraphPad Prism 6.0.
Анализ сывороток на наличие антител, специфических к белкам ВИЧ-1
Анализ проводили с использованием тест-системы New Lav Blot I (Bio-Rad, Франция) в соответствии с протоколом производителя. В качестве конъюгата для сывороток кроликов использовали антитела козы против IgG кролика (разбавленные 1 : 5000 в PBS), конъюгированные со щелочной фосфатазой (Sigma, США). Иммунные комплексы визуализировали, добавляя NBT/BCIP-субстратный раствор (Sigma, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проектирование белков-носителей области MPER ВИЧ-1
Для презентации MPER иммунной системе решено использовать два белковых носителя с разной пространственной организацией. При этом носители должны обеспечивать конформационную подвижность области MPER, а также быть нетоксичными, растворимыми, иметь небольшой размер и не вызывать аутоиммунных реакций.
С помощью поиска в классификаторе белковых структур SCOP мы выбрали белок-носитель YkuJ Bacillus subtilis (рис. 1А). Ядро данного белка состоит из антипараллельных ß-тяжей, образующих жесткий каркас молекулы. Концевые участки являются спиральными, что соответствует конформации эпи-топов МКА 4E10 и 10E8. Можно предполагать, что белок YkuJ безопасен, поскольку B. subtilis не патогенна для животных и человека. Чтобы по возможности исключить аутоиммунные реакции на YkuJ, с помощью программы BLAST проведен поиск его гомологов в базе данных белков человека. В результате анализа не обнаружено значимых совпадений аминокислотной последовательности этого белка с белками человека, поэтому индукция аутоиммунных реакций маловероятна.
При проектировании химерного белка YkuJ-MPER N- и C-концы белка-носителя были заменены на фрагменты консенсусной последовательности MPER региона ВИЧ-1 подтипа B, нумерация соответствует штамму HXB2: 659ELLELDKWASLWNWFDIT NWLWYIK683. При этом перекрывающиеся со встраиваемой последовательностью остатки YkuJ, важные для поддержания пространственной структуры белка-носителя, были оставлены без изменений. Ядро белка-носителя также не подвергали изменениям, чтобы максимально сохранить исходную структуру YkuJ. В конструкции YkuJ-MPER присутствуют все аминокислотные остатки MPER, критичные для связывания bNAbs 10Е8, 4Е10 и 2F5. Для возможности очистки рекомбинантного белка с помощью
Рис. 1. А - структура белка YkuJ, идентификатор PDB 2FFG; Б - модель химерного белка YkuJ-MPER. Для наглядности каркас исходного белка выделен бирюзовым, встроенные в N-конец участки MPER - красным, в C-конец - коричневым, гистидиновая метка обозначена серым цветом
металл-хелатной хроматографии к C-концу добавлено шесть остатков гистидина. Итоговая конструкция YkuJ-MPER имеет размер 119 аминокислотных остатков и молекулярную массу 14.2 кДа (рис. 1Б). Аминокислотная последовательность YkuJ-MPER (фрагменты, принадлежащие MPER, выделены жирным шрифтом и подчеркнуты): MELLELDKWASLA-NWFIITNLLWLIKTAEAANEPMQRYFEVNGEKIC-SVKYFEKNQTFELTVFQKGEKPNTYPFDNIDMVS-IEIALLLLDAWASLWNWFDITNWLWYIHHHHHH.
Методами молекулярного моделирования установлено, что участки MPER, находясь на концах химерного белка YkuJ-MPER, могут принимать конформации, характерные для эпитопов известных моноклональных антител к данному региону: 2F5 и Z13 (конформация без регулярной вторичной структуры), 4E10 и 10E8 (а-спиральная конформа-ция), при этом два антитела могут связаться одновременно с двумя районами молекулы (рис. 2). Также моделирование пространственной структуры химерного белка показало, что фрагмент, содержащий 6 а.о. гистидина, не препятствует связыванию антител с YkuJ-MPER (рис. 2).
При проектировании гена, кодирующего YkuJ-MPER, в состав нуклеотидной последовательности заложены уникальные сайты рестрикции (FauNDI, Bpu14I, Bsa29I, Sfr274I), фланкирующие участки MPER, с целью использования данного белка как платформы для получения им-муногенов, содержащих другие антигенные детерминанты ВИЧ-1 или других инфекционных агентов. Синтезированный ген YkuJ-MPER клонирован в составе плазмидного вектора pET21a.
В качестве второго носителя использовали оптимизированный вариант полипептида TBI -TBI_tag [22]. TBI в составе кандидатной вакцины
Рис. 2. Модель взаимодействия YkuJ-MPER с Fab-фрагментами МКА 2F5 и 4E10 (А) и с 10E8 (Б). А - фиолетовым цветом обозначен Fab-фрагмент антитела 2F5; синим - Fab-фрагмент антитела 4Е10. Б - зеленым цветом обозначены Fab-фрагменты антитела 10Е8. Модели построены с помощью программы PyMOL
КомбиВИЧвак прошел первую фазу клинических испытаний и продемонстрировал иммуногенность и безопасность [25]. TBI_tag отличается от TBI тем, что для эффективной экспрессии в E. coli проведена оптимизация состава кодонов его нуклеотидной последовательности, а также замена фрагмента, кодирующего 20 аминокислотных остатков белка RecA Proteus mirabilis, на последовательность, кодирующую фрагмент (7 аминокислот) белка-активатора транскрипции InfB E. coli. В данной работе концевые фрагменты TBI_tag были заменены на участки MPER ВИЧ-1, аналогичные включенным в YkuJ-MPER. Спроектированный полипептид назван MPER-TBI (156 аминокислотных остатков, 17.8 кДа).
Блок-схемы белков TBI_tag и MPER-TBI изображены на рис. 3.
Ген, кодирующий полипептид MPER-TBI, клонирован в составе плазмидного вектора рЕТ21а в рамке считывания с последовательностью, кодирующей 6 остатков гистидина.
Получение и анализ свойств рекомбинантных белков YkuJ-MPER и MPER-TBI
Белки YkuJ-MPER и MPER-TBI наработаны и очищены с помощью металл-хелатной хроматографии. Степень очистки белков оценивали с помощью электрофореза в 15% ПААГ (рис. 4). Дополнительную очистку белков и их рефолдинг проводили с помощью диализа против буферов со снижающейся концентрацией мочевины. В финальных препаратах степень очистки белков была не менее 90%.
Предсказание вторичной структуры MPER-TBI
Вторичная структура белка MPER-TBI, предсказанная с помощью программы PSSfmder, и его аминокислотная последовательность представлены на рис. 5. Согласно предсказанию, структура MPER-ТВ1 является преимущественно а-спиральной с содержанием а-спиралей 56%.
Круговой дихроизм YkuJ-MPER и MPER-TBI
Экспериментальное определение элементов вторичной структуры антигенов YkuJ-MPER и MPER-TBI проводили с помощью спектроскопии кругового дихроизма. Доля элементов вторичной структуры иммуногенов, согласно результатам измерения спектров КД в физиологическом растворе, приведена в таблице.
Согласно модели (рис. 1Б), YkuJ-MPER с концевыми районами, соответствующими эпитопам 10Е8, имеет следующее соотношение элементов вторичной структуры: 45% а-спиралей, 24% Р-тяжей. Результаты, полученные методом кругового дихроизма, согласуются с этой моделью по содержанию Р-тяжей, тогда как экспериментально определенная доля а-спиралей оказалась меньше.
TBI_tag
infB
- env(730-742)
-| env (255-266) |-| env (102-118) |-|env (309-317) |-| env (421-437) -env (827-841JM 9a9 (351-361)|-| gag (291-305)|-| (99-aT309)
6xHis
4
MPER-TBI
infB
MPER
IH env (102-118)H env (309-317) H env (421-437) -
env (730-742) env (827-841)
MPER
6xHis
Рис. 3. Схематическое изображение структуры иммуногенов TBI_tag и MPER-TBI. Темным фоном выделены В-клеточные эпитопы, светлым фоном -Th-эпитопы. InfB - фрагмент белка-активатора транскрипции E. coli InfB; 6xHis - шесть аминокислотных остатков гистиди-на; MPER - участки мембра-но-проксимальной наружной области ВИЧ-1
кДа
85-
60- -
40-
30 -
20 -
Рис. 4. Электро-фореграмма белков MPER-TBI
(2) и YkuJ-MPER
(3), 1 - маркер молекулярной массы
Рис. 5. Аминокислотная последовательность и вторичная структура белка MPER-TBI. Синим обозначены неупорядоченные области, красным - а-спирали, зеленым обозначены Р-тяжи. Метод предсказания -PSSfinder
10
Предсказанная модель вторичной структуры MPER-TBI (рис. 5), согласно которой доля а-спиралей равна 56%, незначительно отличается от результатов КД, так как по полученным данным MPER-TBI содержит 68% а-спиралей и не содержит Р-тяжей.
Дот-блот-анализ белков
Для анализа антигенных свойств эпитопов bNAbs 4E10, 10E8 и 2F5, входящих в MPER в составе белков YkuJ-MPER и MPER-TBI, проведен дот-блот-анализ с использованием МКА 10E8, 4Е10 и 2F5 (рис. 6). В качестве контроля использовали белок TBI_tag, не содержащий эпитопы данных антител. Подтверждено, что МКА 10E8, 4Е10 и 2F5 взаимодействуют с YkuJ-MPER и MPER-TBI и не взаимодействуют с контролем.
Анализ иммуногенности белков
Анализ иммуногенности проводили на кроликах. Две группы животных иммунизировали очищенны-
1 2 3
1 2 3
1 2
2F5
4Е10
10Е8
Рис. 6. Дот-блот-анализ: 1 - TBI_tag (контроль); 2 -
MPER-TBI; 3 - YkuJ-MPER; 2F5, 4Е10 и 10E8 - МКА. Сверху вниз нанесены двукратные разведения соответствующих белков
Элементы вторичной структуры белков YkuJ-MPER и MPER-TBI
;
2
3
Структура Образец
YkuJ-MPER MPER-TBI
Теоретический расчет, % КД в физиологическом растворе, % Теоретический расчет, % КД в физиологическом растворе, %
а-спирали 45 26 56 68
ß-тяжи 24 26 3 0
Поворот I - 5 - 5
Поворот II - 0 - 0
Неупорядоченные структуры 31 43 41 27
Л
5
I
0 5 4
IZ
О
Преиммунные
Кролик 1
День 14
Кролик 2
День 28
Кролик 3
День 42
V*
День 56
107 108 103 104
м н 0 5 4
d
о
Преиммунные
День 14
День 28
День 42
День 56
Разведение сывороток
Рис. 7. Результаты ИФА сывороток кроликов, иммунизированных MPER-TBI или YkuJ-MPER. Л - группа кроликов, иммунизированных MPER-TBI: в качестве антигена сорбирован белок MPER-TBI. Б - группа кроликов, иммунизированных YkuJ-MPER: в качестве антигена сорбирован белок YkuJ-MPER. По оси Y отложено значение ОП, 450 нм, по оси X - разведения сывороток. Данные на графиках представлены как среднее значение и стандартное отклонение
0
Б
4
0
0
ми препаратами белков YkuJ-MPER или MPER-TBI (см. «Экспериментальную часть»). Специфическую активность сывороток исследовали в ИФА, сопоставляя с контролем - сыворотками, полученными от кроликов до иммунизации. Показано, что в сыворотках крови обеих групп иммунизированных животных содержатся антитела, специфичные к исследуемым иммуногенам. После четвертой иммунизации титры антител в сыворотках кроликов, иммунизированных MPER-TBI, составляли 1 : 1 000000, а в сыворотках кроликов, иммунизированных YkuJ-MPER, - 1 : 3 000000 (рис. 7). В обеих группах титры возрастали от первой до третьей иммунизации. Сигнал преиммунных сывороток в ИФА был на уровне фона.
Анализ перекрестной иммуногенности белков
Для проверки способности сывороток связываться с «чужим» антигеном проведен перекрестный ИФА (анализировали способность сывороток животных, иммунизированных MPER-TBI, взаимодействовать с белком YkuJ-MPER, а сывороток животных, иммунизированных YkuJ-MPER, - с MPER-TBI) (рис. 8 и 9 соответственно). Показано, что сыворотки животных перекрестно взаимодействуют с соответствующими антигенами. При этом при иммунизации MPER-TBI значения титров антител сывороток крови всех животных данной группы на антиген YkuJ-MPER были равны 1 : 400 000 (рис. 8). Титры анти-
тел сывороток крови животных, иммунизированных YkuJ-MPER, когда в качестве антигена сорбирован MPER-TBI, равны 1 : 1 000 000 (рис. 9).
Анализ специфичности сывороток иммунизированных животных
С помощью тест-системы New Lav Blot I исследовано наличие в сыворотках антител, специфичных к белкам ВИЧ-1. Установлено, что сыворотки, полученные от кроликов, иммунизированных как MPER-TBI, так и YkuJ-MPER, содержат антитела к белкам gp160 и gp41 (рис. 10). Сыворотки группы животных, иммунизированных MPER-TBI, дополнительно распознают gp120.
ОБСУЖДЕНИЕ
Мембрано-проксимальная наружная область ВИЧ-1 считается одной из наиболее перспективных мишеней для разработки иммуногенов, индуцирующих bNAbs [14]. Тем не менее, до сих пор не удалось создать иммуноген, способный обеспечить надежное формирование bNAbs, специфичных к этой мишени [18, 19]. Для повышения эффективности презентации эпитопов MPER иммунной системе их можно включать в состав молекул-носителей, полученных при помощи рационального дизайна. Стратегия прайм-буст иммунизации с использованием таких конструкций может позволить повысить иммунный ответ на встроенные эпитопы [26-28].
л
л
Преиммунные
Иммунные
о 1- « ■ ■
102 103 104
105
Преиммунные
Кролик 1 Кролик 2 Кролик 3
106 103 104 105 106 107 108 Иммунные
102
103 104
105
106
0
103 104 105 106 107 108
Разведение сывороток
Преиммунные
Иммунные
102
43 2 1
Кролик 1 Кролик 2 Кролик 3
102
103 104 105 106 103 104 105 106 107 108
Преиммунные Иммунные
4
3 2 1 0
103 104 105 106 103 104 105 106 107 108
Рис. 8. Результаты ИФА сывороток группы кроликов, иммунизированных MPER-TBI. Л - в качестве антигена сорбирован белок MPER-TBI; Б -в качестве антигена сорбирован белок YkuJ-MPER. Преиммун-ные - сыворотки интактных животных, иммунные - сыворотки животных после 4-й иммунизации
Рис. 9. Результаты ИФА сывороток группы кроликов, иммунизированных YkuJ-MPER. Л - в качестве антигена сорбирован белок YkuJ-MPER; Б -в качестве антигена сорбирован белок MPER-TBI. Преиммунные -сыворотки интактных животных, иммунные - сыворотки животных после 4-й иммунизации
Разведение сывороток
В данной работе сконструированы два иммуноге-на на основе белковых носителей с разной пространственной организацией. Их использование в стратегии прайм-буст иммунизации может позволить избежать нежелательного иммунного ответа на сам носитель. В качестве носителей мы выбрали: глобу-
лярный белок B. subtilis YkuJ с известной третичной структурой и охарактеризованный нами ранее искусственный полипептид TBI_tag.
Экспериментальное определение вторичных структур иммуногенов в физиологическом растворе методом КД позволило получить результаты,
Б
2
0
Б
Рис. 10. Анализ сывороток крови животных, иммунизированных белками MPER-TBI и YkuJ-MPER, с использованием коммерческой тест-системы New Lav Blot I. 1 - положительный контроль из набора New Lav Blot I; 2 - сыворотки кроликов, иммунизированных MPER-TBI; 3 - сыворотки кроликов, иммунизированных YkuJ-MPER; 4 - преиммун-ные сыворотки кроликов
согласующиеся с теоретически предсказанными структурами. Структура MPER-TBI оказалась преимущественно а-спиральной, что согласуется с предсказанной методом PSSfinder вторичной структурой. Количество Р-тяжевых элементов в YkuJ-MPER согласуется с построенной моделью пространственной структуры, а доля а-спиралей меньше по сравнению с моделью, в которой оба встроенных участка MPER имеют а-спиральную конформацию, соответствующую эпитопу антитела 10Е8. Это говорит в пользу того, что центральный Р-лист YkuJ-MPER остается стабильным, а встроенные эпитопы являются гибкими, как и предполагалось.
Оба иммуногена оказались хорошо растворимыми в физиологических условиях. Одна из известных проблем MPER как иммуногена - его гидрофобность [20], и, как и ожидалось, наши конструкции позволили ее преодолеть.
Результаты дот-блот-анализа показали, что YkuJ-MPER и MPER-TBI могут специфически взаимодействовать с МКА 4Е10 и 10Е8, которые связываются с MPER в а-спиральной конформации, а также с антителом 2F5, которое связывается с MPER в конформации без регулярной вторичной структуры [14]. Полученный результат косвенно указывает на кон-формационную подвижность встроенного участка MPER. Нами не была проведена экспериментальная проверка того, сколько молекул антител может
связаться с одной белковой молекулой YkuJ-MPER, но модели показывают, что существует принципиальная возможность связывания сразу двух антител. Также предполагается, что MPER-TBI может связывать одновременно два антитела, так как его структура достаточно подвижна, и это предположение тоже нуждается в экспериментальной проверке.
Иммунизация лабораторных животных очищенными препаратами белков показала, что в организме кроликов формируются специфичные антитела, титры которых возрастают уже после первой иммунизации. Более того, установлено, что антитела, возникающие в результате иммунизации YkuJ-MPER, взаимодействуют с MPER-TBI, и наоборот. Поскольку, за исключением гистидиновой метки (6 а.о. His), у YkuJ-MPER и MPER-TBI нет общих фрагментов, кроме MPER-области, можно предположить, что эти конструкции вызывают индукцию анти-MPER-антител.
С помощью тест-системы New Lav Blot I показано, что антитела, полученные при иммунизации животных как YkuJ-MPER, так и MPER-TBI, взаимодействуют с сорбированными белками ВИЧ, а именно с gp41 и gp160 (рис. 10). Кроме того, MPER-TBI индуцирует образование антител, распознающих белок gp120, благодаря тому, что в состав белка-носителя TBI_tag входят фрагменты gp120 ВИЧ-1 (env 102— 118, env 309-317 и env 421-437).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В работе разработаны два иммуногена, способные обеспечить индукцию анти-MPER-антител: один из них создан на основе белка YkuJ, который ранее не использовали в качестве носителя вирусных эпи-топов, второй - на базе хорошо изученного нами ранее иммуногена TBI. Показано, что химерные белки взаимодействуют с bNAbs, мишенями которых служит MPER ВИЧ-1. Результаты перекрестных проверок иммуногенных свойств YkuJ-MPER и MPER-TBI и иммуноблота с белками ВИЧ-1 свидетельствуют, что обе конструкции способны обеспечить формирование анти-MPER-антител у иммунизированных животных. Проведено предварительное исследование структурных особенностей разработанных имму-ногенов. Результаты исследования и химерные белки (YkuJ-MPER и MPER-TBI) могут служить основой для разработки иммуногенов, фокусирующих гуморальный иммунный ответ на регионах уязвимости ВИЧ-1.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-34-00314.
12 3 4
gp160—> H « - и
gp120—>
р55 -
gp41 —> я i?
»»
р24/25—> *
р18/17—>
■ - т.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Eisinger R.W., Fauci A.S. // Emerg. Infect. Dis. 2018. V. 24. № 3. P. 413-416.
2. Durova O.M., Vorobiev I.I., Smirnov I.V., Reshetnyak A.V., Telegin G.B., Shamborant O.G., Orlova N.A., Genkin D.D., Bacon A., Ponomarenko N.A., et al. // Mol. Immunol. 2009. V. 47. № 1. P. 87-95.
3. Huang J., Kang B.H., Pancera M., Lee J. H., Tong T., Feng Y., Imamichi H., Georgiev I.S., Chuang G., Druz A., et al. // Nature. 2014. V. 515. № 7525. P. 138-142.
4. Sok D., Burton D.R. // Nat. Immunol. 2018. V. 19. № 11. P. 1179-1188.
5. Hessell A.J., Rakasz E.G., Tehrani D.M., Huber M., Weisgrau K.L., Landucci G., Forthal D.N., Koff W.C., Poignard P., Wat-kins D.I., et al. // J. Virol. 2010. V. 84. № 3. P. 1302-1313.
6. Pegu A., Hessell A.J., Mascola J.R., Haigwood N.L. // Immunol. Rev. 2017. V. 275. № 1. P. 296-312.
7. Subbaraman H., Schanz M., Trkola A. // Retrovirilogy. 2018. V. 15. № 1. P. 1-14.
8. Vzorov A.N., Uryvaev L.V. // Mol. Biol. 2017. V. 51. № 6. P. 819-829.
9. Saunders K.O., Verkoczy L.K., Jiang C., Zhang J., Parks R., Chen H., Housman M., Bouton-Verville H., Shen X., Trama A.M., et al. // Cell. Rep. 2017. V. 21. № 13. P. 3681-3690.
10. Haynes B.F., Moody M.A., Alam M., Bonsignori M., Verkoczy L., Ferrari G., Gao F., Tomaras G.D., Liao H., Kelsoe G. // J. Allergy Clin. Immunol. 2014. V. 134. № 1. P. 3-10.
11. Shcherbakov D.N., Bakulina A.Y., Karpenko L.I., Ilyichev A.A. // Acta Naturae. 2015. V. 7. № 4. P. 11-21.
12. Montero M., Houten N.E., Wang X., Scott J.K. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2008. V. 72. № 1. P. 54-84.
13. Williams L.D., Ofek G., Schätzle S., McDaniel J.R., Lu X., Nicely N.I., Wu L., Lougheed C.S., Bradley T., Louder M.K., et al. // Sci. Immunol. 2017. V. 2. № 7. P. eaal2200.
14. Liu H., Su X., Si L., Lu L., Jiang S. // Protein Cell. 2018. V. 9. № 7. P. 1-20.
15. Venditto V.J., Wieczorek L., Molnar S., Teque F., Landucci G.,
Watson D.S., Forthal D., Polonis V.R., Levy J.A., Szoka F.C. // J. Clin. Vaccine Immunol. 2014. V. 21. № 8. P. 1086-1093.
16. Ye L., Wen Z., Dong K., Wang X., Bu Z., Zhang H., Compans R.W., Yang C. // PLoS One. 2011. V. 6. № 5. P. 1-12.
17. Correia B.E., Ban Y.E., Holmes M.A., Xu H., Ellingson K., Kraft Z., Carrico C., Boni E., Sather D.N., Zenobia C., et al. // Structure. 2010. V. 18. № 9. P. 1116-1126.
18. Kelsoe G., Haynes B.F. // Immunol. Rev. 2017. V. 275. № 1. P. 79-88.
19. Irimia A., Serra A.M., Sarkar A., Jacak R., Kalyuzhniy O., Sok D., Saye-Francisco K.L., Schiffner T., Tingle R., Kubitz M., et al. // PLoS Pathog. 2017. V. 13. № 2. P. 1-20.
20. Scholz C., Schaarschmidt P., Engel A.M., Andres H., Schmitt U., Faatz E., Balbach J., Schmid F.X. // J. Mol. Biol. 2005. V. 345. № 5. P. 1229-1241.
21. Kim M., Song L., Moon J., Sun Z.Y., Bershteyn A., Hanson M., Cain D., Goka S., Kelsoe G., Wagner G., et al. // J. Biol. Chem. 2013. V. 288. № 44. P. 31888-31901.
22. Рудометов А.П., Андреева Н.Б., Чикаев А.Н., Щербакова Н.С., Каплина О.Н., Карпенко Л.И. // Сиб. научный мед. журн. 2018. Т. 8. № 4. C. 37-43.
23. Kozlowski L.P., Bujnicki J.M. // BMC Bioinformatics. 2012. V. 13. № 1. P. 1-11.
24. Perczel A., Hollosi M., Tusnady G., Fasman G.D. // Protein Eng. 1991. V. 4. № 6. P. 669-679.
25. Karpenko L.I., Bazhan S.I., Bogryantseva M.P., Ryndyuk N.N., Ginko Z.I., Kuzubov V.I., Lebedev L.R., Kaplina O.N., Reguzova A.Y., Ryzhikov A.B., et al. // Russ. J. Bioorgan. Chem. 2016. V. 42. № 2. P. 170-182.
26. Rathore U., Kesavardhana S., Mallajosyula V.V., Varadarajan R. // Biochim. Biophys. Acta. 2014. V. 1844. № 11. P. 1891-1906.
27. Zolla-Pazner S., Kong X., Xunqing J., Cardozo T., Nadas A., Cohen S., Totrov M., Seaman M.S., Wang Sh., Lu Sh. // J. Virol. 2011. V. 85. № 19. P. 9887-9898.
28. Xu K., Acharya P., Kong R., Cheng C., Chuang G.Y., Liu K., Louder M.K., O'Dell S., Rawi R., Sastry M., et al. // Nat. Med. 2018. V. 4. № 6. P. 857-867.
