CC BY
31
Бюлогтний eicrnni МДПУ ¡менп Богдана Хмельницького 6 (3) стор. 229—233, 2016
Biological Bulletin of Bogdan Chmelnitskiy Melitopol State Pedagogical University, 6 (3), pp. 229-233, 2016
ARTICLE УДК582.734.4 (574.42)
ИССЛЕДОВАНИЕ РАЗМЕРА ГЕНОМА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА POTENTILLA L. (ROSACEAE JUSS.)
АА. Кечайкин, М.В. Скапцов, С.В. Смирнов, М.Г. Куцев, А.И. Шмаков Южно-Сибирский ботанический сад, Алтайский государственный университет, пр. Ленина 61, 656049, Ъарнауул, Россия
С помощью метода проточной цитофлуориметрии впервые получены результаты о содержании ДНК и размере генома 13 представителей рода Potentilla L. В результате анализа размера генома были выявлены закономерности отношения плоидности и размера генома видов. На основании полученных данных установлено, что между размером генома и количеством хромосом у видов рода Potentilla наблюдается линейная зависимость. Ключевые слова: Potentilla, проточная цитометрия, размер генома, плоидность
STUDY OF GENOME SIZE REPRESENTATIVES OF THE GENUS POTENTILLA L. (ROSACEAE JUSS.)
AA. Kechaykin*, M.V. Skaptsov, S.V. Smirnov, M.G. Kutsev, A.I. Shmakov South-Siberian Botanical Garden, Altai State University, Lenina str, 61, 656049 Barnaul, Russia *Corresponding author. Email: alekseikechaikin@mail.ru
In our study, 15 representatives of the genus Potentilla L. were analyzed to obtain the relative DNA content and monoploid genome size in the seeds by flow cytometry method. For these Potentilla species, except P. argentea and P. norvegica, DNA content and genome size are revealed for the first time. As a result, the following data were obtaining: representatives of the older section Desertae are diploids with the large monoploid genome size. The genome of P. asiatica (Chrysanthae section) are decrease up to 0.35 pg, while the ploidy is increased to 4. Representatives of the Multifidae and Supinae section are presented with tetra-and hexaploid species with the 0.3 pg of the monoploid genome size. In section Tanacetifoliae are observed a further decrease of the genome size, representatives basically tetraploids. Thus, in the genome size evolution of a Potentilla genera are observed the increase of ploidy with significant reductions in monoploid genome size. This fact proves the general theory of genome evolution of angiosperms, directed towards its reduction. Linear regression analysis was showed a positive correlation between chromosome number and genome size of the representatives of the Potentilla genera. This suggests that between genome size and the number of chromosomes in Potentilla species are linear dependence. Pearson correlation analysis confirmed this result: the correlation coefficient is 0.97 at P<0.05. Key words: Potentilla, flow cytometry, genome size, ploidy
Citation:
Kechaykin, A.A., Skaptsov, M.V., Smirnov, S.V., Kutsev, M.G., Shmakov, A.I. (2016). Study of genome size representatives of the genus Ptentilla L. (Rosaceae Juss.).
Biological Bulletin of Bogdan Chmelnitskiy Melitopol State Pedagogical University, 6 (3), 229—233. Поступило в редакцию / Submitted: 10.11.2016 Принято к публикации / Accepted: 01.12.2016 eros sraf http: / /dx.doi.org/10.15421 /201690 © Kechaykin, Skaptsov, Smirnov, Kutsev, Shmakov, 2016
Users are permitted to copy, use, distribute, transmit, and display the work publicly and to make and distribute derivative works, in any digital medium for any responsible purpose, subject to proper attribution of authorship.
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 3.0. License
A.A. Кечаикин и др.
230
ВВЕДЕНИЕ
К настоящему времени наиболее популярным и интересным в современной биологии становиться исследование размера генома. Одним из методов изучения размера генома растений является метод проточной цитометрии, основанный на флюоресценции изолированных ядер, выделенных из клеток. Согласно основной теории эволюции генома покрытосеменных — уменьшении размера генома в процессе видообразования (Leitch et al., 1998; Soltis et al., 2003), с помощью метода проточной цитометрии можно выявить наиболее древние элементы в отдельных семействах и родах. Изучением содержания ДНК представителей семейства Rosaceae Juss. ученые занимаются не одно десятилетие (Dickson et al., 1992; Talent & Dickinson, 2005). Однако лишь совсем недавно стали появляться конкретные работы, посвященные исследованию размера генома рода Potentilla L. его отдельных таксонов (Dobes et al., 2013; Dobes et al., 2015). На данный момент из всех видов рода Potentila размер генома выявлен лишь у 37 таксонов (Dobes et al., 2015). В настоящей работе для 13 видов рода Potentilla содержание ДНК определено впервые.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Содержание ДНК исследуемых лапчаток (13 видов и 2 подвида) определяли с использованием метода проточной цитометрии с окраской изолированных ядер пропидий иодидом (PI). Семена раздавливали в ступке и затем измельчали при помощи лезвия в 1 мл охлажденного буфера Seed buffer (Matzk et al., 2000). Образцы фильтровали через нейлоновую мембрану с размером пор 50 мкм и центрифугировали при 0,2 g, 2 минуты. Осадок растворяли в 1 мл Seed buffer дополнительно содержащим PI (50 мкг/мл), РНаза (50 мкг/мл) и ß-меркаптоэтанол (1 мкл/мл). Исследование каждого образца проводили в два этапа. На первом этапе подбирали параметры детекции флуоресценции и выявления положения пика стандарта на графике и отмечали канал флуоресценции стандарта. На втором этапе раствор стандарта добавляли к исследуемому образцу и проводили уже полноценное исследование. Для дальнейшей интерпретации данных использовали пики с 26 не менее чем 1000 детектируемых частиц. В качестве внешних стандартов использовали Pisum sativum L. cv 'Glorioza' (2С=9.38 пг) (Скапцов и др., 2014) и Glycine max (L.) Merr. cv 'Polanka' (2С=2.50 пг) (Dolezel et al., 1994).
Результаты флюоресценции изолированных ядер детектировали при помощи проточного цитометра Partec CyFlow PA (Partec, GmbH) с лазерным источником излучения с длиной волны 532 нм. Сигналы записывались в логарифмическом представлении данных флюоресцении (логарифмическая шкала). Измерения производили не менее 9 раз с периодичностью три измерения в сутки для каждого образца. Для дальнейшего анализа использовали результаты, не превышающие среднего значения содержания ДНК образца более чем на 3% (Kubesová et al., 2010). Для трансформации данных из логарифмического в линейное представление использовали формулу: f = 10X/64 (Marie, Brown, 1993), где Х — разница между средними значениями пиков (каналов) стандарта и образца в логарифмической шкале; 64 — частное между количеством каналов шкалы прибора на количество декад на полной логарифмической шкале (256/4 для Partec CyFlow PA). Содержание ДНК рассчитывали, исходя из формулы 2С = f*M, где f — индекс (разница между средними значениями пика образца и стандарта в линейной шкале); M — среднее значение пика образца. Полученные результаты обрабатывали при помощи программы Statistica 8.0 (StatSoft Inc.) и штатного программного обеспечения проточного цитометра CyView (Partec, GmbH).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Из семян (собранных на территории Алтайской горной страны), с помощью метода проточной цитометрии получены результаты об относительном содержании ДНК и размере моноплоидного генома 15 представителей рода Potentilla (табл. 1). Для данных лапчаток, кроме P. argentea и P. norvegica, содержание ДНК и размер генома выявлены впервые для науки. В результате анализа размера генома были выявлены некоторые закономерности отношения плоидности и размера генома видов. Potentilla gobica и P. desertorum, относящиеся к секции Desertae и произрастающие в нагорных территориях Азии, являются диплоидами. Они не имеют гибридного происхождения и характеризуются высоким размером моноплоидного генома: 0.51 и 0.42 пг соответственно. У тетраплоида P. asiatica секции Chrysanthae наблюдается снижение размера моноплоидного генома до 0.35 пг. Представители секции Supinae характеризуются распределением размера моноплоидного генома в диапазоне 0.28—0.34 пг и являются в основном тетра- и гексаплоидами. Из включенных в анализ представителей секции Multifidae большинство имеют гибридное происхождение, представлены гекса- и тетраплоидами с распределением размера моноплоидного генома в диапазоне 0.28— 0.30 пг (табл. 1). Виды из секции Tanacetifoliae и Potentilla имеют распределение моноплоидного генома в диапазоне 0.23—0.30 пг и представлены тетраплоидами.
На основании полученных результатов установлено, что между размером генома и количеством хромосом у видов лапчаток наблюдается линейная зависимость. Об этом свидетельствует и линейный регрессионный анализ между хромосомами и размером генома, проявивший положительную корреляцию, что наглядно показывает высокий уровень r2 (0.95) (рис. 1). Анализ корреляций Пирсона подтвердил
Бiaлaгiчнuй виник МДПУ шет Богдана Хмелъницъкого б (3), 2016
данный результат: коэффициент корреляции равен 0.97 при Р<0.05. Данные по хромосомным числам подтверждены методами микроскопии.
Основной теорией эволюции генома покрытосеменных в современной ботанике, является предположение об уменьшении размера генома в процессе видообразования (ЪекА et а1., 1998; Soltis et а1., 2003). Исследования, основанные на цитотипировании и анализе плоидности множества групп цветковых, в той или иной степени, подтверждают данную теорию (Jonston et а1., 2005; Leitch et а1., 2007; Шереметьев и др., 2011). Исходя из полученных нами данных, становится возможным предположить, что эволюция генома рода РоШйИа, протекала в сторону снижения размера генома относительно основного хромосомного числа, что соответствует основной теории эволюции генома покрытосеменных — уменьшение размера в процессе видообразования. Такие виды как Р. ¿оЫеа и Р. desertorum, выделенные в самостоятельную секцию Desertae, имеют наибольший размер моноплоидного генома. Это также поддерживает мнение Р.В. Камелина о том, что виды секции Desertae являются наиболее древними среди других травянистых групп рода РоипйНа (Камелин, 1998).
Таблица 1. Примеры размера генома и отношения содержания ДНК к основному числу хромосом некоторых представителей рода Роипй1Ь
№. Таксон Секция Плоид-ность(x) 2C, пг 1Cx, пг Известное число хромосом (2п)
1. P. Gobica Des. 2 1.03 0.51 —
2. P. Desertorum 2 0.84 0.42 14, 28
3. P. Asiatica Chrys. 4 1.40 0.35 42
4. P. Norvegica 6 1.84 0.31 56, « 63, « 70
5. P. norvegica ssp. ruthenica 6 1.77 0.29 -
6. P. Intermedia Зир. 4 1.37 0.34 35, 42, 56
7. P. supina ssp. paradoxa 6 1.83 0.31 35, 38-40, 42
8. P. tobolensis 4 1.13 0.28 -
9. P. agrimonioides 6 1.70 0.28 42, 49-50
10. P. jenissejensis Шик. 4 1.20 0.30 -
11. P. rigidula 6 1.70 0.28 -
12. P. turczaninowiana Лиг. 6 1.85 0.31 -
13. P. astragalifolia 14. P. tanacetifolia Рапае. 4 4 0.95 1.11 0.23 0.27 28
15. P. argentea Ро(. 4 1.20 0.30 ~ 28, 42
Прим.: 2С — относительное содержание ДНК; 1Сх — размер моноплоидного генома, отношение относительного содержания ДНК к основному хромосомному числу.
2,2
1,8
о
51.4
О. ] 9 §
«1.0
'0,8 0,6 0,4
/ ',0 У
г2 = 0,95 ^ / х /
у=-0,215+0,055*х 0 / / уУ - '
✓ у у' ¿У .у
уУ 'Л
уху * ¿У *
уУ /
10
15
35
40
45
20 25 30
Количество хромосом
Рис. 1. Линейный регрессионный анализ между хромосомами и размером генома представителей
рода
А.А. Кечайкин и др.
ВЫВОДЫ
В результате проведенных исследований получены следующие данные. Представители более древней секции Desertae являются диплоидами с крупным размером моноплоидного генома. В геноме P. asiatica секции Chrysanthae наблюдается снижение размера моноплоидного генома до 0.35 пг, тогда как плоидность увеличивается до 4. Секции Multifidae и Supinae представлены тетра- и гексаплоидами со средним размером моноплоидного генома 0.3 пг. В секции Tanacetifoliae наблюдается дальнейшее снижение размера генома, представители имеют плоидность 4. Таким образом, в процессе эволюции генома Potentilla происходило увеличение плоидности со значительным снижением размера моноплоидного генома. Данный факт подтверждает общую теорию эволюции генома покрытосеменных растений, направленную в сторону его уменьшения (Leitch et al., 1998; Soltis et al., 2003).
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований, проект № 14-04-00721.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Камелин Р.В. Материалы по истории флоры Азии (Алтайская горная страна). — Барнаул: Изд-во Алт. унта, 1998. - 240 с.
Скапцов М.В., Смирнов С.В., Куцев М.Г. Содержание ядерной ДНК в некоторых сортах растений, используемых в качестве внешних стандартов в проточной цитометрии // Turczaninowia, 2014. — Т. 17(3). - С. 72—78. DOI: 10.14258/turczaninowia.17.3.8
Шереметьев С.Н., Гомалей Ю.В., Слемнев Н.Н. Направления эволюции генома покрытосеменных // Цитология, 2011. — Т. 53(3). — С. 295—312.
Dickson E.E., Arumuganathan K., Kresovich S., Doyle J.J. Nuclear DNA content variation within the Rosaceae // American Journal of Botany, 1992. — Vol. 79. — P. 1081—1086.
Dobes C., Luckl A., Hulber K., Paule J. Prospects and limits of the flow cytometric seed screen — insights from Potentilla sensu lato (Potentilleae, Rosaceae) // New Phytologist, 2013. — Vol. 198. — P. 605—616. DOI: 10.1111/nph.12149
Dobes C., Luckl A., Kausche L., Scheffknecht S., Prohaska D., Sykora C., Paule J. Parallel origins of apomixis in two diverged evolutionary lineages in tribe Potentilleae (Rosaceae) // Botanical Journal of the Linnean Society, 2015. — Vol. 177. — P. 214—229. DOI: 10.1111/boj.12239
Dolezel J., Dolezelova M., Novak F.J. Flow cytometric estimation of nuclear DNA amount in diploid bananas (Musa acuminata and M. balbisiana) // Biologia Plantarum, 1994. — Vol. 36. — P. 351—357.
Johnston J.S., Pepper A.E., Hall A.E., Chen Z.J., Hodnett G., Drabek J., Lopez R., Price H.J. Evolution of genome size in Brassicaceae // Annals of Botany, 2005. — Vol. 95. — P. 229—235. DOI: 10.1093/aob/mci016
Kubesova M., Moravcova L., Suda J., Jarosik V., Pysek P. Naturalized plants have smaller genomes than their non-invading relatives: a flow cytometric analysis of the Czech alien flora // Preslia, 2010. — Vol. 82. — P. 81—96.
Leitch I.J., Beaulieu J.M., Cheung K., Hanson L., Lysak M.A., Fay M.F. Punctuated genome size evolution in Liliaceae // Journal of Evolutionary Biology, 2007. — Vol. 20. — P. 2296—2308. DOI: 10.1111/j.1420-9101.2007.01416.x
Leitch I.J., Chase M.W., Bennett M.D. Phylogenetic analysis of DNA C-values provides evidence for a small ancestral genome size in flowering plants // Annals of Botany, 1998. — Vol. 82 (Suppl. A). — P. 85—94.
Marie D., Brown S.C. A cytometric exercise in plant DNA histograms, with 2C values for 70 species // Biology of the Cell, 1993. — Vol. 78. — P. 41—51. DOI:10.1016/0248-4900(93)90113-S
Matzk F., Meister A., Schubert I. (2000) An efficient screen for reproductive pathways using mature seeds of monocots and dicots // The Plant Journal, 2000. — Vol. 21. — P. 97—108.
Soltis D.E., Soltis P.S., Bennett M.D., Leitch I.J. Evolution of genome size in the angiosperms // American Journal of Botany, 2003. — Vol. 90. — P. 1596—1603. DOI: 10.3732/ajb.90.11.1596
Talent N., Dickinson T.A. Polyploidy in Crataegus and Mespilus (Rosaceae, Maloideae): evolutionary inferences from flow cytometry of nuclear DNA amounts // Canadian Journal of Botany, 2005. — Vol. 83. — P. 1268—1304. DOI: 10.1139/b05-088
Bimoii4mU eicHUK МДПУ шет Богдана Хмельницького 6 (3), 2016
REFERENCES
Dickson, E.E., Arumuganathan, K., Kresovich, S., Doyle, J.J. (1992). Nuclear DNA content variation within the
Rosaceae. American Journal of Botany, 79, 1081—1086. Dobes, C., Lückl, A., Hülber, K., Paule, J. (2013). Prospects and limits of the flow cytometric seed screen — insights
from Potentilla sensu lato (Potentilleae, Rosaceae). New Phytologist, 198, 605—616. DOI: 10.1111/nph.12149 Dobes, C., Lückl, A., Kausche, L., Scheffknecht, S., Prohaska, D., Sykora, C., Paule, J. (2015). Parallel origins of apomixis in two diverged evolutionary lineages in tribe Potentilleae (Rosaceae). Botanical Journal of the Lnnean Society, 177, 214-229. DOI: 10.1111/boj.12239 Dolezel, J., Dolezelova, M., Novak, F.J. (1994). Flow cytometric estimation of nuclear DNA amount in diploid
bananas (Musa acuminata and M. balbisiana). Biologia Plantarum, 36, 351-357. Johnston, J.S., Pepper, A.E., Hall, A.E., Chen, Z.J., Hodnett, G., Drabek, J., Lopez, R., Price, H.J. (2005). Evolution
of genome size in Brassicaceae. Annals of Botany, 95, 229-235. DOI: 10.1093/aob/mci016 Kamelin, R.V. (1998). Materials on the history of Asian flora (Altai Mountain Country). Barnaul: Altai State University. (In Russian).
Kubesovä, M., Moravcovä, L., Suda, J., Jarosik, V., Pysek, P. (2010). Naturalized plants have smaller genomes than
their non-invading relatives: a flow cytometric analysis of the Czech alien flora. Preslia, 82, 81-96. Leitch, I.J., Beaulieu, J.M., Cheung, K., Hanson, L., Lysak, M.A., Fay, M.F. (2007). Punctuated genome size evolution in Liliaceae. Journal ofEvolutionary Biology, 20, 2296-2308. DOI: 10.1111/j.1420-9101.2007.01416.x Leitch, I.J., Chase, M.W., Bennett, M.D. (1998). Phylogenetic analysis of DNA C-values provides evidence for a
small ancestral genome size in flowering plants. Annals of Botany, 82(Suppl. A), 85-94. Marie, D, Brown, S.C. (1993). A cytometric exercise in plant DNA histograms, with 2C values for 70 species.
Biology of the Cell, 78, 41-51. DOI:10.1016/0248-4900(93)90113-S Matzk, F., Meister, A., Schubert, I. (2000). An efficient screen for reproductive pathways using mature seeds of
monocots and dicots. The Plant Journal, 21(1), 97-108. Sheremetiev, S.N., Gamalei, Yu.V., Slemnev, N.N. (2011). Trends of angiosperm genome evolution. Tsitologiya,
53(3), 295-312. (In Russian). Skaptsov, M.V., Smirnov, S.V., Kutsev, M.G. (2014). Nuclear DNA content in some plant kinds used as an external standard in flow cytometry. Turc%aninowia, 17(3), 72-78. (In Russian). DOI: 10.14258/turczaninowia.17.3.8 Soltis, D.E., Soltis, P.S., Bennett, M.D., Leitch, I.J. (2003) Evolution of genome size in the angiosperms. American
Journal of Botany, 90, 1596-1603. DOI: 10.3732/ajb.90.11.1596 Talent, N., Dickinson, T.A. (2005). Polyploidy in Crataegus and Mespilus (Rosaceae, Maloideae): evolutionary inferences from flow cytometry of nuclear DNA amounts. Canadian Journal of Botany, 83, 1268-1304. DOI: 10.1139/b05-088
