CC BY
13
УДК 543.422+547.458+5433
ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМЫ ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТ-ВОДА МЕТОДОМ ИК-ФУРЬЕ-СПЕКТРОСКОПИИ
Н. В. Баграташвили, Н. Ю. Игнатьева, В. В. Лунин, А. П. Свиридов, А. Н. Харланов
(кафедра физической химиии)
Были получены ИК-спектры пленок хондроитинсульфата с различным содержанием воды. Дифференциальные спектры в области валентного колебания воды (3300-3700 см-1) аппроксимировались суперпозицией трех гауссовских составляющих, сответствующих поглощению «связанных» и «свободных» ОН-групп. Показано, что доля «связанных» ОН-групп увеличивается с уменьшением общего содержания воды в системе.
Воздействие лазерного излучения на биологические ткани активно исследуется в связи с разработкой новых подходов в медицине. Лазерная сепгохондрокоррекция хрящевых тканей находится на стадии внедрения в клиническую практику [1-2]. Для оптимизации лазерного воздействия на хрящевую ткань необходима разработка методов, позволяющих
определять и контролировать степень изменения состояния биоткани. Биоткани - сложные, многокомпонентные системы, в которых взаимодействие макромолекул с водой оказывает решающее воздействие на вторичную и третичную структуры биополимеров, а также определяет надмолекулярную организацию макромолекул [3].
Важнейшими составляющими внеклеточного матрикса хрящевой ткани являются гликозаминогликаны. Эти соединения благодаря наличию полярных и частично ионизированных заместителей способствуют гипергидратации хрящевых тканей, в значительной степени определяющей механические свойства [4-5]. Хондроитинсульфат (ХС), составляющий около 80% всех гликозаминогликанов, представляет линейный полисахарид, состоящий из повторяющихся остатков Р-Б-глюкопиранозилуроновой кислоты и 2-ацетамидо-2-дезокси-в-Б-галактозпиранозил-4 (или 6) сульфата, соединенных (1^3)- и (1^4)-связями соответственно.
Цель данной работы состояла в изучении состояния вод^1 в пленках ХС методом ИК-Фурье-спектроскопии.
Экспериментальная часть
В экспериментах использовали хондроитинсульфат-А (Пика). ИК-спектры регистрировали на однолучевом Фурье-спектрофотометре «ЕОиШОХ 55/8» в диапазоне частот 1000-8000см- со спектральным разрешением 4 см4.
Для приготовления пленок на пластину из ВаР2 наносили 5%-й водный раствор ХС, который затем высушивали в среде с 60%-й влажностью при комнатной температуре (20°) и визуальном контроле однородности толщины получающейся пленки. Полученные пленки имели толщину ~20 мкм для исследований в спектральной области 10003700 см- или ~100 мкм для исследования в спектральной области 5000-8000 см~ . После измерения спектра полученной пленки содержание воды в ней корректировалось путем приведения в равновесие в замкнутом объеме эксикатора со средой с различной влажностью. Для создания 100%-й влажности среды на дно эксикатора наливали дистиллированную воду. Влажность (~15%) достигалась при помещении в эксикатор осушителя (силикагеля). В обоих случаях пленку выдерживали в эксикаторе в течение 48 ч.
Содержание воды в исходных пленках при относительной влажности 60% определяли термогравиметрическим методом на термоанализаторе «Netzsch БТЛ-409». Образцы нагревали от 20 до 120° со скоростью 5 град/мин и выдерживали при 120° в течение 1 ч. Потеря массы составила 9,72%. В этом диапазоне температур, по данным работы [6], химические превращения ХС не происходят, следовательно, указанная потеря массы связана с испарением воды.
Обсуждение результатов
На рис. 1 приведены спектры поглощения пленок ХС. Положение полос, связанных с поглощением макромолекулы ХС, совпадает с положением полос в спектрах, полученных для растворов ХС методом ИК-спектроскопии и для порошков ХС методом спектроскопии комбинационного рассеяния [7]. В ИК-спектре активны валентные колебания СН (2920 см4), С=О амидной группы М-ацетилгалакто-замина (1615 см-, амид I), деформационные колебания амидной группы (1570 см~ , амид II и 1345 см~ , амид III), симметричные деформационные колебания СН3 группы (1375 см~ ) и деформационные колебания СН2-группы
Рис. 1. ИК-спектр пленки хондроитинсульфата (для сравнения представлен ИК-спектр Н20)
Рис. 2. Дифференциальный спектр воды в пленках хондроитинсульфата при относительной влажности (%): 100-60 (1); 60-15 (2); для сравнения представлен ИК-спектр Н20 (3) кривые 4-6 представляют гауссовские составляющие полосы поглощения валентного колебания ОН-группы воды
(1410 см4), а также асимметричные и симметричные колебания) 0803- группы (1230 и 1067 см4).
Спектр поглощения в области 3000-3800 см4 представляет собой суперпозицию нескольких полос поглощения. Суммарная полоса поглощения валентных колебаний 0Н-группы воды перекрывается полосами валентных колебаний ОН- и МН-групп ХС. Поэтому для анализа истинного состояния воды использовались дифференциальные (разностные) спектры воды. Дифференциальный спектр воды в пленке определялся путем вычитания спектров пленок с большим содержанием воды из спектров пленок с меньшим содержанием вод^1 (рис. 2, кривые 1-2).
Полоса поглощения 3000-3800 см- в дифференциальном спектре воды численно аппроксимировалась суперпозицией нескольких гауссовских составляющих с варьированием всех параметров гауссовой функции. Наилучшее соответствие с экспериментальными спектрами дала аппроксимация тремя пиками (рис. 2, кривые 4-6). Эти пики могут быть отнесены к поглощению «связанными» ОН-группами (полоса поглощения 3240 см-), слабосвязанными ОН-группами (с центром 3440 см-) и свободными гидроксилами (—3600 см-) [8-11]. В качестве количественной характеристики доли связанных ОН-групп было выбрано отношение площади пика 3240 см- к общей площади полосы 3000-3700 см-1. Результаты такой обработки спектров приведены в таблице. Из этих данных видно, что количество связанных ОН-групп молекул воды
Изменение относительного количества связанных ОН-групп молекул воды в пленках хондроитинсульфата
Образец Относительная площадь пика 3240 см1
ХС-пленка (15-60% влажности) 0,70±0,05
ХС-пленка (60-100% влажности) 0,55±0,15
Вода 0,37
6200 6600 7000 7400
со, см"'
Рис. 3. Поглощение воды в пленке ХС в области обертона валентного колебания (1), для сравнения показана полоса поглощения чистой воды (2)
в пленках биополимеров существенно больше, чем в чистой воде.
На основании данных дифференциальной сканирующей калориметрии системы ХС-вода [12] и теоретического моделирования методом молекулярной динамики [13] было показано, что дисахаридное звено ХС связывает около 20 молекул воды, включая водно-мостиковые связи между остатками сахаров. Однако в наших образцах
содержание воды составляло < 20 молекул на дисахарид, поэтому все ОН-группы молекул воды могут образовывать водородные связи с полярными группами макромолекул. В ИК-спектре валентного колебания ОН это проявляется как увеличение вклада полосы 3240 см4 сильносвязанных ОН-групп. Усиление водородных связей качественно проявляется и в спектральной области обертона валентного колебания ОН 6200-7200 см 1 (рис. 3). Однако количественное описание этой полосы затруднено из-за незначительного молярного коэффициента поглощения в этой области (30 см4 [14]).
При высушивании пленок ХС относительная доля пика 3240 см 1 возрастает. По-видимому, в первую очередь десорбируются молекулы воды, менее жестко связанные с полярными группами полимера. Подобный эффект описан в работе [15], авторами которой было показано, что с уменьшением содержания воды в образцах пленок коллагена I относительная интенсивность поглощения менее «связанных» ОН-групп (3440 см-1) падает быстрее, чем интенсивность более «связанных» ОН-групп.
В водных растворах и гелях полимеров, содержащих преимущественно гидрофобные группы, число дефектов в структуре водородных связей растворителя возрастает с увеличением концентрации полимера, в ИК-спектре это проявляется как относительное увеличение поглощения в полосе 3440 см4 слабосвязанных ОН-групп и содержания воды [11-12]. Полученное нами относительное увеличение поглощения в полосе сильносвязанных ОН-групп 3240 см4 свидетельствует об упорядоченной структуре воды, связанной водородными связями с полярными группами хондроитинсульфата.
Авторы благодарят за финасовую поддержку РФФИ (грант 00-02-16263), Фонд поддержки ведущих научных школ (грант 00-15-96596) и выражают признательность проф. В. Н. Баграташвили за участие в обсуждении результатов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Helidonis E., Sobol E., Kavvalos G., Bizakis J., Christodoulou P.,
Velegrakis G., Segas J., Bagratashvili V. // Amer. J. Otolaryngol. 1993. 14. P. 410
2. Bagratashvili V.N., Sobol E.N., Omelchenko A.I., Sviridov A.P.// J.
Biomechanic. 1997. 30. P. 813.
3. Структура и стабильность биологических макромолекул / Под
ред. С.Н. Тимашофф, Дж.Д. Фасман. М., 1973.
4. Comper W. D. Physicochemical aspects of cartilage extracellular
matrix in Cartilage: Molecular Aspects. Boston; London, 1991.
5. Cohen N.P., Foster R.G., Mow V.C. // J. Orthop. Sports Phys.
Ther. 1998. 28. P. 203.
6. Peper J.S., Oosterhof A., Dijrstra P. J., Veerkamp J. H.,
Kuppeveet T. H. // Biomaterials. 1 999. 20. P. 847.
7. Bensil R., Yannis I. V., Stenley H.E.// Biochim. Biophys. Acta. 1978.
541. P. 535.
8. Water and Biological Macromolecules. L, 1993.
9. The Hydrogen Bond Schuster-Zundel-Sandorfy / Ed. Verlag North
Holland Publ. 1976. Р. 527.
10. Terada T., Maeda Ya., Kitano H.//J. Phys. Chem. 1993. 97. P. 3619.
11. Lafleur M, Rigeon M., Pezolet M.//J. Phys. Chem. 1989. 93. P. 1522.
12. Вода в полимерах / Под ред. С.П. Роуланд. М., 1984.
13. Kaufmann J., Muhle K., Hofmann H.J., Arnold K // Carbohydrate Research. 1999. 318. P. 1.
14. Wieliczka D. M., Weng S., Querry M.R. // Appl. Opt. 1989. 28. P. 1714.
15. Shibata T., Tonan K., Yasuda T., Ikawa S.-I. // Applied Spectroscopy. 1997. 51. P. 337.
Поступила в редакцию 20.04.01
4 ВМУ, химия, N° 6
