CC BY
15Органический синтез и биотехнология
УДК 543.54.921 О.В. Крюкова1, В.И. Крутиков2, В.В. Крутикова3
Принятие Конвенции о запрещении химического оружия (ХО) привело к активизации развития ряда направлений аналитической химии, связанных с обнаружением и идентификацией микроконцентраций отравляющих веществ (ОВ) в различных средах. При проведении широкомасштабных работ по утилизации отходов промышленных производств и уничтожении запасов химического оружия, в том числе снарядов, начиненных ипритом и люизитом, необходимо обратить внимание на возможные необратимые последствия для здоровья человека даже при малых дозах воздействия [1].
Анализ литературных данных показывает, что методы определения такого ОВ, как 2-
хлорвинилдихлорарсин (люизит), входящего в список токсичных химикатов в рамках Конвенции [2], развиты недостаточно по сравнению с методами определения других соединений. При этом необходимо учитывать, что особенностью персистентности люизита является образование токсичных метаболитов, как органического, так и неорганического происхождения [3].
В настоящее время обозначился оптимальный состав средств инструментального анализа токсичных химикатов, реализующих методы эффективного разделения компонентов пробы и селективного детектирования: газовая хроматография с элемент- и масс-селективными детекторами; высокоэффективная жидкостная хроматография; спектроскопия ядерного магнитного резонанса; ин-
ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМ
ПОСТХРОМАТОГРАФИЧЕСК
ОГО ПРОЯВЛЕНИЯ 2-
ХЛОРВИНИЛДИХЛОРАРСИН
А МЕТОДОМ
ТОНКОСЛОЙНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ
ЗАО «НПФ «СЕРВЭК»
190020, Санкт-Петербург, ул. Бумажная, д.17
Са нкт- П етербургский государственный технологический институт (технический университет) 190013, Санкт-Петербург, Московский проспект, 26
Определение 2-хлорвинилдихлорарсина (люизита) в связи с проблемой уничтожения химического оружия требует увеличения информативности и доступности анализа. Методом, отвечающим этим требованиям, является метод тонкослойной хроматографии. В статье рассмотрены различные детектирующие системы постхроматографического проявления, в том числе ферментативные.
Ключевые слова: 2-хлорвинилдихлорарсин, микроконцентрация, колориметрия, постхроматографический анализ, дифенилтиокарбазон, ферментативный метод, тиоловые коферменты, импрегнирование, эс-тераза.
фракрасная спектрометрия с Фурье-преобразованием; капиллярный электрофорез [4-6]. Необходимо отметить, что во всем мире существует небольшое число аккредитованных лабораторий, имеющих подобный набор средств анализа.
Решение же многих конкретных задач на объектах по уничтожению ХО достаточно эффективно может быть осуществлено с привлечением принятых в Российской армии систем химической разведки и химического контроля. Войсковые средства химической разведки (индикаторные бумаги, индикаторные пленки, газоопредели-тели и т.д.) со свойственной им высокой экспрессностью обнаружения ОВ могут рассматриваться в качестве базовых простейших средств для создания системы чрезвычайного реагирования в условиях аварийных ситуаций при уничтожении ХО [7]. Разумеется, при всей своей доступности, дешевизне и простоте аппаратурного оформления эти методы имеют ряд недостатков. К таковым следует отнести принципиальную возможность ложного срабатывания, т. е. реакции индикаторного элемента на присутствие посторонних соединений, содержащих аналогичные функциональные группы, окислителей и т. п.
Задачу повышения специфичности колориметрических методов с успехом решает метод тонкослойной хроматографии (ТСХ). Несмотря на то, что способы определения, применяемые обычно в хроматографии, не могут быть использованы для однозначной идентификации ве-
1 Крюкова ОльгаВладимировна, нач. отд. , ЗАО НПО «Сервэк», e-mail: [email protected]
2 Крутиков Виктор Иосифович, д-р хим наук, профессор, зав. каф. химии и технологии синтетических биологически активных веществ СПГТИ(ТУ), e-mail: [email protected]
3 Крутикова Вера Валентиновна, мл. науч. сотр. химии и технологии синтетических биологически активных веществ, СПбГТИ(ТУ), e-mail:[email protected]
Дата поступления - 9 апреля 2013 года
ществ, при учете значений Rf они дают информацию, позволяющую характеризовать выявленные вещества. Кроме того, метод является прямым, доступным и достаточно информативным, а его чувствительность достигает 10'4 ^ 10 мг/мл анализируемого вещества [8]. Достоверность идентификации может быть достигнута подбором различных проявляющих систем в постхроматографическом анализе. Для постхроматографического ТСХ-анализа люизита известны проявляющие системы, но ни одна из них не обладает достаточной специфичностью по отношению к 2-хлорвинилдихлорарсину [9].
Настоящее исследование посвящено изучению влияния природы компонентов известных проявляющих систем, а также поиску новых методов проявления люизита.
Результаты и обсуждения
С целью выбора оптимального состава элюента в качестве подвижных фаз использовали следующие системы растворителей: бензол-метанол (3 : 1, А), бензол-метанол (8.5 : 1.5, В), бензол-метанол (2 : 1, С), ацетон-гексан (3 : 1, й).
Сочетание подвижной фазы с сорбентом на пригодность к разделению веществ в двухкомпонентной элюентной системе оценивали по величине дискриминирующей способности йР [10].
йР = 1 - 2 * М / 1Ч*(И - 1) где N - число веществ, подвергаемых разделению на пластине, М - число пар, образованных веществами, ДЯг между пятнами которых < 0,05.
Установлено, что наилучшее разделение происходит в системе бензол-метанол в соотношении 8.5:1.5 (йР = 1.00) (таблица 1).
Таблица 1. Оценка дискриминирующей способности различных элюентных систем
Соединение Подвижность Rf а
A B C D
AsCl3 0.12 0.10 0.15 0.10
ClCHCHAsCl2 0.67 0.38 0.76 0.23
(ClCHCH)2AsCl 0.94 0.79 0.95 0.24
(ClCHCH)3As 0.96 0.96 0.97 0.27
DP 0.83 1.00 0.83 0.50
Примечание а) Величина Яг рассчитывалась как среднеарифметическое из 6 экспериментов.
Известно, что первичные галоидарсины легко окисляются под действием разнообразных окислителей до соответствующих арсоновых кислот [11]:
ЯАбСЬ + [О] + 2Н2О ^ ЯАз(О)(ОН)2 + 2НС1 Для получения аналитического эффекта подбирали окислитель, изменяющий свою окраску при восстановлении. В качестве окислителя для 2-хлорвинилдихлоарсина может выступать раствор перманганата калия, который в зависимости от рН среды и восстановительной способности соединения способен восстанавливаться до Ип1У или Мп11. Подкисление способствует восстановлению до двухвалентного марганца (строка 1 в таблице 2).
К значительно более специфичным для галои-дарсинов реакциям относятся реакции, в которых принимают участие, как атом галогена, так и трехвалентный мышьяк. Для возможного получения цветового эффекта с помощью других веществ арсины должны не только обладать восстановительными свойствами, но и образовывать в водных растворах протоны (или, для некоторых реакций, С|"-ионы).
Таблица 2 Детектирующие системы
для проявления люизита на пластинах HPTLC Silica gel 60 F254
№ Состав проявителя Индикационный эффект Чувствительность, нг
1 КМПО4, CH3COOH белое пятно на розовом фоне 200
2 KIO3, крахмал белое пятно с синими контурами на светло-коричневом фоне 50
3 дитизон в метаноле, H2SO4 желтое пятно на розовом фоне 100
4 дитизон в аммиаке, H2SO4 жёлтое пятно на голубом фоне 100
5 дитизон в хлороформе, HCIO4 или HNO3 фиолетовое пятно на светло-розовом фоне 100
6 дитизон в хлороформе, HCI или НВг или HF красное пятно на голубом фоне 100
7 дитизон в хлороформе, аммиак, HCI или НВг или HF красное пятна на голубом фоне 100
8 дитизон в хлороформе, HI желтое пятно на светло-коричневом фоне 100
9 дитизон в хлороформе, аммиак, HI белое пятно на тёмно-фиолетовом фоне 100
10 эстераза, a-THA, БАС-CI розовое пятно на фиолетово-синем фоне 100
11 a-ТНА, аммиак, БАС-CI розовое пятно на фиолетово-синем фоне 100
Одним из таких реагентов является йодат калия. Взаимодействие галоидарсина с KIO3 в растворе протекает согласно следующей схеме [11]:
RAsCl2 + H20 :5=^ RAsO + 2HCl
HCl + KI03 ^ ^ KCl + HIO3
Под действием трёхвалентного мышьяка HIO3 восстанавливается до HI, а в результате окислительновосстановительной реакции между HI и HIO3 выделяется йод, который в присутствии крахмала даёт синее окрашивание:
HI03 + 3 RAs0 HI + RAs(0)(0H)2
5 HI + HI03 - - 3 I2 + 3 H20
Вероятно, подобные превращения происходят и на хроматографических пластинах (строка 2 в таблице 2).
Специфичность обнаружения галоидарсинов характеризуется также и их способностью к комплексообра-зованию. Одним из наиболее широко применяемых ком-плексообразователей является дифенилтиокарбазон, образующий с рядом металлов внутрикомплексные соединения [12]. На рисунке 1 приведена возможная структура комплекса а-люизита с дитизоном, полученная расчетным путем. Квантово-химическую оптимизацию взаимодействия молекул осуществляли по методу Флетчера-Ривза (см. раздел Экспериментальная часть) с последующей оценкой молекулярной динамики при постоянной температуре 300 К.
Q
N=
О8'
>
Q
N
о8'
Тионная форма присутствует в основном в кислых растворах. Для щелочных растворов или растворов в некоторых протофильных растворителях характерно существование енольной формы дитизона и, возможно, комплекса тиола, например, с метиловым спиртом (рисунок 2), что приводит к изменению характера взаимодействия а-люизита с дитизоном (геометрия комплекса, распределение электронной плотности).
Q
N=
СУ'
Q
N
<у
>■
Рисунок 1. Квантово-химическая оптимизация взаимодействия молекул дитизона и 2-хлорвинилдихлорарсина
Дитизон, растворяясь во многих органических и неорганических растворителях, образует тионную или тиольную формы [12]:
Вполне вероятно, подобный эффект возможен и при использовании других сильных кислот вследствие наличия ионов гидроксония при их ионизации в воде.
Действительно, импрегнирование пластин ионизированными в растворе кислотами хлорной (рКа = -8) или азотной (рКа = -1.64) [14] сопровождалось цветовым переходом, как и при работе с серной кислотой [8] (строка 5 в таблице 2).
Совершенно иная картина наблюдалась при работе с галогенводородными кислотами. Несмотря на то, что НС1 (рКа= -7) и НВг (рКа = -9) являются относительно более сильными кислотами, чем HF (рКа=3.18), детектирование ими приводило к одинаковому кратковременному (t = 1-2 с) контрастному (красное пятно на синем фоне) эффекту (строка 6 в таблице 2). Дополнительная обработка аммиаком увеличила продолжительность существования эффекта до 3-4 минут, значительно облегчив фиксирование результата (строка 7 в таблице 2). Причины этого, вероятно, связаны с нивелированием различий в силе кислот при растворении в 25 %-ном водном растворе аммиака.
Отличие цвета пятен и фона при работе с йодистоводородной кислотой объясняется, по всей видимости, сильной восстановительной способностью HI, о чем свидетельствует окрашивание фона пластины в синий цвет -реакции йода с крахмалом, содержащимся в качестве связующего на пластинах HPTLC Silica gel 60 F254 (строки 8, 9 в таблице 2).
Известно, что люизит, наряду с кожно-нарывным, обладает еще и общеядовитым действием, вызывая инактивацию некоторых ферментов, например, содержащих в качестве кофактора дигидролипоевую кислоту [15]:
C1 H S—\
+ •>
C1 H S—^ - 2 HC1
Рисунок 2. Квантово-химическая оптимизация взаимодействия молекул дитизона и 2-хлорвинилдихлорарсина в присутствии протофильного растворителя
Вероятно, этот факт может влиять на изменение цвета пятен 2-хлорвинилдихлорарсина и общего фона при обработке пластин раствором дитизона в метаноле или аммиаке с последующим импрегнированием серной кислотой (строки 3, 4 в таблице 2).
Серная кислота, используемая в качестве второго компонента детектирующей системы [13], по-видимому, способствует окислению дифенилтиокарбазона в дифени-лтиокарбадиазон что приводит на сорбенте к обесцвечиванию фона пластины и проявлению в месте локализации 2-хлорвинилдихлорарсина комплексного соединения вышеупомянутого строения.
Таким образом, использование ферментативных методов детектирования позволяет не только идентифицировать ОВ, но и получить информацию, относящуюся к возможным физиологическим эффектам и, следовательно, к параметрам токсичности. Проявляющая система, предложенная нами для детектирования люизита на пластинах ТСХ, учитывая вышеупомянутое свойство люизита, содержала фермент - неспецифическую эстеразу, продуцируемую Bacillus subtilis, субстрат - а-ТНА - и индикатор -БАС-СІ. Последний меняет окраску в присутствии тиолят-иона, получающегося при действии фермента на а-ТНА (строка 10 в таблице 2).
Неустойчивость формы индикатора позволила упростить процесс проявления и перейти от последовательной обработки пластины реагентами к целевой системе, содержащей эстеразу, субстрат и индикатор. Дальнейшие исследования показали возможность замены в данной системе фермента раствором аммиака, под действием которого а-ТНА образует а-тионафтол (в этом случае, видимо, можно сказать о конкурирующем взаимодействии между галоидарсином, аммиаком и а-ТНА).
Следует обратить внимание, что в рассмотренных взаимодействиях принимают участие подвижные ангидридные атомы хлора и трехвалентный мышьяк. Реагенты на наличие двойной связи (бромная вода), а также на выделяющийся в результате воздействия щелочного агента на люизит ацетилен (реагент Илосвая - раствор сер-
S
S
O
O
нокислой меди, аммиака и солянокислого гидроксилами-на, взятых в определенной пропорции; в присутствии ацетилена в растворе образуется красный осадок) в наших условиях к желаемым результатам не привели. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что 2-хлорвинилдихлорарсин адсорбируется за счет образования водородных связей между атомами кислорода сила-нольных и силоксановых групп сорбента и атомами водорода двойной связи.
Таким образом, проведённые исследования детектирующих систем постхроматографического проявления 2-хлорвинилдихлорарсина на пластинах для тонкослойной хроматографии позволяют качественно и полуко-личественно оценить состав образца, а выбор элюента, проведенный на основании дискриминирующей способности системы, способствует оптимизации скорости движения 2-хлорвинилдихлорарсина в пористой среде плоского слоя сорбента.
Рассмотренные детектирующие системы для анализа 2-хлорвинилдихлорарсина предполагают возможность широкого варьирования проявляющих компонентов при определении соединения в сложной многокомпонентной матрице, позволяя подобрать наиболее контрастные и доступные системы с целью повышения надежности, чувствительности и простоты обнаружения.
Для решения практических задач анализа проведенные исследования позволяют выбрать универсальные реагенты для первичной оценки достигнутого разделения смеси неизвестного состава, а также серии реагентов, специфических для группы соединений, что, в свою очередь, может быть использовано для выделения и идентификации отдельных зон компонентов другими микроаналитическими методами.
Экспериментальная часть
2-Хлорвинилдихлорарсин (а-люизит),
ди(2-хлорвинил)хлорарсин (р-люизит) и трис(2-хлорвинил)арсин (Y-люизит) синтезировали каталитическим методом при взаимодействии трихлорида мышьяка и ацетилена с последующей фракционной перегонкой реакционной массы по методике, описанной в работе [16].
Хроматографический анализ проводили на пластинах HPTLC Silica gel 60 F254 (Merck Millipore) с использованием оборудования НПЦ «Ленхром».
Реагенты. а-Тионафтилацетат (а-ТНА) (ТУ 6090-92-91-86), эстераза (ТУ 64-13-13-83), продуцируемая Bacillus subtilis (грамположительная спорообразующая аэробная почвенная бактерия), 4,4'-бис(1-гидрокси-3,6-дисульфо-8-хлор-2-нафтилазо)-дифенилдисульфид дина-триевая соль (БАС-Cl) (ТУ 6-09-09-181-82), дифенилтио-карбазон (дитизон) (ТУ 6-09-07-1684-89). Все реактивы, использованные в анализе, имели классификацию «ч» или «чда».
Хроматографический анализ проводили с гекса-новыми растворами люизитов (концентрации 1 мг/мл, 0.1 мг/мл, 0.01 мг/мл, 0.001 мг/мл). Системы детектирования указаны в таблице 2.
Квантово-химические расчеты исследуемых соединений производили с использованием пакета программ HyperChem™ Release 8.07 for Windows Molecular Modeling System.
Настоящая работа выполнена в рамках деятельности Научно-образовательного центра «Перспективные разработки в области синтеза, технологии и анализа биологически активных веществ».
Литература
1. Голос России. Выпуск новостей 01.04.2009 http ://rus.ruvr. ru/2009/04/01/945607/
2. WHs E.R.J. In: Chemical Weapons Convention Chemical Analysis. /Ed. M.Mesilaakso. Chichester: John Wiley&Sons Ltd, 2005. P. 249-282.
3. Глухман Е.Н., Чернышова М.П., Казаков П.В. [и др.]. Оценка персистентности люизита и продуктов его природных трансформаций // Рос. хим. журн.. 2007. Т. 51. № 2. С. 67-71.
4. Рыбальченко И.В. Роль аналитической химии в обеспечении международного контроля исполнения Конвенции о запрещении химического оружия // Рос. хим. журн.. 2007. Т. 51. № 2. С. 101-108.
5. Эльбро Т., Дерет Д., Симак Р. Определение люизита и продуктов его разложения в пробах почв и воды с использованием пламенно-фотометрического и фотоионизационного детекторов в полевых условиях // Рос. хим. журн. 1995. Т. 39. С. 125-128.
6. Fowler W, Stewart D, Weinberg D. Gas chromatographic determination of the lewisite hydrolysate, 2-chlorovinylarsonous acid, after derivatization with 1,2-ethanedithiol // J. Chromatography, 1991. V. 558. P. 235-246.
7. Чеботарев О.В, Дружинин А.А, Пашинин В.А, [и др. ] Экспресс-анализ на объектах по хранению и уничтожению химического оружия с использованием табельных технических средств химической разведки и химического контроля // Рос. хим. журн., 1994. Т. 38. С. 69-73.
8. Руководство по современной тонкослойной хроматографии / Под ред. ВолошукаA.M. М.: Изд. Научного совета РАН по хроматографии. 1994. 312 с.
9. Witkiewicz Z, Mazurek М., Szulc I. Chromatographic analysis of chemical warfare agents // J. Chromatography, 1990. V. 503, Р. 293-357.
10. Stead A.H., Gill R, Wright T, Gibbs J.R. and Moffat A.C.Standartised thin layer chromatographic systems for the identification of drugs and poisons // Analyst. 1982. V. 107. P. 1106.
11. Адамович КС, Стромский В.В. Индикация ОВ // М.: изд. ВАХЗ. 1959. 639 с.
12. Sokolowski M, Rozylo I.K. TLC analysis of warfare agents under battlefield conditions, // J. Plan. Chromatography, 1993. V. 6. P. 467-471.
13. Иванчев Г Дитизон и его применение // М.: ИЛ, 1961, 450 с.
14. Гордон А., Форд Р. Спутник химика // М. Мир, 1976. 541 с.
15. Общая токсикология / Под ред. Б.А. Курляндского, В.А. ФиловаМ.: Медицина, 2002. 608 с..
16. 3. Франке Химия отравляющих веществ. Т.1., М.: Химия, 1973. 439 с.
