CC BY
70
Перейти в содержание Вестника РНЦРР МЗ РФ N12 Текущий раздел: Молекулярная медицина
Исследование сорбционных свойств наночастиц USPIO меченных антителами.
Шишкин А.М. 1, Иванов А.В. 1, Кудинова Е.А.1, Кулинич Т.М.1, Жигулин А.О. 2, Боженко В К. 1
1 ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития РФ, г.Москва.
2 ЗАО «Силекс»
Адрес документа для ссылки: http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v12/papers/shishkin_v12.htm Статья опубликована: 25 октября 2012 года
Контактная информация:
Рабочий адрес: 117997, Москва, ГСП-7, ул. Профсоюзная, д. 86 Шишкин Александр Михайлович - старший научный сотрудник +7(499)120-11-14 Иванов Андрей Валерьевич - к.м.н., ведущий научный сотрудник +7(499)120-11-14 Кудинова Е.А. -к.м.н., зав.к.д.л. +7(499)120-11-14 Кулинич Т.М.-к.м.н., врач к.д.л. +7(499)120-11-14
Боженко Владимир Константинович - д.м.н., профессор +7(499)120-11-14
Рабочий адрес: 119607, Москва, просп Мичуринский, д. 31, корп. 1.
Жигулин Алексей Олегович- к.б.н., Президент ЗАО «Силекс», Россия +7(499)998-42-88
Контактное лицо:
Шишкин Александр Михайлович, тел.: +7(499)120-11-14, e-mail: [email protected]
Резюме
Исследован новый класс наночастиц (НЧ), созданный на основе сверхмалых частиц суперпарамагнитного оксида железа (USPIO). Исследованы физические свойства предлагаемых наночастиц, возможность связывания белковых лигандов и стабильность получаемых комплексов. Показано, что основная часть сорбируемого белка прочно связывается с поверхностью НЧ и сохраняется в водных и белковых растворах. Получены стабильные комплексы предлагаемых НЧ с антителами к поверхностным антигенам лимфоцитов. Проведено сравнительное исследование связывания чистых антител и комплексов НЧ-антитело с лейкоцитами человека in vitro. Показана пригодность меченных АТ НЧ для избирательного маркирования клеток.
Ключевые слова: наночастицы, USPIO, моноклональные антитела
Investigation of the sorption properties of nanoparticles USPIO labeled with antibodies. Shishkin A.M., Ivanov A.V., Zhigulin A.O., Bojenko V.K.
Federal State Budget Establishment Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR) of Ministry of Health and Social Development of Russian Federation, Moscow
Summary
The properties of new class of ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles (USPIO) was investigated. It was shown, that the main part of the binding protein forms stable complexes with USPIO nanoparticles. Binding of pure CD-specific antibody and complexes nanoparticles-antibody with human leukocytes in vitro was investigated. It was shown that the labeled nanoparticles are suitable for the selective binding to target cells.
Keywords: nanoparticles, USPIO, monoclonal antibodies
Оглавление:
Введение
Материал и методы Результаты и обсуждение Выводы
Список литературы Введение
Широкий интерес, проявляемый в последнее время к изучению наночастиц (НЧ) суперпарамагнитного оксида железа USPIO, объясняется возможностями, которые несут создаваемые на их основе препараты. Прежде всего, эти наночастицы могут использоваться в качестве контраста при магнитно-резонансной томографии (МРТ) [10]. НЧ USPIO обладают низкой токсичностью и длительным временем полужизни в кровеносном русле. Имея малые размеры - до 30 нм, они не захватываются клетками ретикуло-эдотелиальной системы, что позволяет им проникать в капилляры и тканевые щели [2]. Специфическое биосовместимое покрытие НЧ и размещаемые на их поверхности лиганды и лекарственные вещества позволяют использовать их для диагностики и специфического лечения. Эти свойства получаемых комплексов можно использовать для визуализации методом МРТ [2]. Для прочного связывания необходимых лигандов применяют модификацию поверхности НЧ, используя, в частности, покрытие НЧ декстраном и применяя такие функционально активные группы как карбоксильные или аминогруппы [5]. К полученным таким образом НЧ возможно ковалентное присоединение различных классов биоактивных молекул.
Так, применение НЧ с присоединенным RGD пептидом (Arg-Gly-Asp), специфически связывающимся с аур3 интегрином - маркером ангиогенеза, позволяет визуализировать уровень ангиогенеза в опухоли [3,11].
НЧ USPIO с декстрановым покрытием использовали для улучшения визуализации метастатического поражения лимфоузлов при колоректальном раке [4].
Показано, что интернализация НЧ USPIO не ведет к изменению функционального состояния клетки, что позволяет применять их для визуализации при проведении клеточной терапии и исследовании клеточных реакций. Комплекс USPIO с иммунокомпетентными клетками используют для осуществления непрямого связывания с клетками опухоли [8,6].
Другим направлением применения НЧ USPIO является область биоинженерных разработок. НЧ, ассоциированные с биоинженерными конструкциями, позволяют прослеживать их судьбу после пересадки в организм пациента [7].
Возможна и многоступенчатая схема применения НЧ USPIO. Наиболее разработана система с использованием биотинилированных антител, специфически связывающихся с клетками мишени, и вторичным связыванием НЧ, несущими авидин или стрептавидин на своей поверхности [1].
НЧ USPIO могут быть визуализированы в экспериментальных условиях, с использованием специфической окраски полученных образцов ткани на содержание химических содинений, входящих в них, или с использованием гистохимических методов
[4].
Обширность области применения различных вариантов НЧ USPIO показывает перспективность их использования в клинической и исследовательской практике. В связи с этим представляют несомненный интерес исследования, направленные на получение новых классов НЧ USPIO со специфическими лигандами.
Цель данной работы продемонстрировать возможность специфического связывания предложенного нового типа НЧ с активированной поверхностью на примере связывания НЧ с антителами к различным поверхностным маркерам лейкоцитов человека.
Перейти в оглавление статьи >>>
Материалы и методы
Ферромагнитные НЧ с активированным силликатным покрытием были предоставлены фирмой Силекс, Россия. Перед работой частицы осаждались на центрифуге (10 мин 400g) и однократно отмывались в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) pH 7,4 .
Определение размеров НЧ призводилось методом сканирующей электронной микроскопии (электронный микроскоп "Quanta 3d",EFI).
Определение емкости НЧ по альбумину.
К раствору бычьего сывороточного альбумина (БСА) 400 мкг/мл добавлялось 10 мкл НЧ. Полученная суспензия инкубировалась 30 мин при перемешивании. НЧ осаждались на центрифуге (10мин 400g), отбирались аликвоты супернатанта. Измерение концентрации белка производилось на флюориметре Qubit (Invitrogen) набором Quan-It Protein Assay Kit и на биохимическом автоматическом анализаторе AU400 (Olympus) с использованием набора для определения белка CFS protein (Beckman-Culter, США).
Оценка прочности связывания НЧ с раствором АТ
10 мкл активированных наночастиц (НЧ) инкубировались в ФСБ в растворе меченных флюоресцентым красителем АТ (использовались АТ к CD19-PE, CD3-FITC, Beckman-Coulter). Инкубация проводилась в темноте, при перемешивании, в течение 30 мин. НЧ осаждались на угловой центрифуге (10 мин 400g), и помещались на 15 мин в магнитный сепаратор ("Dynal MPC-T4", Invitrogen) для дополнительного осаждения НЧ и облегчения отбора супернатанта без взмучивания осадка. Отбиралась аликвота среды инкубации, и производилось измерение флюоресценции на флюориметре Qubit.
Для проверки прочности связывания АТ с НЧ осадок ресуспендировался в ФСБ и инкубировался 30 мин в ультразвуковой ванне. НЧ повторно осаждались и отбиралась аликвота среды инкубации для измерения. После измерения аликвота возвращалась в образец, осадок НЧ снова ресуспендировался и инкубировался 24 часа в темноте в термостате при 37 оС без перемешивания, после чего повторялась процедура осаждения и отбора аликвоты среды инкубации и измерения флюоресценции.
Общая методика предварительной подготовки НЧ
Исходный препарат НЧ разводился в 10 раз в ФСБ. Полученная суспензия помещалась на 30 мин в ультразвуковую ванну (100 Вт, 40 кГц).
Связывание НЧ с АТ
К 10 мкл препарата НЧ добавлялось 20 мкл АТ, полученная суспензия инкубировалась в темноте при перемешивании 30 мин. НЧ дважды отмывались центрифугированием (5 мин 400-450g) или магнитной сепарацией в течение 20 мин ("Dynal MPC-T4", Invitrogen). Защита поверхности НЧ альбумином
Альбумин (БСА 10мг/мл) добавлялся к суспензии чистых или связанных с АТ НЧ в равном объеме до концентрации 5 мг/мл. После внесения альбумина препарат в пластиковой пробирке инкубировали 30 мин в ультразвуковой ванне (100 Вт 40 кГц).
Получение суспензии лейкоцитов
Образцы донорской крови, содержащие цитрат натрия, отстаивались до получения слоя плазмы (30 - 60 мин), отбирался верхний слой, обогащенный лейкоцитами плазмы. Клетки осаждались и дважды отмывались в ФСБ. К полученной суспензии клеток добавлялся лизирующий раствор. Лейкоциты повторно осаждались, ресуспендировались в ФСБ, количество клеток измерялось на гематологическом анализаторе (Advia 60, Bayer). Отмытые лейкоциты ресуспедировались в ФСБ до концентрации 150-200 тыс.кл./100 мкл. Окраска лейкоцитов
10 мкл АТ добавлялись к 100 мкл суспензии лейкоцитов (150-200 тыс. клеток). Полученная суспензия инкубировалась 30 минут в темноте (в термостате 37 °С) на опрокидывающей мешалке. Полученный препарат окрашенных лейкоцитов дважды отмывался ФСБ.
Инкубация лейкоцитов с МЧ
Меченные антителами и связанные с альбумином НЧ осаждались магнитной сепарацией в течение 20 мин и ресуспедировались в 100 мкл лейкоцитарной суспензии (150-200 тыс. клеток). Полученная суспензия инкубировалась в темноте (в термостате 37 °С) при медленном перемешивании в течение 40 мин и дважды отмывалась ФСБ (5 мин 400-450g). Инкубация всех препаратов НЧ с лейкоцитами проводилась одновременно в одних и тех же условиях.
Измерение
Полученные образцы окрашенных лейкоцитов и НЧ измерялись на проточном цитофлюориметре DAKO Galaxy (DAKO).
Перейти в оглавление статьи >>>
Результаты и обсуждение
Исследуемый образец НЧ представлял собой неоседающую при стоянии суспензию черного цвета массовой концентрации 46,5 мг/мл. Емкость по альбумину составила 68 мкг БСА на 1 мг НЧ.
По результатам электронной микроскопии средний размер НЧ составил около 40нм (Рис. 1).
Рис.1. Наночастицы, электронная микроскопия высушенного препарата НЧ.
A. Чистые НЧ. Видны образовавшиеся при высушивании конгломераты и отдельные НЧ.
B. НЧ в комплексе с альбумином.
Прочность связывания НЧ с АТ к СБ19-РЕ составила 75,7 %. В результате инкубирования в течение 30 минут в ультразвуковой ванне десорбировалось 12,3% от количества
связавшихся АТ. После суточной инкубации в термостате десорбировалось еще 3,7 %. Дальнейшая десорбция не наблюдалась. Суммарно, в течение первых суток после сорбции, десорбировалось 16% от общего количества связавшихся АТ, 84% образовало прочную связь с поверхностью наночастиц.
Связывание АТ-меченных НЧ с лейкоцитами человека in vitro
На рис 2. представлены результаты связывания лейкоцитов с моноклональными АТ к CD3-FITC.
На рис. 3 представлены результаты связывания лейкоцитов с НЧ, меченными АТ к CD3 (T-лимфоциты, флюоресцентная метка FITC) .
І
Рис. 2. Окраска лейкоцитов АТ к CD3 (FITC)
1РП
и
800 -г
Яг- 640 -1 З^и - і RN1
160 J 1
пі I Лц ,,
50 100 150 200 250
FSC -
10 100 1000 FL1 -FITC
Рис. 3. Окраска лейкоцитов НЧ, коньюгированными с АТ к CD3 (FITC)
Отношение количества окрашенных к неокрашенным лимфоцитам оказалось одинаковым в обоих случаях (рис. 3) и составило 45,2% для окраски чистыми АТ к CD3-FITC и 45,9%
- для окраски АТ конъюгированными с НЧ (рис. 4). В случае НЧ заметно некоторое снижение интенсивности сигнала по FL1, возможно, связанное с частичным экранированием флюоресценции наночастицами.
250
200
І**?
V
01* Р1 с о 1: о.оос. и« і1 Ї8 02:
04: ІІ2К
І 10 І(Ю 1090 ІІ_1 -ЇІТС
А
ко
ми
І'Я
Й
іьї
їй П Ой 1 ООй ГЬІ ГІТС
Рис. 4. Диаграмма распределения окрашенных и неокрашенные лимфоцитов. А. Окраска моноклональными АТ к CD3 ^!ТС). В. Окраска АТ, конъюгированными с НЧ.
Исследование области флуоресценции, соответствующее зоне возбуждения FITC, показало наличие большого количества не связавшихся с лимфоцитами НЧ. На рис. 5 показано, что кроме зоны, в которой располагаются лимфоциты, НЧ относительно гомогенно распределены по диаграмме.
і Оа(е: ЯКИ- Ьшій: 47ЇІ7 ■
оциты
,1
'л'Ч-'Ч'Г:1
Рис. 5. Распределение НЧ, конъюгированных с АТ к CD3-FITC.
Наличие агрегации НЧ хорошо заметно на диаграмме лейкоцитов, окрашенных АТ к общелейкоцитарному маркеру CD45.
Рис.6. Лейкоциты, окраска АТ CD45-PC5.
2И
Ш
и
50
ЗД КО 1М «0 НО Д Р5С . л
10 104 1009
115 .К*
№ 1ПС МО ¡00 250
№ -
Рис.7. Лейкоциты, окрашенные АТ CD45-PC5 и НЧ
На рисунке 6 приведены результаты окраски суспензии лейкоцитов моноклональными АТ к CD45-PC5.
На рисунке 7 представлена суспензия лейкоцитов после инкубации с НЧ.
Добавление к суспензии лейкоцитов НЧ приводит к появлению зоны частиц, гетерогенных по размеру (рис.7 А). На гистограмме распределения интенсивности флуоресценции АТ к CD45-PC5 (рис. 7 В) отмечается увеличение СУ% первого пика. Данное увеличение СУ% первого пика соответствует зоне частиц, выделенной на рис. 7 А. Можно предположить, что появление данной зоны обусловлено связыванием НЧ с мелкими объектами клеточной суспензии (фрагменты клеток, апоптозные тела), имеющими на своей поверхности антиген CD45. Количество объектов, имеющих флуоресцентную метку (рис. 7 С) меньше, чем общее количество объектов в зоне на рис. 7 А. Данный факт можно объяснить собственной агрегацией НЧ, не несущих флуоресцентную метку.
Для предотвращения образования неспецифического связывания НЧ в дальнейшем была применена защита поверхности НЧ альбумином.
Рис.8. Лейкоциты, окрашенные АТ CD45-PC5 и НЧ. А - НЧ, не обработанные
альбумином; В - НЧ, обработанные альбумином
НЧ, не обработанные альбумином, при добавлении к суспензии лейкоцитов образуют агрегаты, которые регистрируются на гистограммах как регион Q2 (рис. 8 А). Обработка поверхности НЧ альбумином приводит к минимизации процессов агрегации НЧ (рис. 8
В).
Видно (рис.8), что применение альбумина, как блокирующего агента, приводит к исчезновению неспецифической агрегации НЧ.
Перейти в оглавление статьи >>>
Выводы
Использованные ферромагнитные НЧ с активированным силликатным покрытием способны прочно связывать на своей поверхности АТ. Комплексы НЧ, конъюгированных с антителами, связываются с клетками-мишенями, несущими на своей поверхности соответствующий антиген.
Перейти в оглавление статьи >>>
Список литературы:
1. Baio G., Fabbi M., Salvi S., de Totero D., Truini M., Ferrini S., Neumaier C.E. Two-Step In Vivo Tumor Targeting by Biotin-Conjugated Antibodies and Superparamagnetic Nanoparticles Assessed by Magnetic Resonance Imaging at 1.5 T // Molecular Imaging & Biology - 2012. - V. 3. - N. 12. - P. 305-315.
2. Cheng Ch-M., Kou G., Wang X.L., Wang Sh-H., Gu H-Ch., Guo Y-J. Synthesis of carboxyl superparamagnetic ultrasmall iron oxide(USPIO) nanoparticles by a novel flocculation-redispersion process // Journal of Magnetism and Magnetic Materials - 2009. - V. 321 - P. 26632669
3. Kiessling F., Huppert J., Zhang C., Jayapaul J. et al. RGD-labeled USPIO Inhibits
Adhesion and Endocytotic Activity of avP3-Integrin-expressing Glioma Cells and Only Accumulates in the Vascular Tumor Compartment // Radiology - 2009. - V. 253 - P. 462-469.
4. Lahaye M.J., Engelen S.M.E., Kessels A.G.H., de Bruine A.P., von MeyenfeldtM.F., van
Engelshoven J.M.A., van de Velde C.J.H., Beets G.L., Beets-Tan R.G. USPIO-enhanced MR for Rectal Cancer Nodal Staging // Radiology - 2008. - V. 246 - N. 3 - P.804-811
5. Liu D., Chen Ch., Hu G. et al. Specific targeting of nasopharyngeal carcinoma cell line
CNE1 by C225-conjugated ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles with magnetic resonance imaging // Acta Biochimica et Biophysica Sinica - 2012. - V. l43 - N.4 - P. 301-306
6. Montet-Abou1K.,Daire J-L., Hyacinthel J-N., Jorge-Costa M., Grosdemange K., Mach F., Petri-Fink A., Hofmann H., MorelD.R., Valleel J-P., Montetl X. In vivo labelling of resting monocytes in the reticuloendothelial system with fluorescent iron oxide nanoparticles prior to injury reveals that they are mobilized to infarcted myocardium // European Heart Journal - 2010.
- V. 31 - P. 1410-1420
7. Nelson G.N., Roh J. D., Mirensky T.L., Wang Y., Yi T., Tellides G., Pober J.S., Shkarin P., Shapiro E.M., Saltzman W.M., Papademetris X., Fahmy T.M., Breuer C.K. Initial evaluation of the use of USPIO cell labeling and noninvasive MR monitoring of human tissueengineered vascular grafts in vivo // The FASEB Journal - 2008. - V. 22 - P. 3888-3895
8. Oude Engberink R.D., van der Pol S.M.A., Döpp E. A., de Vries H. E., Blezer E.L.A. Comparison of SPIO and USPIO for in Vitro Labeling of Human Monocytes: MR Detection and Cell Function // Radiology - 2007. - V. 243- N. 5 - P. 467-474
9. Schroeter M., Saleh A., Wiedermann D., Hoehn M., Jander S. Histochemical detection of ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) contrast medium uptake in experimental brain ischemia // Magnetic Resonance in Medicine - 2004. - V.52 - N.2 - P. 403-406
10. Weissleder R., Elizondo G., Wittenberg J.,Rabito C.A.,Bengele H.H., Josephson L. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: characterization of a new class of contrast agents for MR imaging. // Radiology - 1990. - V. 175. - N. 5. - P. 489-493
11. Zhang C., JugoldM., Woenne E.C. et al. Specific Targeting of Tumor Angiogenesis by RGD-Conjugated Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide Particles Using a Clinical 1.5-T Magnetic Resonance Scanner // //Cancer Research. -2007. - V.67. - N. 4. - P. 1555-1562 Перейти в оглавление статьи >>>
ISSN 1999-7264 © Вестник РНЦРР Минздрава России © Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России
