CC BY
17
УДК 612.124.017:577.15
ИССЛЕДОВАНИЕ ЩЕЛОЧНОГО И ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА и-НИТРОФЕНИЛАЦЕТАТА В ПЕРКОЛИРУЮЩЕЙ МИКРОЭМУЛЬСИИ ВОДА - МАСЛО НА ОСНОВЕ АОТ
Н. Л. Захарченко1*, Е. А. Ступишина1, Ю. Ф. Зуев1, В. Д. Федотов1, А. Б. Миргородская2
(Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН,420503, Казань, Лобачевского, 2/31; факс: (7-8432) 38-75-77; e-mail: zakhartchenko@sci.kcn.ru; 2Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КНЦ РАН,420088 Казань, Арбузова 8; факс: (7-8432) 75-22-53; e-mail: vos@iopc.kcn.ru)
Растворы обращенных мицелл и микроэмульсии в последнее время все чаще используют в качестве систем, моделирующих действие биокатализаторов в живой клетке. Изменение таких параметров, как температура, содержание воды, ионная сила раствора, влияет на структуру и физико-химические свойства мицелл, а также предположительно на кинетику химических реакций, протекающих в них. В свете этого были проведены реакции ферментативного и щелочного гидролиза амфифильного субстрата и-нитрофенилацетата в микроэмульсии вода - масло на основе Аэрозоля ОТ в условиях кластеризации обращенных мицелл. Было обнаружено влияние структурных свойств исследуемых микроэмульсий на кинетические параметры реакций. Изменения структуры микроэмульсий контролировали с помощью методов ЯМР-самодиффузии и электропроводности.
Катализ химических реакций в организованных средах (мицеллах, микроэмульсиях, жидких кристаллах) привлекает широкое внимание исследователей [1, 2]. Обращенные мицеллярные системы (например, микроэмульсии вода в масле) используются в качестве объектов, моделирующих механизм действия биокатализаторов [3]. Наиболее типичным анионным поверхностно-активным веществом (ПАВ), способным к образованию обращенных мицеллярных агрегатов без добавок со-ПАВ, является бис(2-этилгексил)сульфосукцинат натрия (АОТ). Структура и физико-химические свойства обращенных мицеллярных систем зависят от ряда параметров, таких, как температура, содержание воды, ионная сила раствора [4]. Хотя псевдофазная модель мицеллярного катализа [5] не учитывает геометрию частиц, логично предположить, что изменение указанных параметров и сопутствующая ему модификация агрегатов будут оказывать влияние на химические реакции, протекающие в мицеллах. В обращенных мицеллах на основе АОТ с повышением температуры наблюдается так называемый феномен перколяции [6], обусловленный образованием кластеров в мицеллярной системе, появление которых может существенно отразиться на кинетических параметрах реакций.
Ранее при изучении кинетики щелочного гидролиза О-этил-О-я-нитрофенилхлорметилфосфоната в обращенной мицеллярной системе АОТ - декан - вода авторами [7] было показано изменение реакционной способности субстрата выше порога перколяции [8, 9].
Целью настоящей работы является выяснение наличия аналогичной зависимости для щелочного и ферментативного гидролиза я-нитрофенилацетата (ПНФА) в обращенной мицеллярной системе АОТ - декан - вода до и после порога перколяции.
Методы исследования
В качестве реакционной среды была выбрана микроэмульсия вода - масло, представляющая собой дисперсию водных микрокапель, стабилизированную монослоем АОТ в декане. Концентрация АОТ (САОТ ) составляла 0,42 М, молярное отношение воды к ПАВ (^0) - 20.
Данные о структуре микроэмульсии получали с помощью метода Н1 ЯМР с Фурье-преобразованием и импульсным градиентом магнитного поля. Диффузионные измерения выполняли с помощью модифицированного ЯМР спектрометра «ТЕБ1Л ББ-587Л» на частоте резонанса протонов 80 МГц. Значение импульсного градиента магнитного поля достигало 50 Гс/см. Измерения электропроводности проводили на приборе ОК 102/1 («КайеШз», Венгрия) с измерительной частотой 80 Гц и 3 кГц. Исследования выполняли в интервале температур 10-60°.
Кинетические измерения гидролиза ПНФА проводили на спектрофотометре «иУ-У18 8РЕСОЯБ М40» в термо-статируемой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см в интервале от 19 до 57°. За протеканием процесса следили по изменению оптической плотности растворов при длине волны 412 нм (образование я-нитрофенолят-аниона). Щелочной гидролиз проводили в условиях псевдопервого порядка: концентрация №ОИ в водной фазе составляла 0,05-0,2 М, исходная концентрация ПНФА - 4-10-5 М.
Ферментативный гидролиз ПНФА трипсином протекал в буферном растворе (0,1 М Трис - HCl; pH 8,1). Субстрат вносили в микроэмульсию в спиртовом растворе. Концентрация этанола в водной фазе микроэмульсии составляла 1%. По данным авторов [10] этанол такой концентрации не оказывает заметного влияния на каталитическую активность фермента. При определении максимальной скорости реакции (^макс) и константы Михаэлиса (^М) [11] использовали преобразование Лайнуивера-Бер-ка и метод наименьших квадратов.
Поскольку трипсин является гидрофильным белком, то для расчета каталитической константы скорости реакции ^кат = ^макс /Е0 [11] начальную концентрацию фермента (E0) оценивали на водный пул микроэмульсии (она составила 2,510 5 М), а начальные концентрации субстрата (S0) рассчитывали на весь объем микроэмульсии (вследствие амфифильности свойств ПНФА) и варьировали от 510-4 до 23 10-4 М.
Результаты исследования
На спектре Н1 ЯМР исследуемой микроэмульсии можно выделить три основные линии: отдельная линия воды (4,50 м.д.) и две близлежащие линии -CH2- и -CH3 (1,24 и 0,84 м.д. соответственно), в которые дают вклад сигналы от протонов АОТ и декана. Были получены коэффициен-
Рис. 1. Зависимость: а - коэффициентов самодиффузии воды и АОТ от температуры в обратной микроэмульсии АОТ - вода - декан (САОТ = 0,42 М, Ж0 = 20); б - электропроводности микроэмульсии от температуры
ты самодиффузии (КСД) для каждой из компонент микроэмульсии. Температурная зависимость КСД воды и АОТ представлена на рис. 1, а. Дисперсионная среда (декан) характеризуется КСД, порядок величины которого 10-9 м2/с. Температурная зависимость КСД дисперсионной среды слабо отличается от чистого декана и здесь не приведена.
Среди особенностей диффузионного поведения компонент микроэмульсии можно отметить то, что КСД воды и АОТ имеют близкие значения в области низких температур. С ростом температуры наблюдается резкое увеличение КСД воды и АОТ, причем их температурная зависимость имеет характерный 8-образный вид.
Исследуемая микроэмульсия была использована как среда для проведения щелочного и ферментативного гидролиза ПНФА.
В одном случае в качестве нуклеофила выступает гид-роксид-ион, во втором - вода, действие которой катализируется присутствием гидролитического фермента трипсина (на приведенной ниже схеме опущены стадии, характерные для ферментативного процесса: образование фермент-субстратного комплекса, ацилирование фермента и последующее деацилирование):
СН3С(0)0С6Н4:Ш2- р + ОН- (или Н2О) ^ ^ СН3 С(0)0Н + -0С6Н4Ы02- р.
В условиях стационарной кинетики получены наблюдаемая константа скорости первого порядка коЫ процесса щелочного гидролиза, а также каталитическая константа и константа Михаэлиса-Ментен, характеризующие ферментативные процессы. Линейность зависимости наблюдаемой константы скорости гидролиза ПНФА от концентрации щелочи (при концентрациях №0Н, равных 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 М, константа коЫ составляет 0,0017; 0,007; 0,0132; 0,0207 с-1 соответственно) свидетельствует о том, согласно [12], что именно химическое взаимодействие, а не переход эфира из органической фазы к границе раздела фаз определяет скорость процесса. На рис. 2, а представлена зависимость каталитической константы (ккат) от температуры при ферментативном гидролизе ПНФА, а на рис. 2, б - зависимость коЬз от температуры для щелочного гидролиза ПНФА в системе аррениусовских координат.
Обсуждение результатов
Диффузионное поведение компонент микроэмульсии можно объяснить с точки зрения процесса кластеризации микрокапель [8, 9]. Известно, что с увеличением температуры или объемной доли дисперсной фазы 8 в микроэмульсиях вода - масло на основе АОТ наблюдается процесс агрегации микрокапель в кластеры. Этот процесс, с одной стороны, резко увеличивает скорость обмена обратных мицелл своим содержимым, а с другой -уменьшает их площадь контакта с органической средой. Наиболее явно процесс агрегации обратных мицелл проявляется в электропроводности микроэмульсии (о) (рис. 1, б) и связан с явлением электрической перколяции, при этом точка максимальной крутизны Т на температурной зави-
симости о соответствует образованию в системе первого «бесконечного» кластера.
С ростом температуры КСД воды растет, так как решающим становится вклад диффузии по водным каналам в пределах кластеров. При этом появляется путь для движения противоионов натрия, что проявляется в резком увеличении электропроводности микроэмульсии. Точки перегиба на зависимостях Б и о достаточно хорошо совпадают и дают температуру образования первого «бесконечного» кластера вблизи Т = 31,5°. Кроме того, образование трехмерной кластерной структуры из микрокапель, соединенных водными каналами, ведет также к росту КСД молекул АОТ. В этом случае решающим становится вклад диффузии молекул АОТ по поверхности кластеров.
Детергентные микроэмульсии, являясь оптически прозрачными и макроскопически однородными, обладают микрогетерогенностью. В их составе можно выделить три микрообласти (водное ядро, поверхностный слой и масля-
Рис. 2. Зависимость: а - отношения каталитической константы к константе Михаэлиса для реакции ферментативного гидролиза ПНФА трипсином от температуры для обратной микроэмульсии АОТ - вода
- декан (СА
0,42 М, W0 = 20); б - наблюдаемой константы скорости
щелочного гидролиза ПНФ 0,1 н. раствором №0Н от температуры для той же микроэмульсии
Константы Михаэлиса для гидролиза ПНФА трипсином в микроэмульсии вода - масло (Ж = 20, САОТ = 0,42) в исследуемом диапазоне температур
T, "C 19 23 26 30,5 34 37 40 43 49 55 57
Km • 103, М 7,58 5,41 5,73 4,33 4,41 5,50 4,18 6,39 4,62 3,40 4,10
Примечание. В водном буферном растворе при T = 25° и pH 7,5 k = 9,5-Ю-1 c 1, КМ = (30 + б) 10 б М [14].
ная фаза), каждая из которых характеризуется специфическими свойствами. При использовании микроэмульсий в качестве реакционной среды скорость химических процессов, протекающих в ней, будет определяться локализацией реагентов и свойствами микроокружения. ПНФА хотя и является амфифильным соединением, распределен главным образом в масляной фазе и в поверхностном слое (коэффициент распределения между углеводородом и водой равен 10,8 [13]). Второй реагент (высокогидрофильный гидроксид-ион или трипсин) сконцентрирован в водном пуле. Следовательно, можно предположить, что реакция будет происходить на границе раздела фаз, и площадь контакта будет определять скорость химического процесса.
При обсуждении кинетики щелочного гидролиза ПНФА следует принимать во внимание, что отрицательный заряд головных групп АОТ препятствует концентрированию гид-роксид-иона на поверхности раздела фаз, что приводит к замедлению в ~200 раз по сравнению с водными растворами щелочи той же концентрации.
Изменение структуры микроэмульсии в результате кла-стерообразования может привести к изменению структуры поверхностного слоя мицелл. Логично предположить, что это отразится на кинетических параметрах реакции щелочного гидролиза ПНФА. На рис. 2, б показано, что в области кластерообразования меняется наклон аррениу-совской зависимости наблюдаемой константы скорости реакции (&оЫ) изучаемого процесса. Температурный рост скорости реакции расщепления ПНФА снижается при Т > 27°, т.е. вблизи порога перколяции (Т = 31,5°). Подобное поведение наблюдалось авторами ранее для О-этил-О-п-нитрофенилхлорметилфосфоната в той же системе на основе АОТ [7]. Изменения в скоростях реакции могут быть связаны с уменьшением площади межфазной поверхнос-
ти и с изменением свойств поверхностного слоя АОТ, вызванного кластерообразованием. В случае ферментативного гидролиза ПНФА прежде всего следует отметить отличия в каталитической активности трипсина в исследуемой микроэмульсии по сравнению с водой. Изменения претерпевает главным образом константа Михаэлиса (увеличение в микроэмульсии приблизительно на 2 порядка), зависящая от распределения субстрата в системе обращенных мицелл. Температура практически не влияет на КМ (таблица). Величина &кат, отражающая реакционную способность фермента и связанная с его состоянием в мицелле, при 25° оказывается величиной одного порядка для микроэмульсий и для водных растворов (примечание). Значение этого параметра растет по мере роста температуры в соответствии с уравнением Аррениуса, явных изменений наклона зависимости ^ &кат = Д1/7) вблизи порога перколяции обнаружено не было (рис. 2, а). Вероятно, из-за того, что ПНФА не является специфическим субстратом в отношении трипсина, в этом процессе не удается уловить изменения активности фермента, связанные с влиянием среды при переходе от воды к обратным мицеллам или вызванных перестройкой межфазного слоя при кластерообразовании. При Т > 35° наблюдается температурный оптимум активности трипсина, что согласуется с литературными данными [15].
Таким образом, можно сделать вывод о том, что кластеризация обращенных мицелл оказывает заметное влияние на скорость щелочного гидролиза ПНФА. В случае ферментативного гидролиза этого субстрата такого влияния не было обнаружено. Различие реакционного поведения субстрата отражает, по-видимому, разную чувствительность реагентов к изменению их локализации и микроокружения, вызванному структурными перестройками микроагрегатов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Левашов А.В., Клячко Н.Л., Мартинек К. // Биоорган. химия.
1981. 5. C. б70.
2. Миргородская А.Б., Кудрявцева Л.А., Иванов Б.Е. // Изв. АН,
cер. хим. 199б. C. 33б.
3. Мартинек К., Левашов А.В., Хмельницкий Ю.А., Клячко Н.Л.
/ Физико-химические проблемы ферментативного катализа. М., 1984. С. 18.
4. Leodidis E.B., Hatton T.A. // Langmiur. 1989. 5. Р. 741.
5. Garcia-Rio L., Leis J.R., Pena M.E., Iglesias E // J. Phys. Chem.
1993. 97. Р. 3437.
6. Mays H. // J. Phys. Chem. 1997. 101 Р. 10271.
7. Zakharova L.Y., Valeeva F.G., Kudryavtseva L.A., Zakhartchenko
N.L., Zuev Y.F. // Mendeleev Commun. 1998. б. Р. 207.
8. Alexandridis P., Holzwarth J.F., Hatton T.A. // J. Phys. Chem. 1995.
99. Р. 8222.
9. Feldman Y., Kozlovich N., Alexandrov Y., Nigmatullin R., Ryabov Y.
// Phys. Rev. 1996. 54. Р. 5420.
10. Гладилин А.К., Левашов А.В. // Биохимия. 1998. 63. Р. 408.
11. Фершт Э. // Структура и механизм действия ферментов. М., 1980.
12. Menger F.M., Donohue J.A., Williams R.F. // J. Am. Chem. Soc.
1973. 95. Р. 286.
13. Bhattacharya S., Senhalatha K. // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1996. 2. Р. 2021.
14. Клесов А.А., Федосеев В.Н., Киррет О.Г. // Биохимия. 1977. 42. С. 1939.
15. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М., 1969.
Поступила в редакцию 20.06.00
