CC BY
23
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10012 УДК 619:616.9
Ключевые слова: Ureaplasma diversum, крупный рогатый скот, репродуктивные заболевания, ПЦР Keywords: Ureaplasma diversum, cattle, reproductive disorders, PCR
Ваганова А. Н.
ИССЛЕДОВАНИЕ РАСПРОСТРАНЁННОСТИ НОСИТЕЛЬСТВА UREAPLASMA DIVERSUM У ВЗРОСЛОГО КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В СЕВЕРО-ЗАПАДНОМ ФЕДЕРАЛЬНОМ ОКРУГЕ РОССИИ
ADULT CATTLE UREAPLASMA DIVERSUM CARRIAGE PREVALENCE RESEARCH AT RUSSIA
NORTH-WEST FEDERAL DISTRICT
ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Адрес: 197101, Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Мира, д. 14 Saint-Petersburg Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after Pasteur of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, Federal Budget Scientific Institution
Address: 197101, Russia, St.-Petersburg, Mira st., 14
Ваганова Анастасия Николаевна, науч. сотрудник. E-mail: van.inprogress@gmail.com. Тел: +7 (905) 236-94-53 Vaganova Anastasia N., Researcher. Е-mail: van.inprogress@gmail.com. Tel: +7 (905) 236-94-53
Аннотация. Ureaplasma diversum является оппортунистическим патогеном крупного рогатого скота. Как правило, колонизация репродуктивной системы животных не сопровождается выраженной симптоматикой, однако она может быть связана с абортами, бесплодием и заболеваниями репродуктивной системы крупного рогатого скота. U. diversum часто выявляется у животных, содержащихся на молочных животноводческих предприятий Северо-западного федерального округа России, где распространённость носительства может достигать 58,3 % на отдельных предприятиях. Колонизация преддверия влагалища U. diversum более распространена среди нетелей и первотёлок, чем среди коров старшего возраста. 75 % нетелей и 87 % первотёлок на отдельных хозяйствах могут быть носителями U. diversum, в то время как на тех же хозяйствах только 36 % коров после третьего отёла являются носителями. Таким образом, носительство U. diversum более распространено среди животных младшего возраста. Высокая частота носительства U.diversum среди поголовья животноводческих предприятий Северо-Западного региона может быть связана с возрастной структурой поголовий, отличающейся сдвигом в сторону более раннего возраста.
Summary. Ureaplasma diversum is a cattle opportunistic pathogen. It commonly persists asymptomatically in the reproductive system, but it also may be associated with abortion, infertility and other reproductive disorders of the cattle. U. diversum is widely spread in dairy cows in the Leningrad region of Russia, where the frequency of carriage is more than 58 % in particular farms. Colonization of vestibulum by U. diversum is more frequent in bred heifers and fresh cows, than in older age groups. 75 % of bred heifers and 87 % of fresh cows at particular farm may be the carriers of U. diversum, but at the same time only 36 % of cows after third calving are colonized by U. diversum in the same farm. So U. diversum carriage is more spread in younger animals. High frequency of U.diversum carriage in cattle from the Leningrad region may be related to the age pattern of dairy farm, that is specifically shifted to the younger age.
Введение
Уреаплазмы являются оппортунистическими патогенами, отличающимися строгой гостальной специфичностью и способностью к длительной персистенции на слизистых оболочках хозяина. Инфицированность коров уреаплазмами составляет в различных странах (13-52,9) % [5, 6, 8, 10]. При этом, несмотря на то, что носительство, как правило, протекает бессимптомно, отмечена более высокая частота выявления и. ё1увгзыт у коров и нетелей с симптоматикой заболеваний
репродуктивной системы, чем у здоровых животных [3]. Также носительство уреа-плазм в репродуктивном тракте часто сопровождается колонизацией органов половой системы крупного рогатого скота патогенными микоплазмами, в частности [4].
Несмотря на то, что носительство и. увгзыт в большинстве случаев протекает бессимптомно, колонизация репродуктивной системы коров данными уреаплазмами может приводить к абортам. Отмечено, что в Финляндии и. ё1увгзыт является веду-
36
щей причиной абортов у крупного рогатого скота [9].
Патологический процесс, развивающийся при заражении U. diversum, у коров характеризуется поражением слизистой оболочки преддверия влагалища в виде гранулярного вульвовагинита, сопровождающегося пустулёзной сыпью и гиперемией слизистой оболочки [1]. В отдельных случаях возможно развитие воспалительных процессов в области шейки матки и внутриматочных инфекций, приводящих к эндометритам, в том числе в послеродовом периоде, сальпингитам, оваритам, метритам и задержанию последа [2].
Для молодняка КРС характерно носи-тельство уреаплазм в респираторном тракте. Как правило, носительство U. diversum среди молодняка менее распространено, чем среди взрослого КРС. В различных странах установлена частота носительства уре-аплазм в респираторном тракте молодняка крупного рогатого скота (9-20,2) % [7]. Сур-фактант, продуцируемый эндотелием лёгких, обладает бактерицидной активностью в отношении уреаплазм, что может быть одним из факторов, сдерживающих развитие инфекционного процесса при колонизации лёгких U. diversum, поэтому носительство уреаплазм в респираторном тракте телят зачастую протекает бессимптомно. Однако развитие инфекционного процесса может вести к заболеваниям, протекающим в лёгкой, среднетяжёлой или тяжёлой формах, приводящим к гибели молодняка. Отмечено, что уреаплазмы значительно чаще выявляются в трахеобронхеальном лаваже у молодняка с симптомами респираторных заболеваний. При развитии бронхопневмонии, ассоциированной с U. diversum, у телят отмечается кашель, одышка, при обострении процесса возможна асфиксия. В качестве единственного этиологического агента U. diversum может выступать при гнойной пневмонии. Кроме того, U. diversum выделяется из легких телят при пневмонии в ассоциации с другими бактериями, в том числе микоплазмами, а также с вирусами [4]. Подобные смешанные инфекции характеризуются более тяжелым течением [7].
Молочное животноводство занимает ведущее место в агропромышленном комплексе Северо-Западного федерального округа Российской Федерации, поэтому распространение инфекционных заболеваний крупного рогатого скота может иметь существенные последствия для экономики региона. Целью данного исследования была оценка распространенности но-сительства U. diversum в поголовье молочных животноводческих хозяйств Северо-западного федерального округа.
Материалы и методы
Клинический материал
Исследуемую группу составляли коровы (п=89) и нетели (п=20) из поголовья трех животноводческих предприятий, расположенных в Северо-Западном федеральном округе России. Из поголовья предприятия № 1 было отобрано для исследования 27 взрослых коров, из поголовья предприятия № 2 — 32-е взрослых коровы и 20 нетелей, из поголовья предприятия № 3 — 30 взрослых коров. Таким образом, общее количество исследованных животных составило 109 голов.
С целью исследования были взяты мазки с поверхности слизистых оболочек преддверия влагалища (109 образцов). Забор материала у коров проводился в первые две недели после отела. Материал отбирался с помощью зондов-тампонов. Забор мазка из преддверия влагалища проводился в области нижнего свода влагалища с захватом области ямки клитора и локализации патологических изменений при их наличии.
Непосредственно после отбора зонды-тампоны помещались в пластиковые пробирки с пробкой, содержавшие 1,5 мл среды "УРЕАПЛАЗМА СРЕДА" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера) для поддержания жизнеспособности уреа-плазм до замораживания материала.
Непосредственно после отбора проб материал был заморожен при температуре -20 °С и перевезен для исследования в лабораторию молекулярно-биологических технологий НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (Санкт-Петербург, Россия) в термоконтейнерах, обеспечивающих поддержание температуры материала на уровне (-15±5) °С.
37
Выделение ДНК
Перед выделением ДНК зонд-тампон извлекался из транспортной среды. Транспортную среду в полном объеме переносили в микроцентрифужную пробирку типа эп-пендорф объемом 1,5 мл. Образец концентрировали 5-минутным центрифугированием при 14 000 g на центрифуге "MiniSpin" (Eppendorf, Германия). Надосадочную жидкость удаляли, осадок на дне пробирки использовали для выделения ДНК. Выделение ДНК из проводилось с помощью набора "ДНК-сорб-В" (ФБУН НИИ эпидемиологии, Москва) согласно инструкции.
К осадку добавлялось 300 мкл лизирую-щего раствора, входящего в состав набора. Осадок ресуспензировался в лизирующем растворе путем вортексирования и помещался в твердотельный термостат для лизиса при температуре 65° C на 5 минут. По окончании лизиса пробирки извлекались из твердотельного термостата. Для связывания ДНК в пробирки вносили по 25 мкл сорбента на основе кремниевых частиц (silica). После сорбции в течение 7-ми минут проводилась отмывка сорбента от белковых и других примесей путем его ресуспендирования в 300-х мкл отмывоч-ного раствора 1 с последующим осаждением сорбента центрифугированим при 5000 g и удаления супернатанта (однократно) и ресу-спендирования в 500-х мкл отмывочного раствора 2 с последующим осаждением сорбента центрифугированием при 10 000 g и удаления супернатанта (двукратно). По окончании процедуры отмывки осадок сорбента высушивался 5 минут при 65 °C, элюция ДНК проводилась в объеме 50 мкл буфера ТЕ в течение 5-ти минут при 65 °C.
ПЦР в реальном времени
Для выявления ДНК U. diversum применялась тест-система для ПЦР в реальном времени "Ureaplasma diversum Amp" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера). Постановку реакции проводили согласно инструкции. Для приготовления реакционной смеси использовали 5 мкл Реактива-Amp 1 и 10 мкл Реактива-Amp 2. В 15 мкл полученной смеси вносили 10 мкл препарата ДНК.
Для проведения реакции был использован амплификатор CFX96 (Bio-Rad, США). Детекция накопления продуктов амплификации проводилась по каналам FAM и HEX. По каналу FAM оценивалось накопление продукта амплификации специфической последовательности, содержащейся в геноме U. diversum. Детекция внутреннего контроля амплификации проводилась по каналу HEX. В качестве внутреннего контроля была использована специфическая последовательность в геноме крупного рогатого скота (Bos taurus). Интерпретация результата ПЦР в реальном времени проводилась согласно инструкции к используемому набору с использованием программного обеспечения CFX-Manager. В качестве достоверных результатов рассматривались только результаты, полученные в образцах, в которых при проведении ПЦР в реальном времени было отмечено накопление флуоресцентного сигнала по каналу HEX.
Статистический анализ
Статистическая обработка результатов исследований проводилась с использованием электронных таблиц Microsoft ® Office Excel. Для оценки различий между выборками был применен t-критерий Стьюдента. Для оценки взаимосвязи показателей использовался коэффициент корреляции Пирсона. Значение P<0,05 рассматривалось как статистически значимое.
Результаты исследования
Для исследования на предмет распространения носительства U. diversum в поголовье молочных хозяйств Северо-Западного федерального округа России случайным образом было отобрано 109 коров. У всех коров в исследуемой группе были взяты мазки из преддверия влагалища. Исследование препаратов ДНК, выделенных из мазков с поверхности слизистых оболочек преддверия влагалища, выявило ДНК крупного рогатого скота в 108-ми из 109-ти образцов. В одном образце была отмечена деградация ДНК крупного рогатого скота, и он был исключен из дальнейшего анализа. По результатам проведенного
38
исследования уровень инфицированности U. diversum в Северо-Западном федеральном округе среди коров достаточно высок и составляет 58,3 %, то есть 63 животных из 108-ми обследованных.
Для 32-х коров и 20-ти нетелей из хозяйства № 2 были доступны данные о возрасте обследованных животных. Материал у коров отбирался в родильном отделении, где на момент исследования находились все включенные в исследуемую группу животные. Нетели содержались в отдельном здании, обособленном от мест содержания молодняка и коров старшего возраста. На момент отбора материала все обследованные коровы содержались в родильном отделении хозяйства. Взятие мазков проводилось в помещениях, где животные содержались на момент проведения исследования.
При исследовании мазков с поверхности слизистых оболочек преддверия влагалища, полученных от 20-ти нетелей, методом ПЦР в реальном времени носительство U. diversum было обнаружено в 15-ти случаях (75 %). Носительство U. diversum в репродуктивном тракте взрослых коров отмечалось реже и составило 18 случаев из 32-х (56,25 %).
При этом в группе животных, у которых материал отбирался после первой стельности, частота носительства U. diversum составляла 87 % (7 из 8-ми случаев); среди коров, обследованных после второй стельности, частота носительства U. diversum отмечалась реже и составила 53,8 % (7 из 13-ти случаев), а в группе коров, обследованных после трех и более стельностей, составила
36,6 % (4 из 11-ти случаев). Таким образом, отмечалась тенденция к снижению частоты носительства и. Оуетзит в исследованных группах коров старшего возраста (табл. 1).
При сравнении частоты носительства и. Оуетзит в группах коров, разделённых по показателю числа стельностей (от 0-ля до 7-ми), было установлено, что между числом случаев носительства и. Оуетзит и количеством отёлов у коров в оцениваемой группе существует выраженная обратная связь (1=0,83, р<0,01).
Сопоставление среднего числа стель-ностей у группы животных, в преддверии влагалища которых была обнаружена и. сНувгзыт, и группы, в которой носительства и. Оуетзит выявлено не было, также показало, что среднее число стельностей у носителей и. Оуетзит значительно ниже (2,2 стельности), чем у коров, не являющихся носителями и. Сгеюит (3,2 стельности), р<0,05.
Обсуждение
Полученный показатель распространения носительства и. Оуетзит среди поголовья крупного рогатого скота в Северо-Западном федеральном округе составил 53,8 %. Данное значение превышает аналогичные показатели, полученные при обследовании крупного рогатого скота в других странах Европы, составлявшие (36-40) % [5, 6]. Одной из возможных причин является преобладание в европейских странах небольших фермерских хозяйств, в то время как хозяйства А, Б и В, на которых был проведён отбор клинического материала, являются крупными животновод-
Таблица 1
Распространение носительства U. diversum среди коров различных возрастных групп
Число стельностей Количество обследован- Количество случаев коло- Частота носительства
в группе ных животных низации U. diversum U. diversum
0 (нетели) 20 15 75 %
1 8 7 87 %
2 13 7 53,8 %
3 2 1 50 %
4 3 1 33 %
5 2 0 0 %
6 3 1 33 %
7 1 1 100 %
ческими комплексами. Данный тип организации молочных хозяйств является преобладающим на территории Северо-Западного федерального округа и других регионов России. Как правило, продолжительность жизни коров на крупных предприятиях короче, чем в условиях небольших фермерских хозяйств, поэтому в выборках, отобранных случайным образом, преобладают животные более молодого возраста, нетели и коровы после (1-2) стельностей, то есть группы, в которых носи-тельство U. diversum встречается чаще, чем среди коров более старшего возраста.
Таким образом, различия по возрастной структуре поголовья между Северо-Западным федеральным округом и странами Европы могут быть одним из возможных объяснений более высоких показателей частоты носительства U. diversum в поголовье крупного рогатого скота молочных хозяйств Северо-Западного федерального округа России.
Заключение
При исследовании распространённости U. diversum в поголовье молочных хозяйств Северо-Западного региона России было отмечено, что показатели частоты носительства данных уреаплазм значительно выше, чем в европейских странах, и составляют порядка 58,3 %. При этом большая часть случаев носительства приходится на возрастные группы младшего возраста, нетелей и коров первотёлок. Одним из вероятных объяснений высокой частоты носительства U. diversum в связи с этим являются особенности содержания крупного рогатого скота, в результате которых нетели и коровы-первотёлки, то есть возрастные группы, в которых носи-тельство U. diversum наиболее распростра-
нено, преобладают в возрастной структуре поголовья.
Список литературы
1. Doig P.A., Ruhnke H.L., N.C. Palmer Experimental bovine genital ureaplasmosis I. Granular vulvitis following vulvar inoculation // Can J Comp Med. 1980. Vol. 77. № 3. P. 252-258.
2. Hannan P.C. Guidelines and recommendations for antimicrobial minimum inhibitory concentration (MIC) testing against veterinary mycoplasma species. International Research Programme on Comparative Mycoplasmology // Vet Res. 2000. W. 31. № 4. P. 373-395.
3. Mulira G.L., Saunders J.R., Barth A.D. Isolation of Ureaplasma diversum and mycoplasmas from genital tracts of beef and dairy cattle in Saskatchewan Mulira // Can Vet J. 1992. Vol. 33. № 1. P. 46-49.
4. Larsen L.E., Tegtmeier C., Pedersen E. Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) pneumonia in beef calf herds despite vaccination // Acta Vet Scand. 2001. Vol.42. № 1. P. 113-121.
5. Le Grand D., Poumarat F., Martel J.L. Genital Ureaplasma diversum infection: investigations in cattle in France // Vet Res. 1995. Vol. 26. № 1. P. 11-20.
6. Petit T. Prevalence of Chlamydiaceae and Mollicutes on the genital mucosa and serological findings in dairy cattle / T. Petit, J. Spergser, J. Aurich, R. Rosengarten // Vet Microbiol. 2008. Vol. 127. № 3-4. P. 325-333.
7. Tegtmeier C. Pathological and microbiological studies on pneumonic lungs from Danish calves / C. Tegtmeier, A. Uttenthal, N.F. Friis, N.E. Jensen, H.E. Jensen // Zentralbl Veterinarmed B. 1999. Vol. 46. № 10. P. 693-700.
8. ter Laak E.A., Noordergraaf J.H., Dieltjes R.P. Prevalence of mycoplasmas in the respiratory tracts of pneumonic calves // Zentralbl Veterinarmed B. 1992. Vol. 39. № 8. P. 553-562.
9. Syrjala P. Causes of bovine abortion, stillbirth and neonatal death in Finland 1999-2006 / P. Syrjala, M. Anttila, K. Dillard [et al.] // Acta Vet Scand. 2007. № 46. doi:10.1186/1751-0147-49-S1-S3.
10. Virakul P. Genital tract lesions and the isolation of ureaplasma diversum from the reproductive tract of normal and repeat breeding dairy cows / P. Virakul, K. Hongyantarachai, K. Mahaviroon [et al.] // The Thai Journal of Veterinary Medicine. 2001. Vol. 31. № 4. P. 33-40.
41
Подписной индекс журнала «Актуальные вопросы ветеринарной биологии»:
Агентство «Росспечать» - 33184
