CC BY
15
УДК 573.6.086.83:664.022.3
DOI 10.46845/1997-3071 -2021-61-76-82
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ОПОРНО-КАРКАСНЫХ И ПОКРОВНЫХ ТКАНЕЙ ГИДРОБИОНТОВ
И. О. Орлов, Е. С. Землякова
STUDY OF THE PROCESS OF ENZYMATIC HYDROLYSIS OF THE SUPPORT-SKELETON AND INTEGUMENTARY TISSUES
OF HYDROBIONTS
I. O. Orlov, E. S. Zemlyakova
В условиях современного ритма жизни особенно остро встает проблема увеличения количества людей с заболеваниями суставов и хрящей. Для проведения профилактических мер и снижения случаев возникновения острой формы заболеваний специалистами рекомендуется применение в пищу биологически активных добавок и препаратов, содержащих естественные компоненты хрящевой ткани - гликозаминогликаны (ГаГ). Их также называют хондропротекторами или веществами, обладающими хондропротекторным действием. Одним из наиболее эффективных способов получения таких веществ является ферментативный гидролиз сырья, богатого гликозаминогликанами. Таким источником традиционно выступают ткани крупного рогатого скота. Однако для повышения экономической эффективности перспективнее вторичное сырье гидробионтов. Ряд исследований подтверждает, что хондроитин сульфат (входящий в состав комплекса ГаГ), вырабатываемый из сырья гидробионтов, по своему строению ближе к человеческому. Так, в гидробионтах преобладает хондроитин-6-сульфат, который отличается своим паттерном сульфатирования от хондроитин-4-сульфата. Целевой композицией, получаемой в процессе ферментативного гидролиза, является комплекс легкоусвояемых веществ, в том числе и сульфатированные гликозаминогликаны (сГаГ). При использовании тканей судака суммарная доля сГаГ, полученная после ферментации, составила 3,3 %, тканей минтая - 2,8 % в пересчете на сухое вещество. В процессе проведения гидролиза были изучены такие показатели, как фор-мольнотитруемый азот (ФТА), степень гидролиза, накопление сухих веществ и накопление сульфатированных гликозаминогликанов. Изучение этих показателей позволяет не только более точно оценивать состояние процесса, но и оптимизировать сами параметры гидролиза для достижения больших показателей выхода целевого вещества.
ферментативный гидролиз и его показатели, вторичное сырье гидробионтов, хондропротекторы, сульфатированные гликозаминогликаны, папаин
In the conditions of the modern rhythm of life, a problem of increasing the number of people with diseases of diarthrosis and cartilage is particularly acute. To carry out preventive measures and reduce the occurrence of acute diseases, experts recommend
the use of dietary supplements and preparations containing natural components of cartilage tissue-glycosaminoglycans. Such substances are also called chondroprotectors or substances that have a chondroprotective effect. One of the most effective ways to obtain such substances is enzymatic hydrolysis of raw materials rich in glycosaminogly-cans (GaG). Such a source is traditionally the tissue of cattle. However, to increase economic efficiency, a promising raw material is the secondary raw material of hydrobi-onts. A number of studies confirm that chondroitin sulfate (which is part of the GaG complex) obtained from raw materials of hydrobionts is closer to human in its structure. Thus, chondroitin-6-sulfate predominates in hydrobionts, which differs in its sulfation pattern from chondroitin-4-sulfate. The target composition obtained in the process of enzymatic hydrolysis is a complex of easily digestible substances, including sulfated glycosaminoglycans (sGAG), when using walleye tissues, the total proportion of sGAG obtained after fermentation was 3.3 %, pollock tissues - 2.8 % in terms of dry matter. In the process of hydrolysis, such indicators as formol-titrated nitrogen (FTN), the degree of hydrolysis, the accumulation of dry substances and the accumulation of sulfated gly-cosaminoglycans were studied. The study of these indicators allows not only to more accurately assess the state of the process, but also to optimize the hydrolysis parameters themselves to achieve high yield indicators of the target substance.
enzymatic hydrolysis and its parameters, secondary raw materials of hydrobionts, chondroprotectors, sulfated glycosaminoglycans, papain
ВВЕДЕНИЕ
Одним из основных факторов ухудшения качества жизни человека являются заболевания опорно-двигательного аппарата. Среди всей группы этих заболеваний основная доля приходится на остеоартроз.
Остеоартроз - это дегенеративно-дистрофическое заболевание суставов. Причиной развития данного заболевания, как правило, является нарушение метаболизма хрящевой и суставной тканей. Это может быть связано как с невозможностью организма синтезировать новые тканевые соединения, так и с нарушениями самого процесса продуцирования, вызванного недостатком основных веществ, а также катализаторов данного процесса.
Морфология остеоартроза крайне сложна и комплексна, что делает невозможным купировать или же полностью вылечить его, используя только один вектор лечения. Поэтому современная терапия делает упор на комплексный подход. Одним из этапов лечения является остановка разрушения хрящевой ткани путем введения в организм особой группы веществ, называемой хондропротекторами.
Хондропротекторы - это гликозаминогликаны - естественные компоненты хрящевой ткани. В организме они связаны пептидной связью с коллагеном. Современные исследования показывают, что гликозаминогликаны способны не только участвовать в метаболизме новой ткани, но и запускать данные реакции, что позволяет значительно ускорить терапию [1-5].
Сырьем для производства хондропротекторов служат хрящи крупного рогатого скота, а также акул и скатов. В связи с этим итоговая стоимость продукта становится достаточно высокой, что ограничивает круг людей, способных приобрести данные препараты. Поэтому на сегодняшний день большой интерес вызывают исследования, направленные на удешевление получаемых хондропротекото-ров путем оптимизации параметров производства и использования более доступного сырья [6-8].
Традиционно для получения гликозаминогликанов применяется кислотный гидролиз. Такой способ хоть и позволяет обеспечить высокий выход целевого вещества, но из-за большого количества операций, необходимых для предподготов-ки и постобработки, процесс становится не только дорогостоящим для производства, но также неэкологичным, да еще и занимает значительно больше времени, чем при других способах получения.
Цель исследования: оценить процесс ферментативного гидролиза вторичного рыбного сырья, а именно опорно-каркасных и покровных тканей судака и минтая, через такие показатели, как накопление формольнотитруемого азота, сухих веществ, суммарного количества гликозаминогликанов в готовом полуфабрикате и степень гидролиза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для исследования процесса ферментативного гидролиза опорно-каркасных и покровных тканей (ОКиПТ) судака и минтая использовались два ферментных препарата: папаин (производство Аготагй, Россия) и алкалаза (производство Аштох, Германия). В соответствии с литературными данными выбранные ферментные препараты обладают протеолитической и коллагеназной активностью, что позволяет применять их для сырья, содержащего большое количество соединительной ткани. С целью увеличения выхода целевой композиции ткани подвергались дополнительной обработке - проварке, это способствовало частичному удалению нежелательных легкоокисляющихся липидов, а также в дальнейшем значительно облегчало процесс измельчения сырья.
После термообработки последнее измельчалось с использованием мясорубки для достижения более высокой степени взаимодействия с ферментом. В табл. 1 представлен план исследований: вид сырья, ферментные препараты и их количество, вводимое в систему.
Показатель формольнотитруемого азота (ФТА) определяли по методике формольного титрования, предназначенной для определения аминного азота свободных (концевых) аминогрупп в препаратах аминокислот, пептидов, белков и других с содержанием азота 1,5-5,0 мг в 1 мл испытуемого раствора. Данный метод (метод Серенсена) основан на защите формальдегидом свободных аминогрупп с образованием оснований Шиффа и алкалиметрическом титровании эквивалентного количества карбоксильных групп. Он неприменим в присутствии ионов аммония, обуславливающих получение завышенных результатов определения.
Таблица 1. План исследований
Table 1. Research plan
Номер Сырье Ферментный препарат Количество фермента,
исследования %
1 ОКиПТ судака Папаин 1,5
2 То же То же 3
3 - « - Папаин + алкалаза 1,5 + 1,5
4 ОКиПТ минтая Папаин 3
В качестве одного из показателей процесса ферментативного гидролиза использовался показатель степени гидролиза (СГ), который вычислялся по формуле (1)
СГ = * юо%, (1)
\Noa-Паао! ' 4 у
где Noa - содержание общего азота, %; NAA0 - содержание аминного азота в негидролизованном сырье, %; Naa - содержание аминного азота в гидролизате после гидролиза в течение периода времени т, %.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ График накопления ФТА, который является наиболее наглядным динамическим показателем стабильности протекания гидролиза, показан на рис. 1. Лучше всего накопление ФТА проходило в опыте с ОКиПТ минтая при использовании фермента папаина в количестве 3 % к массе сырья, и к 300 мин гидролиза составило 9,44 %.
I
%
10 -9
5
7
6 5 4 3 2
1
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 ци» --№1 — —№2--№3--№4
Рис. 1. График накопления ФТА в процессе гидролиза Fig. 1. Graph of FTN accumulation during hydrolysis
„7,65
-6,75
5,9'
1,74"
+6.8*2'
-.2,18"
-2,51-
-6,32"
- 4,3 __4,21-
-3,38—3'8
,8,54
- 6,2 -5,59'
-4,62"
-9,44
-6,8 -6,01 -5,03
-Ifilf -1,52
Как видно из графика, представленного на рис. 1, по показателю ФТА лучшим оказался образец № 4, хотя на графике рис. 3 видно, что при наивысшем показателе ФТА выход целевого вещества не всегда будет соразмерен. Это позволяет нам утверждать, что такой показатель, как ФТА нельзя оценивать в абсолютном значении, поскольку он является динамическим. Благодаря ему мы можем лишь оценивать общее состояние процесса гидролиза путем отслеживания самого факта накопления ФТА.
Помимо показателя ФТА контролировалось количество накопившихся сухих веществ и показатель накопления суммы гликозаминогликанов (рис. 2, 3). По этим показателям лучшим оказался образец № 2. Можно сделать вывод, что накопление сульфатированных гликозаминогликанов лучше отражает процент накопления сухих веществ. Это наглядно показывает, что для исследования параметров гидролиза важно отслеживать оба показателя.
Сравнивая данные, представленные на рис. 2 и 3, мы видим, что накопление сульфатированных гликозаминогликанов динамически коррелирует с накоплением сухих веществ и в случае, когда оценка сГаГ невозможна из-за продолжительного времени, требуемого для проведения анализа. Мы можем ориентироваться на накопление сухих веществ, оценивая скорость или глубину гидролиза.
60
120 180 240 --№1--№2--№3--- №4
300
Рис. 2. График накопления сухих веществ в процессе гидролиза Fig. 2. Graph of accumulation of dry matter during hydrolysis
60
120 180 240
--№1--№2--№3--№4
300
X. MJIH
Рис. 3. График накопления сГаГ в процессе гидролиза Fig. 3. Graph of sGaG accumulation during hydrolysis
По показателям содержание общего азота, аминного азота в негидролизо-ванном сырье и в гидролизате после гидролиза в течение периода времени т были рассчитаны показатели степени гидролиза. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2. Расчетные показатели степени гидролиза сырья в зависимости от его вида, ферментных препаратов и их количества
Table 2. Calculated indicators of the degree of hydrolysis of raw materials depending on its type, enzyme preparations and their quantity
Сырье Фермент Количество фермента, % Степень гидролиза, %
ОКиПТ судака Папаин 1,5 48
То же То же 3 60
- « - Папаин + алкалаза 1,5 + 1,5 54
ОКиПТ минтая Папаин 3 65
Как видно из данных табл. 2, самой высокой степени гидролиза удалось добиться в образцах № 2 и 4. В обоих случаях было использовано 3 % папаина к массе сырья. Задействование 1,5 % фермента показало наихудший результат, так как это количество не способно гидролизовать хрящевую ткань за такой промежуток времени. Добавление к 1,5 % папаина 1,5 % алкалазы позволило перейти 50%-ную границу степени гидролиза.
ВЫВОДЫ
На основании полученных данных мы можем сделать выводы о том, что показатель ФТА позволяет оценить общее состояние процесса гидролиза, и его следует наблюдать именно в динамическом состоянии.
Исследования позволили определить, что показатели накопления сГаГ и сухих веществ находятся в близкой зависимости. Оценку проведения гидролиза для получения сГаГ лучше всего делать по показателю накопления гликозами-ногликанов или сухих веществ.
Оценивая степень гидролиза, мы получили информацию о том, что гидролиз тканей как судака, так и минтая лучше всего проходит под действием папаи-на. Накопление ФТА активнее протекает при гидролизе ОКиПТ минтая.
Благодаря полученным данным можно с большей точностью проводить оценку параметров для выявления оптимальных значений при математическом моделировании.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Стейси, М. Углеводы живых тканей / М. Стейси, С. Баркер. - Москва: Мир, 1965. - 324 с.
2. Ииргенсонс, Б. Природные органические макромолекулы / Б. Иирген-сонс. - Москва, 2001. - 558 с.
3. Arvanitoyannis I. S. Fish industry waste: treatments, environmental impacts, current and potential uses. Food Science and Technology. - United States, Academic Press, 2008, 726-745 p.
4. Стецюк, В. В. Современное состояние и проблемы рыбной промышленности Российской Федерации / В. В. Стецюк // Таможенная политика России на Дальнем Востоке. - 2019. - № 2 (87). - С. 65-76.
5. Казакова, В. С. Источники получения гиалуроновой кислоты / В. С. Казакова, Е. С. Землякова // VII Международный Балтийский морской форум. VIII Международная научно-практическая конференция «Пищевая и морская биотехнология» (7-12 октября 2019 г.): материалы. - Калининград: Изд-во БГАРФ, 2019. - С. 64-68.
6. Бочков, Н. П. Медицинская генетика / Н. П. Бочков, А. Ф. Захаров, В. И. Иванов. - Москва, 1984. - 404 с.
7. Ayaz, F. A. Nutrient contents of kale (Brassica oleraceae L. var. acephala DC.) / F. A. Ayaz [et al.] // Food Chemistry. - 2006. - Т. 96, №. 4. - С. 572-579.
8. Землякова, Е. С. Комплексная переработка опорно-каркасных и покровных тканей судака на функциональные продукты: дис....канд. техн. наук: 05.18.04, 05.18.07 / Землякова Евгения Сергеевна; КГТУ. - Калининград, 2009. - 233 с.
REFERENCES
1. Steysi M. Uglevody zhivykh tkaney [Carbohydrates of living tissues]. Moscow, Mir, 1965, 324 p.
2. Yirgensons B. Prirodnye organicheskie makromolekuly [Natural organic mac-romolecules]. Moscow, 2001, 558 p.
3. Arvanitoyannis I. S. Fish industry waste: treatments, environmental impacts, current and potential uses. Food Science and Technology. United States, Academic Press, 2008, pp. 726-745.
4. Stetsyuk V. V. Sovremennoe sostoyanie i problemy rybnoy promyshlennosti Rossiyskoy Federatsii [Current state and problems of the fishing industry of the Russian Federation], TamozhennayapolitikaRossii na Dal'nem Vostoke. 2019, no. 2(87), pp. 65-76
5. Kazakova V. S., Zemlyakova E. S. Istochniki polucheniya gialuronovoy kisloty [Sources of hyaluronic acid]. Materialy VIIMezhdunarodnogo Baltiyskogo mor-skogo foruma "Pishchevaya i morskaya biotekhnologiya". VIII Mezhdunarodnaya nauchno-prkticheskaya konferentsiya "Pishchevaya i morskaya biotekhnologiya" (7-12 октября 2019 г.) [Proceedings of the VII International Baltic Maritime Forum "Food and Marine Biotechnology. VIII International Scientific and Practical Conference "Food and Marine Biotechnology" (7-12 October 2019)]. Kaliningrad, 2019, pp. 64-68.
6. Bochkov N. P., Zakharov A. F., Ivanov V. I. Meditsinskaya genetika [Medical genetics]. Moscow, 1984, 404 p.
7. Ayaz F. A. et al. Nutrient contents of kale (Brassica oleraceae L. var. acephala DC.). Food Chemistry, 2006, vol. 96, no. 4, pp. 572-579.
8. Zemlyakova E. S. Kompleksnaya pererabotka oporno-karkasnykh i pokrov-nykh tkaney sudaka na funktsional'nyye produkty. Diss. kand. tekhn. nauk [Complex processing of support-skeleton and integumentary tissues of pike perch on functional products. Dis. cand. tech. sci.] Kaliningrad, 2009, 233 p.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ
Орлов Игорь Олегович - Калининградский государственный технический университет; аспирант кафедры пищевой биотехнологии; Е-mail: igor.orlov.workmail@gmail.com
Orlov Igor Olegovich - Kaliningrad State Technical University; graduate student of the Department of Food Biotechnology; Е-mail: igor.orlov.workmail@gmail.com
Землякова Евгения Сергеевна - Калининградский государственный технический университет; кандидат технических наук, доцент; Е-mail: Evgeniya.zemljakova@klgtu.ru
Zemlyakova Evgeniya Sergeevna - Kaliningrad State Technical University; Associate Professor, PhD in Engineering; E-mail: evgeniya.zemljakova@klgtu.ru
