CC BY
1
DOI: 10.48612/sbornik-2023-1-47 УДК 574.24 579.262:578.4:636.5
ИССЛЕДОВАНИЕ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ЭНДОЛИЗИНОВ ПСЕВДО-Т-ЧЕТНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ RB43 И RB49 В ПРИРОДЕ С ПОМОЩЬЮ АНАЛИЗА БАЗ ДАННЫХ
Зимин Андрей Антонович1, канд. биол. наук Никулина Александра Николаевна1, аспирант Никулин Никита Алексеевич1, аспирант
Кощаев Андрей Георгиевич2, д-р биол. наук, профессор, академик РАН Осепчук Денис Васильевич2, 3, д-р с-х. наук
1Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований РАН», г. Пущино, Российская Федерация
2ФГБНУ «Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии», г. Краснодар, Российская Федерация
3ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина», г. Краснодар, Российская Федерация
Распространение эндолизинов псевдо - Т - четных бактериофагов RB43 и RB49 в природе исследовано с помощью анализа баз данных генетических последовательностей. Всего по сходству с аминокислотной последовательностью эндолизина бактериофага RB43 программой BLASTp в базе данных GenBank было найден 42 белка, в том числе и эндолизин бактериофага RB49. Сравнительный анализ 42 последовательностей методами UPGMA и Minimum Evolution показал, что все последовательности из различных бактериофагов кластеризуются в две хорошо различающиеся группы, группа эндолизина RB43 и группа эндолизина RB49. Следовательно, этих белки могут использоваться как генетические маркеры для селекции трансдуци-рующих бактериофагов при получении препаратов, состоящих из нетрансдуцирующих фагов, для фаговой терапии колибактериозов в ветеринарии и зоотехнии.
Ключевые слова: фаговая терапия; фаговая трансдукция; псевдо - Т - четные бактериофаги RB43 и RB49; эндолизины
STUDY OF DISTRIBUTION OF ENDOLYSINS OF PSEUDO-T-EVEN BACTERIOPHAGES RB43 AND RB49 IN NATURE USING DATABASE ANALYSIS
Zimin Andrei Antonovich1, PhD Biol. Sci.
Karmanova Alexsandra Nikolaevna1, PhD student
Nikulin Nikita Alekseevich1, PhD student
Koshchaev Andrei Georgievich 3, Dr. Biol. Sci., academican RAS
Osepchuk Denis Vasilyevich23, Dr. Agr. Sci.
1Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms named after G. K. Scriabin RAS - a separate subdivision of the Federal Research Center "Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences", Pushchino, Russian Federation
2Krasnodar Research Centre for Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Krasnodar, Russian Federation 3Kuban State Agrarian University named after I. T. Trubilin, Krasnodar, Russian Federation
Distribution of endolysins of pseudo - T - even bacteriophages RB43 and RB49 in nature was investigated using the analysis of databases of genetic sequences. In total, 42 proteins were found by the BLASTp program in the GenBank database based on the similarity to the amino acid sequence of bacteriophage RB43 endolysin, including RB49 bacteriophage endolysin. Comparative analysis of 75 sequences using the UPGMA and Minimum Evolution methods showed that all sequences from different bacteriophages clustered into two well-differentiated groups, the RB43 endolysin group and the RB49 endolysin group. Therefore, these proteins can be used as genetic markers for the selection of
transducing bacteriophages in obtaining preparations consisting of non-transducing phages for phage therapy of colibacillosis in veterinary medicine and zootechnics.
Key words: phage therapy; phage transduction; pseudo-T-even bacteriophages RB43 and RB49; endolysins
Патогенные штаммы Escherichia coli являются возбудителями ряда заболеваний поросят и птицы. Этот сельскохозяйственный патоген, вызывающий широкий спектр значимых для животноводства инфекций, доступен для лечения с помощью фаговой терапии [1, 4]. Вирулентные бактериофаги, родственные Т4 в большинстве не способны к горизонтальному переносу генов.
Ветви, соответствующие разделам, воспроизведенным менее чем в 50 % репликах начальной загрузки, свернуты. Рядом с ветвями показан процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (1000 повторов). Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода максимального составного правдоподобия и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. В этом анализе использовались 75 нуклеотидных последовательностей. Все неоднозначные позиции были удалены для каждой пары последовательностей (опция попарного удаления). Эволюционный анализ проводился в MEGA X [7]. Эндолизины бактериофагов Escherichia coli отмечены кружками, бактериофагов RB43 и RB49 - зачерненными кружками.
Открытие Таняшиным В.И. и его колле-
гами [9, 10] у так называемых «псевдо - Т -четных» бактериофагов способности к транс-дукции генов устойчивости к антибиотикам плазмидной локализации, поставило вопрос о создании методов селекции трансдуцирую-щих и нетрансдуцирующих бактериофагов среди Т4-родственных. Ранее мы описали подходы к получению препаратов не транс-дуцирующих бактериофагов для профилактики колибактериозов у поросят [5]. Методы отбора трансдуцирующих и нетрансдуцирующих бактериофагов требуют расширение используемых специфичных генетических маркеров. Ранее нами были описаны эндолизины трансдуцирующих бактериофагов RB43 и RB49, как белки лизиса альтернативные ли-зоциму бактериофага Т4 [8]. Такое их отличие ставит их в первй ряд специфических генетических маркеров для поиска в природе транс-дуцирующих бактериофагов как новых инструментов геномной инженерии и для отделения их от трансдуцирующих бактериофагов при конструировании препаратом для фаговой терапии колибактериозов. В этой работе мы решили исследовать распространение последовательностей этих белков в природе путем анализа баз данных генетических последовательностей.
100
49
FC
£ £
FC
FC
te
YP 003580002.1 endolysin Klebsiella phage KP15 YP 007348788.1 endolysin Klebsiella phage KP27
QYC51286.1 putative endolysin/peptidase Klebsiella phage vB KpnM-VAC66
UJP30840.1 endolysin Klebsiella phage Kpn35c1
UUG66951.1 L-alanyl-D-glutamate peptidase Klebsiella phage PSKm2DI
UQJ95116.1 hypothetical protein IANJMKHF 00210 Klebsiella phage CPRSA
UQJ95164.1 hypothetical protein IANJMKHF 00258 Klebsiella phage CPRSA
UQJ95601.1 hypothetical protein ALHIDCOG 00213 Klebsiella phage CPRSB
UJB55281.1 hypothetical protein Enterobacter phage vB EcRAM-01
UIW11514.1 MAG: endolysin Enterobacter phage ENC7
YP 009831175.1 endolysin Cronobacter phage vB CsaM leB
QVW27383.1 L-alanyl-D-glutamate peptidase Cronobacter phage JC03
YP 006986425.1 endolysin Cronobacter phage vB CsaM GAP161
O QUL77082.1 endolysin Escherichia phage UPEC03
0 YP 239135.1 endolysin Escherichia phage RB43
QJI10830.1 endolysin Buttiauxella phage vB ButM GuL6
QFR55740.1 peptidase M15 4 domain-containing protein Yersinia phage JC221
YP 009097759.1 endolysin Citrobacter phage Miller
0 YP 003858447.1 endolysin Escherichia phage RB16
0 YP 008060675.1 endolysin Escherichia phage Lw1
UQJ95117.1 hypothetical protein IANJMKHF 00211 Klebsiella phage CPRSA
QPI17811.1 peptidase M15 Pectobacterium phage POP12
QQV89622.1 endolysin Proteus phage SJ PmiM
YP 009195522.1 endolysin Proteus phage vB PmiM Pm5461
YP 010091976.1 endolysin Proteus phage PM2
YP 010093702.1 endolysin Proteus phage phiP4-3
AZV01235.1 hypothetical protein vBSdyM006 098 Shigella phage vB SdyM 006 QPB12256.1 peptidoglycan hydrolase Providencia phage PSTCR6 QQK88066.1 peptidoglycan hydrolase Providencia phage PSTRCR 127 YP 009279959.1 endolysin Morganella phage vB MmoM MP1 O QZI93951.1 L-alanyl-D-glutamate peptidase Enterobacteria phage Whisky 0 YP 002922178.1 endolysin Escherichia phage JSE 0 YP 010097388.1 endolysin Escherichia virus KFS-EC O QB064700.1 putative endopeptidase Escherichia phage vB EcoM G37-3 O QHJ73322.1 putative endolysin Escherichia phage Ec Makalu 001 0 YP 009602067.1 endolysin Escherichia phage ECD7 0 NP 891673.1 endolysin Escherichia phage RB49 O QOC55652.1 endolysin Escherichia phage JEP8 O QBQ74141.1 endolysin Escherichia phage vB EcoM PHB13 0 YP 001469446.1 endolysin Escherichia phage Phil O QMP82431.1 endolysin Escherichia phage vB EcoM 011D4 O QZI93420.1 L-alanyl-D-glutamate peptidase Enterobacteria phage Brandy
Рисунок 1 - Филогенетическое дерево эндолизинов, полученное с использованием метода
UPGMA
Результаты исследований. Было проведено сравнение аминокислотной последовательности эндолизина бактериофага RB43 программой BLASTp [9] в базе данных GenBank было найдено 74 белка, в том числе и эндолизин бактериофага RB49. Для дальнейшего филогенетического анализа мы исполь-
зовали подходы, описанные нами ранее [6, 7, 8]. Филогенетические деревья эндолизинов псевдо - Т - четных бактериофагов, полученные методами UPGMA и Minimum Evolution представлены на рисунках 1 и 2, соответственно.
UUG66951.1 L-alanyl-D-glutamate peptidase Klebsiella phage PSKm2DI UQJ95117.1 hypothetical protein IANJMKHF 00211 Klebsiella phage CPRSA UJP30840.1 endolysin Klebsiella phage Kpn35c1 YP 007348788.1 endolysin Klebsiella phage KP27
QYC51286.1 putative endolysin I peptidase Klebsiella phage vB KpnM-VAC66 UQJ95164.1 hypothetical protein IANJMKHF 00258 Klebsiella phage CPRSA UQJ95601.1 hypothetical protein ALHIDCOG 00213 Klebsiella phage CPRSB YP 003580002.1 endolysin Klebsiella phage KP15
QFR55740.1 peptidase M15 4 domain-containing protein Yersinia phage JC221 UJB55281.1 hypothetical protein Enterobacter phage vB EcRAM-01 UIW11514.1 MAG: endolysin Enterobacter phage ENC7 QVW27383.1 L-alanyl-D-glutamate peptidase Cronobacter phage JC03 YP 009831175.1 endolysin Cronobacter phage vB CsaM leB YP 006986425.1 endolysin Cronobacter phage vB CsaM GAP161 O QUL77082.1 endolysin Escherichia phage UPEC03
• YP 239135.1 endolysin Escherichia phage RB43 QJI10830.1 endolysin Buttiauxella phage vB ButM GuL6 YP 009097759.1 endolysin Citrobacter phage Miller О YP 003858447.1 endolysin Escherichia phage RB16 О YP 008060675.1 endolysin Escherichia phage Lw1
UQJ95116.1 hypothetical protein IANJMKHF 00210 Klebsiella phage CPRSA QPI17811.1 peptidase M15 Pectobacterium phage POP12 YP 010093702.1 endolysin Proteus phage phiP4-3
AZV01235.1 hypothetical protein vBSdyM006 098 Shigella phage vB SdyM 006 QPB12256.1 peptidoglycan hydrolase Providencia phage PSTCR6 YP 010091976.1 endolysin Proteus phage PM2 QQV89622.1 endolysin Proteus phage SJ PmiM YP 009195522.1 endolysin Proteus phage vB PmiM Pm5461 QQK88066.1 peptidoglycan hydrolase Providencia phage PSTRCR 127 YP 009279959.1 endolysin Morganella phage vB MmoM MP1 O QZI93951.1 L-alanyl-D-glutamate peptidase Enterobacteria phage Whisky О YP 002922178.1 endolysin Escherichia phage JSE О YP 009602067.1 endolysin Escherichia phage ECD7 O QHJ73322.1 putative endolysin Escherichia phage Ec Makalu 001 О YP 010097388.1 endolysin Escherichia virus KFS-EC O QB064700.1 putative endopeptidase Escherichia phage vB EcoM G37-3
• NP 891673.1 endolysin Escherichia phage RB49 O QOC55652.1 endolysin Escherichia phage JEP8 О YP 001469446.1 endolysin Escherichia phage Phil O GMP82431.1 endolysin Escherichia phage vB EcoM 011D4 O QZI93420.1 L-alanyl-D-glutamate peptidase Enterobacteria phage Brandy O QBQ74141.1 endolysin Escherichia phage vB EcoM PHB13
Рисунок 2 - Филогенетическое дерево эндолизинов, полученное с использованием метода Minimum Evolution. Эволюционная история выводилась с использованием метода минимальной эволюции [1]. Показано оптимальное дерево с суммой длин ветвей = 2,87411511. Рядом с ветвями показан процент повторяющихся деревьев, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (1000 повторов) [4]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием матричного метода JTT [9] и выражены в единицах количества аминокислотных замен на сайт. Поиск в дереве МЭ производился с использованием алгоритма Close-Neighbor-Interchange (CNI) [10] на уровне поиска 1. Для генерации начального дерева использовался алгоритм Neighbor-joining [5]. В этом анализе участвовали 42 аминокислотные последовательности. Все неоднозначные позиции были удалены для каждой пары последовательностей (опция попарного удаления). Всего в финальном наборе данных было 145 позиций. Эволюционные анализы проводились в MEGA X [7]. Остальные обозначения, как и на рисунке 1.
Выводы.
1. Распространение эндолизинов псевдо - Т - четных бактериофагов, RB43 и RB49, в природе исследовано с помощью анализа баз данных генетических последовательностей. Всего по сходству с аминокислотной последовательностью эндолизина бактериофага RB43 программой BLASTp в базе данных GenBank было найдено 42 белка, в том числе и эндоли-зин бактериофага RB49. Белки, сходные с эн-долизином бактериофага RB43, чаще встре-
чаются у фагов клебсиелл и лишь четыре принадлежат фагам Escherichia coli. 12 гомологов фермента лизиса бактериофага RB49 были обнаружены у фагов Escherichia coli, также они встречаются у фагов протея, про-виденсий и морганелл, и минорно у вирусов других бактерий.
Сравнительный анализ 42 последовательностей методами UPGMA и Minimum Evolution показал, что все последовательности из различных бактериофагов кластери-
зуются в две хорошо различающиеся группы, группа эндолизина RB43 (22 последовательности) и группа эндолизина RB49 (20 последовательностей). Следовательно, этих белки могут использоваться как генетические маркеры для селекции трансдуцирующих бактериофагов при получении препаратов, состоящих из нетрансдуцирующих фагов для фаговой терапии колибактериозов у поросят и птицы.
Благодарности. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-25-00669, https://rscf.ru/proiect/22-25-00669/
Список литературы
1. Зимин А. А. Использование бактериофагов для борьбы с колибактериозом и кампилобактериозом в птицеводстве / А. А. Зимин, Ф. В. Кочетков, С. И. Кононенко, Д. В. Осепчук, Н. Э. Скобликов // Политематический сетевой электронный научный журнал КубГАУ. - Краснодар: КубГАУ. - 2016. -№09(123). - С. 421-432.
2. Зимин А. А. Короновирусы и животноводство / А. А.Зимин, Д. В. Осепчук // Сборник научных трудов Краснодарского научного центра по зоотехнии и ветеринарии. - 2020. -Том - 9. - № 1. - С. 8-14.
3. Зимин А. А. Сравнение структурного белка денсовируса BmDNV-1 тутового шелкопряда с белками вирусов бактерий и архей для изучения возможности ложноположительных ответов при ИФА-тестировании гусениц / А. А. Зимин, Н. Э. Скобликов, Н. Н. Назипова, Д. В. Осепчук, А. Г. Кощаев // Политематический сетевой электронный научный журнал КубГАУ. - Краснодар: КубГАУ. - 2020. - № 161. - С. 150-160
4. Никулин Н. А. Конструирование терапевтических фаговых коктейлей на основе бактериофагов: преимущества и недостатки / Н.
А. Никулин, С. И. Кононенко, А. Г. Кощаев, А. А. Зимин // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ). - Краснодар: КубГАУ. -
2017. - №09(133).
5. Скобликов Н. Э. Выделение и отбор нетрансдуцирующих бактериофагов E. coli для противоколибактериозных препаратов / Н. Э. Скобликов, С. И. Кононенко, Д. В. Осепчук, Е. А. Москаленко, В. В. Авдиенко, А. А. Зимин // Политематический сетевой электронный научный журнал КубГАУ. - 2016. - №08(122). - С. 554-566.
6. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.
7. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. (2018). MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.
8. Mikoulinskaia G. V., Chernyshov S. V., Shav-rina M. S., Molochkov N. V., Lysanskaya V. Ya., Zimin A. A. Two Novel Thermally Resistant Endo-lysins Encoded by Pseudo T-Even Bacteriophages RB43 and RB49. Journal of General Virology. -
2018. - 99(3). - pp. 402-415, doi: 10.1099/jgv.0.001014.
9. Tanyashin V. I., Zimin A. A., Shlyapnikov M. G., Boronin A. M. Transduction of Plasmid Antibiotic Resistance Determinants with Pseudo-T-Even Bacteriophages. Russian Journal of Genetics, Vol. 39. - No. 7. - 2003, pp. 761-772. DOI: 10.1023/A:1024748903232.
10. Tanyashin V. I., Zimin A. A., Boronin A. M. The Cotransduction of pET System Plasmids by Mutants of T4 and RB43 Bacteriophages. Microbiology. - Vol. 72. - No. 6. - 2003. - pp. 694-700. DOI:10.1023/B: MICI.0000008372.06477.43.
