Исследование смены штаммов E. coli кишечного микробиоценоза поросят при применении пробиотика на основе L . Paracasei Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 579.262:636.4

ИССЛЕДОВАНИЕ СМЕНЫ ШТАММОВ E. coli КИШЕЧНОГО МИКРОБИОЦЕНОЗА ПОРОСЯТ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ПРОБИОТИКА НА ОСНОВЕ L. paracasei INVESTIGATION OF SHIFT OF E.coli STRAINS ISOLATED FROM PIGLETS' GUT MICROFLORA AT APPLICATION OF L. paracasei -BASED PROBIOTIC

Скобликов Николай Эдуардович к.м.н., Забашта Николай

Николаевич д.с.-х.н.,

Москаленко Елена Александровна к.т.н.

ФГБНУ СКНИИЖ Российская Федерация, г. Краснодар

Зимин Андрей Антонович к.б.н.

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина (ИБФМ), г.Пущино, Московская обл., Россия Skoblikow Nikolai Edwardowich, Cand. Мed. Sci., Zabashta Nikolay Nikolaevich, Dr. Sci. Agr., Moskalenko Elena Alexandrovna, Cand. Sci..Techn.

North-Caucasian Institute for Animal Husbandry, Krasnodar, Russia Zimin Andrey Antonovich Cand. Biol. Sci.

Skryabin's Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino, Moscow reg., Russia

Аннотация: охарактеризованы изоляты E.coli, выделенные от поросят, принимавших экспериментальный препарат, сконструированный на основе L. paracasei. Несмотря на схожесть биохимических фенотипов, изоляты значительно отличаются резистотипом и плазмидным профилем.

Ключевые слова: свиньи; кишечный микробиоценоз; E. coli; пробиотики.

Summary: the E.coli strains isolated from gut microflora of piglets with application of experimental probiotic characterized. The isolates considerably differ by resistotypes and plasmid profile despite similarity of biochemical phenotypes.

Key words: pigs; gut microflora; E.coli; probiotics. The reported study was partially supported by RFBR, research projects No. 11-04-96575; 12-04-90864; 13-04-00991.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научных проектов № 11-04-96575-р_юг_ц; 12-04-90864-мол_рф_нр и 13-04-00991-a.

В отличие от патогенной E.coli [1], публикаций о составе комменсальной (непатогенной) кишечной палочки микробиоты у свиней значительно меньше [2]. Ещё меньше работ, посвящённых анализу качественного состава комменсальной E.coli при применении колифаговых препаратов, успешно применяющихся в свиноводстве и демонстрирующих специфичный антагонизм в отношении патогенной E.coli - возбудителя колибактериоза (эшерихиоза) [3].

В предыдущих работах нашего коллектива была детально изучена возрастная динамика коли-титра кишечника поросят первых 2-х месяцев жизни, а также охарактеризован спектр выделяемых изолятов E.coli [4]. Однако, нам представлялось важным дать характеризацию изолятов E.coli при приёме разработанного нами экспериментального пробиотического препарата, предназначенного для профилактики колибактериоза свиней [5], выявив, таким образом, влияние приёма пробиотика на смену спектра кишечных колиформ.

Целью работы было характеризация и установление фенотипических отличий изолятов E.coli, выделенных из кишечной микрофлоры поросят первых двух месяцев жизни как при содержании на основном рационе, так и при применении экспериментального пробиотика.

Методика. Исследовано содержимое кишечного микробиоценоза двух групп животных, каждая из которых представляла собой гнездо с поросятами (от 8 до 10 поросят), содержавшимися в одинаковых условиях на одинаковом рационе. Поросята второй группы получали экспериментальный пробиотический препарат, сконструированный на основе штамма Lactobacillus paracasei, выделенного от свиней местной популяции [5]. В проведённых ранее опытах было установлено, что оптимальной схемой применения пробиотика являлось применение с интервалом 1 раз в три дня в дозе 2,0*10п КОЕ лактобактерий на голову[6]. Препарат давали животным с 17-го по 42-й день.

У всех животных отбирались образцы содержимого толстой кишки в различном возрасте: на 17-й, 21-й, 24-й, 27-й, 31-й, 35-й, 39-й, 42-й, 46-й, 53-й, 59-й, 66-й день жизни (всего 12 раз). Из отобранных образцов делали серию 10-кратных разведений и осуществляли первичный посев биоматериала на среду Эндо с последующим инкубированием при 37°С в течение 24 ч. После инкубирования отбирали изолированные колонии, подозрительные на E.coli, учитывая их морфологические особенности.

Физиолого-биохимическую идентификацию выделенных изолятов проводили, оценивая их метаболическую активность по 24 биохимическим тестам. Структурно-биохимическую идентификацию каждого изолята энтеробактерий проводили определением получаемого методом газовой хроматографии.

Спектр антибиотикорезистентности изолятов E. coli определяли диско-диффузионным методом к набору из 24 антимикробных химиотерапевтических препаратов.

Плазмидный профиль выделенных изолятов исследовали, используя щелочной метод выделения плазмидной ДНК с небольшими модификациями.

Результаты исследований и их обсуждение. В результате анализа посевов биоматериала, отбираемого от шести животных за двенадцать возрастных периодов, выделено 40 изолятов E.coli от поросят I группы (14, 16 и 10 от одного животного за весь период наблюдения) и 37 изолятов E.coli (11, 14 и 12) от поросят II группы.

Физиолого-биохимические и структурно-биохимические различия между изолятоами были незначительны.

Все выделенные в обеих группах изоляты демонстрировали резистентность к тетрациклинам и чувствительность к фторхинолонам, аминогликозидам, карбапенемам,

цефалоспоринам II и III поколения. Наибольшее разнообразие антибиотикорезистентности у наблюдалось в отношении пяти антибиотиков: ампициллина; нитрофурантоина; хлорамфеникола; цефаклора и цефуроксима.

При этом доля изолятов E.coli, чувствительных ко всем пяти указанным антибиотикам («полисенситивных») в I группе составила 42,5 %, во II группе - 64,9 %.

Было установлено, что штаммы E.coli различались количеством плазмид. Плазмиды обнаружились не у всех штаммов: Среди изолятов I группы безплазмидные штаммы составили 50,0 %, II группы - 24,3 %.

Сопоставляя данные антибиотикорезистентности и плазмидного профиля конкретных штаммов, выяснилось, что изоляты, характеризующиеся одинаковыми резистотипами и выделяемые от одного и того же животного в разные временные промежутки, не являются одними и теми же изолятами, персистирующими в кишечнике животного.

Спектр антибиотикорезистентности выделенных изолятов E.coli у поросят первых 3-9 недель жизни не коррелирует с плазмидным профилем данных изолятов; скорее всего, в развитии антибиотикорезистентности играют роль механизмы, обусловленные хромосомными генетическими детерминантами.

Список литературы

1. Nagy, B., Fekete, P. Z. (2005). Enterotoxigenic Escherichia coli in veterinary medicine. Int J Med Microbiol 295, 443-454.

2. Schierack P., Walk N., Reiter K., Weyrauch K.D. and Wieler L.H. Composition of intestinal Enterobacteriaceae populations of healthy domestic pigs. Microbiology 153 (2007), 3830-3837.

3. Smith HW, Huggins MB (1983) Effectiveness of phage treatment in experimental Escherichia coli diarrhoea in calves, piglets and lambs. J Gen Microbiol 129: 2659-2675.

3. Скобликов, Н. Э., Забашта, Н.Н., Москаленко, Е. А., Зимин, А. А. Возрастная динамика коли-титра кишечного микробиоценоза поросят в 3 - 9 недель жизни / Научные основы повышения продуктивности сельско-хозяйственных животных. Сборник научных трудов СКНИИЖ. Ч.1 / СКНИИЖ - Краснодар, 2013. - С.15-18.

4. Денисенко, Е. А., Скобликов, Н. Э. Применение кисломолочных заквасок на основе эндемичных штаммов лактобактерий в кормлении свиней // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - № 3. - С. 113-121.

5. Денисенко, Е. А., Кузнецова, Т. К., Забашта, Н. Н., Москаленко, Е. А., Скобликов, Н. Э., Головко, Е. Н., Полежаева, О. А., Глазов А. Ф. Пробиотики для свиней // Труды Кубанского

Государственного аграрного университета. - 2011. - № 31. - С. 224-228.