CC BY
48
УДК 615.454
Спирина В.О., Юдина А.Н. Красноштанова А.А.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ ИЗ СОЕВОГО И ЯИЧНОГО ЛЕЦИТИНА
Спирина Виталия Олеговна - бакалавр 3-го года обучения кафедры биотехнологии; Юдина Алеся Николаевна - магистрант 1-го года обучения кафедры биотехнологии;
Красноштанова Алла Альбертовна - доктор химических наук, доцент, профессор кафедры биотехнологии; e-mail: aak28@yandex.ru;
ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева» 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
В статье подробно рассмотрен тепловой способ получения липосом на основе соевого и яичного лецитина. Установлены размеры везикул. Методом микроскопии доказано неоднородность формообразования липосом ввиду их нестабильности.
Ключевые слова: липосомы, фосфолипиды, яичный лецитин, соевый лецитин, микроскопия
INVESTIGATION OF THE PROCESS OF OBTAINING LIPOSOMES FROM SOY AND EGG LECITHIN
Spirina V.O., Yudina A.N., Krasnoshtanova A.A.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
The article proposes the thermal method ofproducing liposomes based on soy and egg lecithin. The size of the vesicles was determined. It was proved the heterogeneity of liposome formation due to their instability using method of microscopy.
Keywords: liposomes, phospholipids, egg lecithin, soy lecithin, microscopy
Введение
Большинство современных исследований в области создания наноконтейнеров, обеспечивающих контролируемый и направленный транспорт биологически активных веществ (БАВ), ориентированы на создание липосомальных форм. Липосомы, как системы доставки, обладают рядом преимуществ, главными из которых являются отсутствие проявления антигенных свойств, биодеструктивность, снижение общетоксического действия включенного препарата, направленность формы лекарственной доставки, а также способность предотвращения от разрушающего действия ферментов желудочно-кишечного тракта
индивидуальных соединений белковой природы [1]. Именно поэтому липосомальные везикулы широко применяются для создания противоопухолевых препаратов в качестве убедительной альтернативы против привычных методов химиотерапии при введении цитостатиков, осложняющих самочувствие пациента угнетением пролиферации клеток кроветворных и иммунокомпетентных органов человека [2]. Для генной инженерии по сей день остается актуальным создание адресной доставки липосомальных форм препаратов, избирательно воздействующих на гены, ответственные за развитие патологических заболеваний, путем конструирования искусственных комплексов, в составе которых присутствуют фрагменты нуклеиновых кислот [3]. Широкое применение данная форма приобрела в области создания лечебных косметических средств
[4]. Таким образом, липосомы представляют собой перспективную форму инкапсулированния биологически активных соединений разной природы.
Липосомы - это нановезикулы сферической формы, самопроизвольно формирующиеся из фосфолипид-содержащих суспензий и
представляющие собой замкнутые пузырьки или полые капсулы. То есть основным компонентом липосом являются сложные липиды, содержащие остаток фосфорной кислоты - фосфолипиды (ФЛ). Данная структурная единица (ФЛ) может быть производным как растительного сырья, к примеру, сои, так и животного - выделенного из яичного желтка. Сходство структурной организации таковых с фосфолипидами человека обуславливает их способность встраиваться в клеточные мембраны и предупреждать процессы нарушения их целостности [1]. Согласно литературным данным современные методы по изготовлению липосом варьируются в области звукового и конвекционного воздействий; применяются методы растворения и удаления детергента, испарения с обращением фаз [5]. Таким образом, цель данной работы заключается в исследовании процессов получения липосомальных форм из фосфолипидов растительного и животного происхождения.
Экспериментальная часть
В качестве объектов исследования для получения липосом применяли соевый лецитин МОСЛЕЦИТИН (гранулированный порошок) ТУ 10.89.19-001-17545703-2020 производства фирмы
ООО «ВИТАПРОМ» по заказу ООО «Экобио плюс», содержащий 95% фосфолипидов и яичный лецитин ГОСТ 32052-2013 производства «Nature's Plus».
Идентификацию липосом проводили с помощью метода микроскопии препарата «раздавленная капля» при общем увеличении микроскопа 40^10 [6].
Измерение размеров липосом осуществляли методом оптической микроскопии. Готовили препарат «раздавленная капля», при увеличении 40^10 с помощью оптического микроскопа получали изображение. Для получения цифровых изображений использовали программный пакет «Top View», модель камеры - UCMOS3100KPA. Обработку изображений производили с использованием программы «Image Tool». В качестве параметра, характеризующего размер частиц, использовали наибольшую длину хорды в заданном направлении. В расчёты принимали только те частицы, которые находились на одной из половинок границ прямоугольного поля (находящиеся внутри него, на верхней вертикальной и на верхней горизонтальной сторонах, на пересечении этих сторон и на другом конце одной из них). Частицы, находящиеся на остальных сторонах и в углах, не учитывали [7].
В соответствие с простотой проведения процедуры получения липосом был выбран тепловой метод.
Первоначально проводили эксперименты с использованием соевого лецитина. Навеску исходного лецитина гомогенизировали в таком объеме дистиллированной воды, чтобы содержание липида в среде составляло 0.5, 0.75, 1.0, 2.0 и 3.0 масс%, после чего гомогенат подвергли гидратированию в течение двух часов. Далее к полученной суспензии добавляли 3.0 об% глицерина и термостатировали 30 мин при 65-70°С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. По истечение времени термостатирования смесь выдерживали один час при указанной температуре [8].
Приготовленные растворы анализировали на образование липосом с помощью микроскопии через 1 неделю. Полученные результаты представлены на рисунке 1.
По представленным данным можно судить о визуальной неоднородности формы везикул. Методом оптической микроскопии были измерены размеры липосом. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Рисунок 1. - Результаты микроскопии липосом на основе соевого лецитина, полученных после инкубации в течение 1 недели. Концентрация вносимого лецитина: а) 0.5% масс. б) 0.75% масс., в) 1.0 % масс.,
г) 2.0 % масс., д) 3.0 % масс. Таблица 1. - Результаты измерения липосом на основе соевого лецитина
Номер Концентрация, Средний диаметр Подсчитанное Максимальный Минимальный
фракции масс% частиц, мкм число частиц диаметр частиц, мкм диаметр частиц, мкм
1 0.50 15.49 12 23.36 5.63
2 0.75 18.86 14 36.87 8.22
3 1.00 44.86 8 87.41 24.6
4 2.00 17.04 5 22.65 2.27
5 3.00 2.88 21 6.36 1.29
При проведении повторной процедуры микроскопирования через 2 и 3 недели были обнаружены липосомы более крупного размера, что может быть объяснено процессом коагуляции из-за нестабильного состояния везикул.
Для того, чтобы предотвратить процесс слипания липосом, было решено провести дезинтегрирование эмульсий представленных концентраций. Таким образом, исходные растворы подвергли гомогенизации с помощью дезинтегратора в течение 1 минуты со скоростью 1000 об/мин. Однако данный метод не позволил получить
сохраняющие стабильность в течение длительного времени липосомы сферической формы.
Далее был подробно исследован яичный лецитин. Навеску исходного субстрата гомогенизировали в таком объеме дистиллированной воды, чтобы содержание липида в среде составляло 0.5, 0.75, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 и 5.0 масс%, после чего подвергли гидратированию в течение двух часов. Далее к полученной суспензии добавляли 3.0 об% глицерина и термостатировали 30 мин при 65-70°С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. По истечению времени термостатирования
смесь выдерживали один час при указанной температуре [8].
Приготовленные растворы анализировали на образование липосом с помощью микроскопии через 1 неделю. Полученные результаты представлены на рисунке 2.
По представленным данным можно судить о визуальной неоднородности формы везикул. Методом оптической микроскопии были измерены размеры липосом. Полученные результаты представлены в таблице 2.
пхпи:
я) 6) в) г) д) е) ж)
Рисунок 2. - Рисунок 1. - Результаты микроскопии липосом на основе яичного лецитина, полученных после инкубации в течение 1 недели. Концентрация вносимого яичного лецитина: а) 0.5% масс. б) 0.75% масс., в) 1.0 % масс., г) 2.0 % масс., д) 3.0 % масс, е) 4.0 % масс., ж) 5.0 % масс.
Таблица 2. - Результаты измерения липосом на основе яичного лецитина
Номер Концентрация, Средний диаметр Подсчитанное Максимальный Минимальный
фракции масс% частиц, мкм число частиц диаметр частиц, мкм диаметр частиц, мкм
1 0.50 10.87 2 10.87 10.87
2 0.75 2.38 3 2.45 2.32
3 1.00 2.22 17 3.41 0.54
4 2.00 34.48 6 72.57 8.62
5 3.00 31.04 11 64.13 13.83
6 4.00 6.46 36 44.23 2.83
7 5.00 9.71 44 42.81 3.41
Также, как с соевым лецитином, при проведении повторной процедуры микроскопирования через 2 и 3 недели были обнаружены липосомы более крупного размера, что также может быть объяснено процессом коагуляции из-за нестабильного состояния везикул.
Для того, чтобы предотвратить процесс слипания липосом, было проведено
дезинтегрирование эмульсий представленных концентраций. Исходные растворы подвергли гомогенизации с помощью дезинтегратора в течение 1 минуты со скоростью 1000 об/мин. Данный метод не позволил получить сохраняющие стабильность в течение длительного времени липосомы сферической формы. Заключение
В результате проведенных исследований было установлено, что предложенный способ не позволяет получить стабильные в течение длительного времени липосомы, как на основе соевого, так и на основе яичного лецитина. Поэтому дальнейшие исследования будут направлены на поиск путей стабилизации липосом, а также исследованию процессов включения в них различных биологически активных веществ.
Список литературы
1. Шанская А.И., Пучкова С.М., Яковлева Т.Е. Липосомы - перспективная форма лекарственных препаратов // Медицина экстремальных ситуаций. - 2011. - №3 (37).
2. Райков А. О., Матюшин А.А., Краснюк И.И. Оптимизация метода получения липосомальной
формы митоксантрона // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - №4.
3. Сухишвили С. А., Интерполиэлектролитные комплексы, содержащие ДНК: взаимодействие с липосомами /С. А. Сухишвили, О. Л. Обольский, И. В. Астафьева, А. В. Кабанов, А. А. Ярославов // ВМС. Серия А. - 1993. - №11.
4. Кожанова К.К., Жетерова С.К., Великая Т.В. Липосомы - системы направленной доставки БАВ // Вестник КазНМУ. - 2014. - №5.
5. Новикова А.А., Кезимана П., Станишевский Я.М. Методы получения липосом, используемых в качестве носителей лекарственных средств (обзор) // Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2017 - с. 134-138.
6. Кусакина М.Г., Суворов В.И., Чудинова Л.А. Большой практикум «Биохимия». Лабораторные работы: учеб. Пособие - Перм. гос. нац. исслед. ун-т.-Перм. - 2012. - с. 5-11.
7. Коллоидная химия. Практикум и задачник: Учебное пособие / Под ред. В. В. Назарова, А. С. Гродского. — СПб: Издательство «Лань», 2019. — 436 с.: ил. — (Учебники для вузов. Специальная литература). ISBN 978-5-8114-3430-5
8. Забодалова Л.А, Чернявский В.А, Ищенко Т.Н, Скворцова Н.Н. Получение липосом из соевого лецитина // Научный журнал НИУ ИТМО. Серия «Процессы и аппараты пищевых производств». -2011. - №2.
