CC BY
36
УДК 618.3:616.13-018.74-092.4
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ДИСТАНТНОГО ИШЕМИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ В КОРРЕКЦИИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ КОРОТКИМИ ЭПИЗОДАМИ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ В УСЛОВИИ ADMA-ПОДОБНОГО ГЕСТОЗА
© Гуреев В.В.
Кафедра клинической фармакологии и фармакотерапии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: produmen@yandex. ru
Моделирование экспериментального ADMA-подобного гестоза осуществляли путем введения крысам L-NAME с 14-х по 20-е сутки беременности. У животных наблюдалось повышение артериального давления, протеинурия, нарушение микроциркуляции в плаценте, нарушение регуляции сосудистого тонуса и деструктивные изменения в плаценте ишемического генеза. Воспроизведение коротких эпизодов ишемии-реперфузии приводило к выраженной коррекции морфофункциональных нарушений, возникающих при моделировании экспериментального гестоза. Это выразилось в снижении артериального давления, уменьшении протеинурии, увеличении показателя микроциркуляции в плаценте, восстановлении вазодилатирующей функции сосудов и предотвращении деструктивных явлений в плаценте по сравнению с группой не леченых животных. Введение селективного блокатора iNOS - аминогуанидина или блокатора АТФ-зависимых К+ каналов - глибенкламида практически полностью устраняло протективное влияние коротких эпизодов ишемии-реперфузии. Об этом свидетельствует возвращение исследуемых нами показателей, кроме коэффициента эндотелиальной дисфункции, к уровню, статистически не отличающемуся от группы не леченых животных. Приведенные данные позволяют говорить о значительной роли биологических процессов, протекающих при феномене ишемического прекондиционирования в реализации положительных эффектов коротких эпизодов ишемии -реперфузии в коррекции морфофункциональных нарушений, возникающих при моделировании ADMA-подобного гестоза.
Ключевые слова: крысы, преэклампсия, L-NAME, лечение, ишемическое прекондиционирование, аминогуани-дин, глибенкламид.
STUDY OF DISTANT ISCHEMIC PRECONDITIONING ROLE IN THE CORRECTION OF MORPHO-FUNCTIONAL CHANGES BY SHORT ISCHEMIC REPERFUSION EPISODES
IN ADMA-LIKE PREECLAMPSY
Gureev V. V.
Clinical Pharmacology & Pharmacotherapy Department of Kursk State Medical University, Kursk
Experimental ADMA-like preeclampsy in rats was achieved by L-NAME administration from 14 up to 20 days of gestation. In animals, there were an increase in blood pressure, proteinuria, impaired placenta microcirculation, impaired regulation of vascular tone and ischemic destructive changes in placenta. Short ischemic reperfusion episodes lead to the prominent correction of morpho-functional changes occurring in the experimental preeclampsy model. It was expressed in the hypertension reduction, proteinuria deterioration, increase in placenta microcirculation, recovery of vasodilator function of blood vessels and prevention of the destructive changes in placenta compared with untreated animals. Administration of selective iNOs blocker Aminoguanidine or ATP-sensitive K+ channels blocker Glibenclamide eliminates the protective effect of short episodes of ischemic reperfusion. That was confirmed by the return of studied parameters except for the coefficient of endothelial dysfunction to a level not statistically different from that one of untreated animals. The obtained results suggest the significant role of biological processes at the phenomenon of ischemic preconditioning in the implementation of positive effects of short episodes of ischemic reperfusion in the correction of morpho-functional changes occurring in experimental ADMA-like preeclampsia.
Keywords: rats, preeclampsy, L-NAME, treatment, ischemical preconditioning, Aminoguanidine, Glibenclamide.
История открытия и изучения ишемического прекондиционирования насчитывает более 20 лет [17]. Это явление заключается в увеличении устойчивости к ишемии ткани или органа после кратковременного эпизода ишемии-реперфузии. В первые годы основные исследования проводились в направлении изучения изменений в органе, непосредственно подвергшемся ишемическому прекондиционированию. Ишемия является одним из наиболее сильных и универсальных стимулов в организме. Ишемическое повреждение одного
органа не может не отражаться на состоянии соседних органов и вызывает перестройку в функционировании различных систем целого организма. Именно поэтому в последнее время все больший интерес вызывают исследования не только локальных явлений после эпизода ишемии-реперфузии или его влияния на реологию и тромбообразующие свойства крови [11], но и события, происходящие в соседних органах (дистантное ишемическое прекондиционирование) [2, 7, 12, 15].
Во время отсроченной фазы ишемического прекондиционирования происходит активация генома. Включается индукция синтеза оксида азота, супероксиддисмутазы и других антиокси-дантных ферментов, а также белков теплового шока, которые вовлечены в стабилизацию цитоскелета [13]. Механизм прямого эндотелиопротек-тивного эффекта ишемического прекондиционирования до конца еще не изучен. Вероятнее всего, ишемический стимул вызывает перестройку системного характера, а изменение функции эндотелия является лишь частным моментом в общей цепи предупреждения ишемических повреждений и запускается одновременно. Улучшение функции эндотелия в эту фазу можно ожидать за счет индукции синтеза мощного вазодилататора - NO (экспрессия NO-синтазы) [13].
В основе патогенеза гестоза второй половины беременности, по мнению многих авторов, лежит острый эндотелиоз, поэтому для коррекции этого грозного осложнения одним из перспективных направлений, которое получило экспериментальное обоснование [10], является поиск новых лекарственных препаратов среди группы препаратов, улучшающих функцию эндотелия. В то же время ишемические явления в плаценте являются пусковым моментом и вместе с эндотелиальной дисфункцией замыкают порочный круг в длинной цепи патофизиологических событий, приводящих к манифестации гестоза [5, 6, 8]. Данные факт послужил предпосылкой для проведения исследования эффективности коротких эпизодов ишемии-реперфузии для коррекции морфофункциональных изменений, возникающих при экспериментальном гестозе [3, 4].
В исходной гипотезе, послужившей предпосылкой для проведения эксперимента, было предположение о том, что в основе механизма положительных эффектов на функцию эндотелия коротких эпизодов ишемии-реперфузии лежат биологические процессы феномена ишемического прекондиционирования [3, 4]. Несмотря на полученные положительные результаты, механизм реализации их положительного эффекта остается до конца не ясен. Улучшение функции эндотелия возможно как за счет усиления образования NO, которое может в какой-то мере скомпенсировать его недостаток, так и за счет уменьшения ишемических явлений в плаценте за счет собственно феномена ишемического прекондиционирования, что позволит снизить выделение плацентой гуморальных факторов, вызывающих эндотелиальную дисфункцию.
Одними из ключевых моментов механизма реализации противоишемического эффекта феномена ишемического прекондиционирования являются: активация iNOS, что приводит к усиле-
нию синтеза NO и активация АТФ-зависимых К+ каналов.
Таким образом целью настоящего исследования явилось изучение роли iNOS и АТФ-зависимых К каналов в коррекции морфофункциональных нарушений короткими эпизодами ишемии-реперфузии при ADMA-подобном гестозе в эксперименте.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперимент выполнен на 50 белых крысах -самках линии Wistar массой 250-300 г. Спаривание животных проводили в течение 24 часов. На 10 сутки в условиях эфирного сна, пальпаторно определяли факт беременности. ADMA-подобный агент - неселективный блокатор NO-синтазы N-нитро-Ь-аргинин-метиловый эфир (L-NAME) вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг/сут в течение семи дней (14-20-е сутки беременности) [10]. На 21-е сутки беременности под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в правую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Проводили сосудистые пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию (ЭЗВ) - внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг, и эндотелий-независимую вазодилатацию (ЭНЗВ) - внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг с расчетом коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) [9]. Беременные самки были разделены на группы (n=10): I - ин-тактные; II - с введением L-NAME ежедневно с 14-х по 20-е сутки беременности; III - с введением аминогуанидина 300 мг/кг (внутрибрюшинно); IV - с введением глибенкламида 50 мг/кг (внутрь); V - с введением L-NAME и ежедневным воспроизведением 10-минутного ишемического эпизода задних конечностей попеременно с 10-х по 20-е сутки беременности; VI - с введением L-NAME, ежедневным воспроизведением 10-минутного ишемического эпизода задних конечностей попеременно с 10-х по 20-е сутки беременности и введением селективного блокатора iNOS аминогуанидина в дозе 300 мг/кг; VI - с введением L-NAME, ежедневным воспроизведением 10-минутного ишемического эпизода задних конечностей попеременно с 10-х по 20-е сутки беременности и введением блокатора АТФ-зависимых К+ каналов - глибенкламида в дозе 50 мг/кг. Ишемический эпизод воспроизводили 10-минутным пережатием бедренной артерии путем наложения манжеты на проксимальную треть бедра. Контролем правильности наложения ман-
жеты служило отсутствие пульса на артериях голени. Исследование микроциркуляции в плаценте проводили с помощью оборудования компании «Biopac systems»: полиграф MP100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDf100C и датчиком TSD144. Регистрация результатов ЛДФ производилась программой Acqknowledge версии 3.8.1, значения микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕд) [1]. NO-продуцирующую функцию эндотелия оценивали на основании данных содержания стабильных метаболитов NO - нитрит-ионов NOx в сыворотке крови.
Проведено морфологическое исследование плацент вместе с имплантационным участком рога матки. Гистологические срезы после стандартной заливки материала в парафин изготавливали в строго вертикальном направлении через середину плацентарного диска с захватом всех слоев плаценты и стенки рога матки. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Изучение микропрепаратов и фотопротоколирование на микроскопе Leica DM4000B с системой видеорегистрации и обработки изображений.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Блокада NO-синтазы, вызванная семидневным введением L-NAME, приводила к нарушению взаимоотношений вазодилатирующих и ва-зоконстрикторных механизмов регуляции сосудистого тонуса, о чем свидетельствовало увеличение КЭД с 1,28±0,23 у интактных беременных животных до 3,06±0,32 (р<0,05). Кроме этого, наблюдался значительный подъем систолического и диастолического артериального давления с 125±6,3 и 82,0±5,8 до 183,1±9,4 и 136,7±7,4 мм рт. ст. соответственно. Введение блокатора NO-синтазы приводило к значительному снижению показателя микроциркуляции в плаценте с 425,90±39,55 до 210,00±21,08 (р<0,05), а также к снижению содержания стабильных метаболитов NOх в сыворотке крови с 2,35±0,21 мкмоль/дл до 1,33±0,09 мкмоль/дл (р<0,05). При микроскопическом исследовании плаценты наблюдаются неравномерное кровенаполнение спонгиозного
слоя, вакуольная дистрофия гигантоклеточного трофобласта, очаги некроза на границе гигантоклеточного трофобласта и децидуальной оболочки, дистрофические изменения и малокровие в децидуальной оболочке. Таким образом, моделирование ADMA-подобного L-NAME-
индуцированно-го гестоза в эксперименте у крыс характеризовалось выраженным повышением АД, явлениями эндотелиальной дисфункции, снижением плацентарной микроциркуляции и NO-
продуцирующей функции эндотелия, деструктивными изменениями в плаценте [4].
Введение селективного ингибитора iNOS -аминогуанидина или блокатора АТФ-зависимых К каналов интактным беременным самкам не приводило к каким-либо значимым изменениям в состоянии животного.
В группе животных с 10-кратным воспроизведением ишемии-реперфузии наблюдалась нормализация взаимоотношения вазодилатирующих и вазоконстрикторных реакций, о чем свидетельствует снижение КЭД до 1,56±0,13. Кроме этого, происходило статистически значимое снижение артериального давления: систолического до
141,6±5,5 мм рт. ст., диастолического до 104,2±5,7 мм рт. ст. (р<0,05). Исследование микроциркуляции в плаценте выявило ее улучшение по сравнению с группой не леченых животных (р<0,05), однако целевого уровня она не достигала (табл. 1). При биохимическом исследовании сыворотки крови обнаружено статистически значимое предотвращение снижения содержания стабильных метаболитов N0, уровень которых составил 1,92±0,18 мкмоль/дл. Микроскопическое исследование плаценты при моделировании ADMA-подобного гестоза с 10-кратным воспроизведение эпизодов ишемии-реперфузии выявило выраженную положительную динамику гистологической картины, которая заключалась в относительно равномерном кровенаполнении спонгиоз-ного слоя, отсутствии повреждения слоя гигантоклеточного трофобласта и децидуальной оболочки.
Блокада аминогуанидином iNOS или глибен-кламидом АТФ-зависимых К+ каналов практически полностью снимала положительные эффекты коротких эпизодов ишемии-реперфузии при коррекции морфофункциональных нарушений при ADMA-подобном гестозе. Это выразилось в подъеме артериального давления, снижении показателей микроциркуляции в плаценте и концентрации стабильных метаболитов NO в плазме крови до уровня не леченых животных. При морфологическом исследовании плаценты животных указанных групп отмечается гистологическая картина, подобная группе не леченных животных. Только уровень КЭД оставался статистически ниже группы не леченых животных (рис. 1).
Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что длительное (в течение семи суток) внутрибрюшинное введение блокатора NO-синтазы L-NAME вызывает у беременных самок крыс комплекс изменений, ассоциированных с N0-дефицитной эндотелиальной дисфункцией. На 8-е сутки развивалась выраженная гипертензия, в 3 раза увеличивался коэффициент
Таблица 1
Результаты коррекции L-NAME-индуцированной преэклампсии у крыс (М±т)
Показатель Группа САД, мм рт. ст. ДАД, мм рт. ст КЭД, усл. ед. Микроцир- куляция ПЕ Концентрация нитрит-ионов (NOx), мкмоль/дл
Интактные 125,0±6,Зу 82,0±5,8у 1,28±0,2Зу 425,9±З9,6у 2,З5±0,21у
L-NAME 183,1±9,4* 136,7±7,4* 3,06±0,32* 210,0±21,1* 1,33±0,09*
Аминогуанидин 1ЗЗ,9±4,0у 82,8±4,2у 1,55±0,09у 409,З±24,5у 2,10±0,12у
Глибенкламид 1З0,7±4,7у 81,6±2,4у 1,5З±0,15у З76,4±20,9у 1,76±0,09у
L-NAME +ишемия-реперфузия 141,6±5,5у 104,2±5,7у 1,56±0,13у ЗЗ9,6±20,4у 1,92±0,18у
L-NAME +ишемия-реперфузия+амино-гуанидин 181,3±4,6* 133,5±3,3* 2,З4±0,09у 256,8±24,6* 1,31±0,06*
L-NAME +ишемия-реперфу-зия+глибенкламид 198,5±13,1* 139,2±8,3* 2,24±0,17у 233,2±21,6* 1,29±0,07*
Примечание: САД, ДАД - систолическое и диастолическое артериальное давление; КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции;
- р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; у- р<0,05 в сравнении с группой L-NAME.
Интактные 1_-ЫЛМЕ Ишемия- Ишемия- Ишемия-
реперфузия(10) реперфузия(10) реперфузия(10)
+Аминогуанидин +Глибенкламид
Рис. 1. КЭД у животных с короткими эпизодами ишемии-реперфузии при введении аминогуанидина и глибенкламида в условии ADMA-подобного гестоза
Примечание: *- при р<0,05 по сравнению с интактными беременными крысами; Y - при р<0,05 по сравнению с группой получавших L-NAME.
эндотелиальной дисфункции, происходило сни- ческие изменения в плаценте. Описанный симп-
жение показателей плацентарной микроциркуля- томокомплекс можно соотнести с развитием ге-
ции, снижение конечных метаболитов N0 в плаз- стоза в клинических условиях.
ме и наблюдались четко выраженные морфологи-
Положительное влияние коротких эпизодов ишемии-реперфузии на морфофункциональное состояние в условии ADMA-подобного гестоза создает предпосылки для нового направления поиска лекарственных препаратов для лечения и профилактики гестоза второй половины беременности.
Отсутствие какого либо влияния на состояние беременных животных при введении им только аминогуанидина или глибенкламида и практически полное устранение положительных эффектов коротких эпизодов ишемии-реперфузии при блокаде iNOS или АТФ-зависимых К+ каналов свидетельствует о том, что в механизме их реализации протекают процессы, лежащие в основе феномена ишемического прекондиционирования. Противо-ишемический эффект феномена ишемического прекондиционирования приводит к снижению уровня ишемических явлений в плаценте за счет активации АТФ-зависимых К+ каналов и, как следствие, уменьшению выделения ею гуморальных факторов вызывающих эндотелиальную дисфункцию. В то же время нужно отметить, что, оставаясь выше уровня не леченых животных, КЭД свидетельствует о наличии у коротких эпизодов ишемии-реперфузии некоторого прямого эндотелиопротективного эффекта, реализуемого механизмами, отличными от дистантного ишемического прекондиционирования.
Результаты проведенного эксперимента дают основания для предположения о том, что положительное действие коротких эпизодов ишемии-реперфузии на морфофункциональное состояние при ADMA-подобном гестозе реализуется посредством биологических процессов, лежащих в основе противоишемического эффекта дистантного ишемического прекондиционирования. Данный факт является экспериментальным обоснованием проведения исследований эффективности противоишемических мероприятий при гестозе второй половины беременности и поиска новых лекарственных препаратов для его лечения и профилактики, в основе механизма действия которых будут лежать биологические процессы феномена ишемического прекондиционирования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Артюшкова Е.Б., Пашков Д.В., Покровский М.В. и др. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2008. -Т. 71, № 3. - С. 23 - 25.
2. Власов Т.Д. Влияние дистантной ишемии-реперфузии на состояние сосудов миокарда // Ученые записки СПбГМУ. - 1999. -Т. 2, №6. -С. 68-70.
3. Гуреев В.В. Эндотелиальная дисфункция - центральное звено в патогенезе гестоза // Научные ведомости Белгородского государственного университета. - 2011. - Т. 123, № 4. - С. 5-12.
4. Гуреев В.В., Покровский М.В., Должиков А.А. и др. Коррекция дистантным ишемическим преконди-ционированием эндотелиальной дисфункции при ADMA-подобном экспериментальном гестозе // Научные ведомости Белгородского государственного университета. - 2011. - Т. 123, № 4. -С. 128-134.
5. Зайнулина М.С., Петрищев Н.Н. Эндотелиальная дисфункция и ее маркеры при гестозе // Журнал акушерства и женских болезней - 1997. - № 3. -С. 18 - 22.
6. Кулаков В.И., Мурашко Л.Е., Бурлёв В.А. Клиникобиохимические аспекты патогенеза гестозов // Акуш. и гинекол. - 1995. - № 6. - С. 3-5.
7. Маслов Л.Н., Колар Ф., Криг Т. Дистантное ишемическое прекондиционирование // Успехи физиологических наук. - 2009. - № 4. - С. 64-78.
8. Мозговая Е.В., Малышева О.В., Иващенко Т.Э. и др. Эндотелиальная дисфункция при гестозе. Патогенез, генетическая предрасположенность, диагностика и профилактика / Метод. рекомендации.
- СПб., 2003.
9. Покровский М.В., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г. и др. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте // Кубанский науч. мед. вестн. - 2006. - Т. 91, № 10. - С. 72 - 77.
10. Покровский М.В., Покровская Т.Г., Гуреев В.В. и др. Фармакологическая коррекция ADMA-eNOS-ассоциированных мишеней при преэклампсии // Акушерство и гинекология. - 2011. - № 2. -С. 16-20.
11. Факторы, участвующие в нарушении метаболизма оксида азота и развитии эндотелиальной дисфункции при преэклампсии // Аллергология и иммунология. - 2004. - Т.5, № 3. - С. 393 - 395.
12. Dembinski Z. Warzecha, P. Ceranowicz et al. Ischemic preconditioning reduces the severity of ischemia/reperfusion-induced pancreatitis // Eur J Pharmacol. - 2003; Vol. 473, N 2-3. - P. 207 - 16.
13. Kloner R.A., Jennings R.B. Consequences of Brief Ischemia: Stunning, Preconditioning, and Their Clinical Implications. Part 2 // Circulation. - 2001. -N 104.
- P. 3158 - 3167.
14. Rezkalla S.H., Kloner R.A. Preconditioning in humans // Heart Fail Rev. - 2007. - N 12. - P. 201 - 206.
15. Walsh S.R., Tang T., Sadat U., Dutka D.P. et al. Gaunt Cardioprotection by remote ischaemic preconditioning // British Journal of Anaesthesia. - 2007. -Vol. 99, N 5. - P. 611 - 16.
