CC BY
67
УДК Б1Б.12Б.52-007-089.844:Б35.07Б
ИССЛЕДОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДИК ХРАНЕНИЯ И РАЗМОРАЖИВАНИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ АЛЛОГРАФТОВ.
С.В. Спиридонов1, Н.Н. Шетинко1, В.О. Одинцов1, А.П. Шкет1,
О.А. Юдина2, О.И. Солодкая2, С.И. Дрык3, Н.Н. Зуенок3, Ю.П. Островский1,
W «Республиканский научно-практический центр «Кардиология»,
2УЗ «Городское клиническое патологоанатомическое бюро»,
3УЗ «9-я городская клиническая больница», г. Минск
Островский Юрий Петрович - e-mail: youryost@yahoo.com
В исследование было включено 49 аллографтов. После стерилизации аллографтов проводилась их криоконсервация со снижением температуры до -55°С. Хранение осуществлялось в двух режимах: при температуре -196°С (п=10) или при температуре -150°С (п=12). Размораживание проводилось в трех режимах: при температуре +36...42°С (п=10), при температуре +18...20°С (п=7) и при температуре +8...10°С (п=10). После размораживания аллографты оценивались визуально, проводились гидравлические и гистологические исследования. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что хранение аортальных аллографтов в парах жидкого азота при температуре -150°С является оптимальным, так как обеспечивает целостность, прочность аллографта и сохранность его гистологической структуры. Размораживание пульмональных и аортальных аллографтов в интервале температур от 8 до 10°С за 1 час является оптимальным, так как обеспечивает максимальную целостность, прочность аллографтов и сохранность их гистологической структуры.
Ключевые слова: криосохраненные аллографты, хранение аллографтов,
размораживание аллографтов.
The investigation included 49 allografts. After sterilizatioп of allografts there was made their cryocon-servation with the decrease of temperature up to -55°С. The storage was doпe by two regimes: with the temperature -196°С (n=10) or with the temperature -150° С (n=12). They were defrosted with three regimes: with the temperature +36...42°С (n=10), with the temperature +18...20°С (n=7), with the temperature +8...10°С (n=10). After defrosting the allografts were visually assessed, hydraulic aпd histological examinations were carried out. The received data lead to the conclusion that the storage of aortic allografts in the liquid пitrogeп vapor with the temperature -150°С is optimal because it provides integrity, strength of allograft and the preservation of its histological structure. The defrosting of pulmo-пary aпd aortic allografts within the temperatures from 8 to 10°С for oпe hour is the best because it also provides the maximum integrity, strength of allograft and the preservation of its histological structure.
Key words: cryopreserved allografts, storage of allografts, defrosting of allografts.
В настоящее время криосохраненные аллографты аортального и пульмонального клапанов широко используются многими кардиохирургическими центрами мира. Использование донорских клапанов позволяет создать гемодинамические условия, максимально приближенные к характеристикам нормального нативного аортального клапана. Многолетний опыт показал, что аллографты адекватно корригируют внутрисердечную гемодинамику, существенно снижают риск тромбоэмболических осложнений, не требуют проведения антикоагулянтной терапии в течение всей жизни, улучшают качество жизни пациентов [1, 2, 3].
Целью исследования явилось изучение воздействия на криосохраненные аллографты различных температурных режимов хранения (пары жидкого азота, жидкий азот) и температурных режимов размораживания криосохранен-ных аллографтов.
Материалы и методы
Данное исследование одобрено этическим комитетом ГУ РНПЦ «Кардиология» № 4а от 21 февраля 2012 года. В исследование было включено 49 криосохраненных аллографтов аортальных и пульмональных клапанов. 26 клапанов были эксплантированы у живых доноров во время
І'ДТ іі ■ A 1
Н&еА ж- 4і'--
BS-- ■ ■ ■ aYk
■ v:-.
РИС. 1.
Гистологическая картина стенки аллографта при использовании 1-го режима размораживания:
А - расширение спонгиозной зоны свободного края заслонки, окраска Н&Е, х50; Б - изменения в артериальном слое синусов Вальсальвы, окраска Н&Е, х50; В и Г - изменения эластических волокон артериального слоя синусов Вальсальвы, окраска орсеином по Харту, х50.
РИС. 2.
Изменения свободной створки полулунной заслонки: А - исходный образец; Б - расширение спонгиозной зоны при хранении в жидком азоте.
мультиорганного забора, 23 - у трупных доноров в первые 12 часов после смерти. Стерилизация аллографтов проводилась в растворе, содержащем 175,0 мл питательной среды RPMI 1640, 0,5 грамма цефазолина, 20,0 мл 0,5% метронидазола и 50,0 мл 0,2% флуконазола. Все алло-графты находились в данном растворе в течение 24 часов при температуре +4°С. Замораживание проводилось с использованием криопротектора диметилсульфоксида со скоростью 1 градус Цельсия в минуту до температуры -55°С. Раствор для криоконсервации состоял из 160 мл питательной среды RPMI 1640, 20 мл диметилсульфоксида и 20 мл 10% человеческого альбумина. Криоконсервация осуществлялась с использованием программного заморажива-теля в пакетах для криоконсервации фирмы Fresenius Kabi.
Хранение осуществлялось в течение 4 суток с применением двух режимов:
1. при температуре -196°С непосредственно в жидком азоте (n=10).
2. При температуре -150°С в парах жидкого азота (на 20 см выше уровня жидкой фазы) (n=12).
Размораживание проводилось с использованием трех режимов:
1. при температуре +36...42°С в течение 15 минут (n=10);
2. при температуре +18...20°С в течение 35 минут (n=7);
3. при температуре +8...10°С в течение 1 часа (n=10), (модификация РНПЦ «Кардиология»).
Размороженные аллографты оценивались визуально, проводились гидравлические тесты и гистологические исследования.
Визуальная оценка заключалась в оценке диаметра, конфигурации, консистенции, а также наличия трещин в стенке и створках аллографта.
Гидравлические испытания проводились путем нагнетания физиологического раствора в просвет аллографта, в котором дистальный конец и устья коронарных артерий были ушиты нитью пролен 3/0; повреждения и разрывы стенок аллографтов ушивали однорядным швом нитью пролен 4/0. Нагнетание и измерение давления подачи жидкости в мм рт. ст. осуществлялось с помощью присоединенного аппарата С-Fusor фирмы Medex.inc (Ohio, USA). Нагнетание жидкости проводилось до тех пор, пока не появлялись признаки недостаточности клапана.
Для гистологического исследования отбирались участки стенки аллографтов на уровне синусов Вальсальвы ниже линии синотубулярного соединения, а также створки клапанов. Препараты окрашивались гематоксилином и эозином, MSB, а также орсеином по Харту для выявления эластических волокон.
Результаты исследования
Визуальный контроль: после хранения и размораживания диаметр и конфигурация аллографтов оставались прежними по сравнению с исходными образцами. Размороженные аллографты имели одинаково плотную консистенцию при различных вариантах хранения и размораживания.
Целостность аллографта при различных вариантах размораживания.
1-й режим: при температуре размораживания +37°С (n=10) в 4 случаях имелись трещины в стенке аллографтов размером от 3 до 30 мм.
2-й режим: при проведении размораживания при температуре +18...20°С (п=7) в одном случае образовалась трещина в пульмональном аллографте размером до 35 мм, располагающаяся в средней трети легочного ствола. Аортальные аллографты дефектов не имели.
3-й режим: размораживание при температуре +8...10°С (п=10) не приводило к появлению трещин ни в пульмональных, ни в аортальных аллографтах.
Таким образом, с учетом макроскопической оценки третий режим размораживания не приводил к появлению разрывов в стенках аллографтов.
Гидравлические испытания. Все аллографты, независимо от режима хранения и размораживания, показали хорошие прочностные характеристики, в несколько раз превышающие их физиологические пределы. Так, пульмональные аллографты выдерживали давление до 256+63 мм рт. ст., а аортальные - до 542+54 мм рт. ст. При этом первоначально появлялась недостаточность пульмонального или аортального клапанов, а стенка аллографта и шов кондуита оставались состоятельными.
На основании результатов проведенных исследований можно сделать вывод о том, что различные режимы хранения и размораживания не приводят к уменьшению прочностных характеристик аллографтов.
Гистологические исследования. Размораживание аллографтов при температурных режимах +8...10°С (п=10) и +18...20°С (п=7) не приводило к изменениям гистологической структуры аллографтов по сравнению с нативными клапанами, которые не подвергались криосохранению и размораживанию.
При размораживании с использованием 1-го режима при температуре 37°С (п=10) во всех исследованных случаях выявлены морфологические изменения кондуитов, воспроизводимые в эксперименте. Наблюдалось незначительное расширение спонгиозной зоны свободного края заслонки аортального и пульмонального клапанов без изменения соотношения и конфигурации волокон и клеток соединительной ткани (рис. 1 А). Наиболее выраженными были изменения в артериальном слое синусов Вальсальвы и в медии аорты и легочной артерии. Их толщина была увеличена за счет разрыхления, снижения плотности упаковки коллагеновых волокон и наличия очагов их деструкции. Щели между измененными коллагеновыми волокнами были заполнены базофильным основным веществом, однако формирования им «гроздьевидных» структур не наблюдалось (рис. 1 Б).
Эластические волокна артериального слоя синусов Вальсальвы и медии также подвергались изменениям при размораживании с температурой +37°С. При окраске методом Харта в волокнах выявлялись очаги тотального эластолиза без признаков репарации (рис. 1В и Г).
При хранении аллографтов в течение 4 суток в парах жидкого азота (п=12) с последующим размораживанием при температуре +8...10°С не было выявлено изменений гистологической структуры аллографтов по сравнению с нативными клапанами, которые не подвергались криосохранению и размораживанию.
При хранении аллографтов в течение 4 суток непосредственно в жидком азоте (п=10) с последующим размораживанием аллографтов при температуре +8...10°С наблю-
далось расширение спонгиозной зоны свободной створки, нарушение соотношения и ориентирования коллагеновых волокон в краевой зоне: укорочение, потеря кучности, фрагментация (рис. 2).
Сходные изменения также были характерны для артериального слоя синуса Вальсальвы, где в медии был выражен миксоматоз, коллагеновые волокна были гомогенизированы, а гладкомышечные клетки - с глыбчатым цитолизом (рис. 3).
Деструктивные изменения коснулись и интимы артериального слоя: во всех исследованных аллографтах наблюдалась деэндотелизация с сохранением эндотелия лишь на небольшом протяжении интимы. В части образцов эндотелиальные клетки артериального слоя были набухшие, с чешуйчатым расположением, симулирующим мно-горядность, с нарушением полярности клеток в виде «забора». В единичных полях зрения эндотелиальные клетки были с кариопикнозом и кариорексисом. Эластическая
РИС. 3.
Изменение артериального слоя при хранении в жидком азоте: А - миксоматоз; Б - глыбчатый цитолиз миоцитов.
Ш % «ь I * * *' * > ) .** Л. ' * ■ - ■ ■ V V * * - 1 *,Л > . / * * ^ А . Б
к ' г * ■ "Ч !■* 1 ч- г г* .. " '■ * ■- » V в - * *' ч * у > Г^‘ *Г— ■* 5 * г
РИС. 4.
Изменения эндотелия и эластической мембраны при хранении в жидком азоте: А - набухшие эндотелиоциты;
Б - эндотелиоциты с чешуйчатым расположением; В, Г - деструкция и фибриноидное набухание эластической мембраны.
мембрана артериального слоя в большинстве полей зрения была разрушена тотально, ее эластические волокна -гомогенизированы, с фибриноидным набуханием и выраженной эозинофилией (рис. 4).
Выявленные морфологические изменения со стороны свободных створок в последующем могут приводить к замещению спонгиозного слоя соединительной тканью с потерей их подвижности и формированием функциональной недостаточности. Склерозированные полулуния, так же, как и медия артериального слоя, могут стать матрицей для дистрофического кальциноза, что, в свою очередь, может приводить к дисфункции аллографта.
Другим аспектом отдаленного прогноза результатов использования подобных аллографтов является вероятность септических и тромбоэмболических осложнений, в патогенезе которых непосредственная роль принадлежит повреждению эндотелия свободной створки клапана и интимы артериального слоя.
Важное значение в увеличении срока службы аллограф-та, а также качества и продолжительности жизни пациентов с трансплантированным аллографтом, имеет состояние устьев коронарных артерий. Субстратом для их вторичного стенозирования (как циркулярного, так и эксцентрического) атеросклеротическими бляшками выступает поврежденный эндотелий, эластическая мембрана, коллагеновые волокна и гладкомышечные клетки.
Выводы
1. Хранение аортальных аллографтов в парах жидкого азота при температуре -150°С является оптимальным, так как обеспечивает целостность, прочность аллографтов и сохранность их гистологической структуры. Хранение аллографтов непосредственно в жидком азоте хотя и обеспечивает их целостность и прочность, однако оказывает отрицательное влияние на гистологическую структуру, что может негативно сказаться на долговечности аллографтов.
2. Размораживание пульмональных и аортальных аллографтов в интервале температур от 8 до 10°С за 1 час является оптимальным, так как обеспечивает целостность, прочность аллографтов и сохранность их гистологической структуры.
ш
ЛИТЕРАТУРА
1. Petrou M., Wong K., Albertucci M. et al. Evaluation of unstented aortic homografts for the treatment of prosthetic aortic valve endocarditis. Circulation. 1994. № 90. Р. 198-204.
2. Przemyslaw Palka, Susan Harrocks, Aleksandra Lange, Darryl J., Burstow, Mark F. O'Brien. Primary Aortic Valve Replacement With Cryopreserved Aortic Allograft. Circulation. 2002. № 105. Р. 61-66.
3. Takkenberg J.J., Eijkemans M.J., van Herwerden L.A. et al. Prognosis after aortic root replacement with cryopreserved allografts in adults. Ann. Thorac. Surg. 2003. № 75. Р. 1482-1489.
