Исследование противогрибковых свойств хвойных полифенольных соединений Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

577.3.0

Боброва Е.А., Сидоченко А.В.

«Московский политехнический университет» DOI: 10.24411/2520-6990-2019-10612

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОГРИБКОВЫХ СВОЙСТВ ХВОЙНЫХ ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ

СОЕДИНЕНИЙ

Bobrova E.A., Sidochenko A. V.

Moscow Polytechnic University

RESEARCH OF ANTIFUNGAL PROPERTIES OF CONIFEROUS POLYPHENOL COMPOUNDS

Аннотация

Хвойные деревья используются для получения биологически активных полифенолов и лекарственных препаратов, используемых при целом ряде заболеваний (кардиоваскулярных, нейродегенеративных, диабете, печеночной дисфункции и т.д.), в частности, дигидрокверцетина и дигидрокемпферола из лиственницы, пикногинол из коры сосны приморской Pinus maritima. Наличие хвойных лесов на территории РФ делает перспективным использование отходов деревоперерабатывающей промышленности в качестве доступных источников полифенолов, а также изучение их свойств для увеличения области применения. Данное исследование направлено на оценку противогрибковых свойств полифенольных соединений, полученных из биоматериалов хвойных пород РФ.

Abstract

Conifers are used to produce biologically active polyphenols and drugs used in a number of diseases (cardiovascular, neurodegenerative, diabetes, liver dysfunction, etc.), in particular, dihydroquercetin and dihydro-campferol from larch, pycnoginol from pine bark of the coastal Pinus maritima. The presence of coniferous forests on the territory of the Russian Federation makes it promising to use the wastes of the wood processing industry as available sources of polyphenols, as well as studying their properties to increase the scope. This study is aimed at assessing the antifungal properties of polyphenolic compounds obtained from coniferous biomaterials of the Russian Federation.

Ключевые слова: полифенолы, хвойные экстракты, противогрибковые свойства, диск-диффузионный метод, Yarrowia lipolytica.

Key words: polyphenols, coniferous extracts, antifungal properties, disk diffusion test, Yarrowia lipolytica.

Актуальность. Биосинтез вторичных соединений, к которым относятся фенольные компоненты, можно рассматривать как экофизиологиче-ский ответ растения на действие различных стрес-сорных факторов (высушивание, засоление, повышение уровня тяжелых металлов, действие ультрафиолетового излучения, низкие температуры, механические повреждения, нападение насекомых, действие патогенных организмов) [1,2].

У представителей хвойных деревьев отмечено изменение уровня фенольных и полифенольных соединений в ответ на изменения температурного режима. При наступлении ранней зимы акклиматизация сибирской ели Picea obovata происходила на фоне изменения метаболизма углеводов, липидов, аминокислот, а также повышения содержания кате-хинов и лютеолина [3]. При осенней акклиматизации в хвое 4-летних сеянцев ситхинской ели (Picea sitchensis), растущих на разной широте (от Калифорнии до Аляски), повышалось содержание кате-хинов и антоцианов, причем наиболее значительное (в 2-5 раз) изменение уровня катехинов наблюдалось в популяциях южной и умеренной зон, менее приспособленных к морозам. При деаклима-тизации, напротив, происходило снижение уровня полифенолов [4, 5].

В Норвегии исследовали содержание биоактивных стильбеновых гликозидов в коре и древесине ели Picea abies (астрингин, изорапонтин, писеид) после их экстракции ацетоном. В коре 37-летних деревьев содержание стильбеновых гликозидов было на 10-60% выше, чем в коре 18-летних елей. Внутренние слои коры содержали до 4.8% гликозидов ресвера-трола в расчете на сухой вес [6].

Полифенолы растительного происхождения успешно применяются для лечения заболеваний, имеющих сложносоставную этиологию: нейродеге-неративных расстройств различного происхождения, аутоиммунных, аллергических, онкологических и прионных [7].

Цель исследования. Изучение противогрибковой активности хвойных экстрактов к условно-патогенным дрожжам Y.lipolytica.

Материалы и методы. Y. lipolytica считается слабо патогенным организмом, но эти дрожжи обладают рядом особенностей, которые позволяют эффективно проникать в организм хозяина. Гидролитические ферменты являются одним из основных факторов, которые могут влиять на патогенность Y. lipolytica . Этот гриб способен продуцировать широкий спектр гидролаз, таких как: протеазы, фосфо-липазы и гемолизины, которые помогают во втор-

<<ШУШетиМ~^©и©Мак>>#Ш43)),2©1]9 / BIOLOGICAL sciences

жении в ткани. Фосфолипазы и протеазы, секрети-руемые дрожжами, играют важную роль в повреждении клеточных мембран, которые состоят из ли-пидов и белков. Более того, протеазы способны разрушать эпителиальные и слизистые компоненты, например, коллаген и кератин. Кроме того, наиболее распространенный человеческий грибковый патоген C. albicans и другие не- albicans Candida используют протеолитические ферменты для расщепления антител, комплемента и цитокинов. Подобный механизм может возникнуть у дрожжей Y. lipolytica , но необходимы дальней-

шие исследования. Y. lipolytica как бывший представитель рода Candida сравнивается с C. albicans-наиболее часто выделяемый грибковый патоген у людей. Из-за высокой патогенности этих видов дрожжей C. albicans является хорошим примером для сравнения, несмотря на то, что эти два вида эво-люционно далеки. Таким образом, с помощью Y. lipolytica можно изучить противогрибковые свойства хвойных экстрактов.

Диск-диффузионный метод был выбран в качестве способа оценки противогрибковой активности хвойных полифенолов, так как он прост в ис-

полнении, имеет ярко выраженный визуальныи результат и используемый штамм является слабо патогенным.

Таблица 1

Реактив Количество на 1 л

(NH4)2SO4 0,3 г

Дрожжевой экстракт «DIFCO» 2,0 г

MgSO47H2O 0,5 г

№0! 0,1 г

СаСЪ 0,05 г

КН2РО4 2 г

К2НРО4ЗН2О 0,5 г

Пантотенат кальция 0,4 мг

Инозин 2,0 мг

Никотиновая кислота 0,4 мг

п-аминобензойная кислота 0,2 мг

Пиридоксин 0,4 мг

Рибофлавин 0,2 мг

Тиамин 0,1 мг

Биотин 0,002 мг

Фолиевая кислота 0,002 мг

Н3ВО4 0,5 мг

С^045Н20 0,04 мг

К1 0,1мг

Feaз6H2O 0,2 мг

М^О^О 0,4 мг

МаМо042Н20 0,2 мг

0,4 мг

Вода - дистиллированная, pH среды - 5,6-5,9. В качестве основного источника углерода использовали глицерин - 0,6% (7,5 г на 1 л). Стерилизация осуществлялась автоклавированием в емкостях с ватными

пробками, закрытыми плотной бумагой, при 0,5 атм. 30 мин.

Таблица 2

_Твердая питательная среда для Yarrowia lipolytica_

Реактив Количество на 1 колбу (на 500 мл)

Дрожжевой экстракт «DIFCO» 2,5 г

Бактопептон 5,0 г

Агар 20,0 г

Глицерин 7,5 г

Мальт-экстракт 3,0 г

Вода - дистиллированная, pH среды - 5,6-5,9. Стерилизация - 0,5 атм. 0,5 часа.

Штамм Yarrowia Иро1уйса засевали с музейного скошенного агара на твердую агаризованную среду (чашки Петри) и культивировали в термостатируемом боксе при +28° C в течение 3-х суток. Инокулят с появившихся колоний использовали для засева на жидкую среду. Полученным инокулятом засевали жидкую среду и культивировали в строго контролируемых условиях при температуре +28-30 ° C и скорости вращения качалки 220 об/мин 24 часа.

Количество клеток в инокуляте Yarrowia Иро1уйса равно 5,05*108 (кл./мл). Подсчет осуществлялся с помощью камеры Горяева.

Сбор образцов древесины хвойных пород (ели обыкновенной (Picea abies)) был произведен в различных регионах РФ: Владимирской области и Пермском крае. Далее из образцов древесины были получены

хвойные экстракты.

Таблица З

_Характеристика экстрактов биоматериалов хвойных пород_

Номер хвойного экстракта Порода дерева Образец Влажность, % Общее содержание полифенолов, мг/мл Суммарное содержание антиоксидан-тов, мг/мл

Образец из Пермского края

8 Ель обыкновенная древесина 60.93±6.2 0.026±0.03 0.080±0.007

Образец из Владимирской области

47 Ель обыкновенная древесина 33.51±1.8 1.184±0.08 0.350±0.023

Результаты. На каждый диск наносили 5 мкл хвойного экстракта, диаметр диска равен 0,6 см, объем инокулята в чашке Петри равен 150 мкл. В качестве контрольных соединений были выбраны спирт и кло-

тримазол.

Таблица 4

_Исследование противогрибкового действия полифенолов хвойных экстрактов № 47,8_

Номер чашки Петри Диаметр зоны подавления роста Yarrowia lipolytica , см

Спирт Кло-трима- зол Образец № 47 (разбавление 1:10) Образец № 47 Образец № 8 (разбавление 1:10) Образец № 8

1 1,0- 1,1 1 0 0,8 - -

2 1,0-1,1 1 - - 0 0

3 1,0 1,2-1,3 0 0,9 - -

4 1,0 1 - - 0 0

Среднеквадратичное отклонение 0 0 0 0,071 0 0

Среднее арифметическое 1 1 0 0,85 0 0

Выводы 1 1 +/-0,2 0 0,85 +/-0,07 0 0

Выводы. Основываясь на результатах исследования, представленных в таблице 4, можно сделать выводы, что хвойный экстракт № 47 (из древесины ели обыкновенной из Владимирской области) обладает слабыми противогрибковыми свойствами (зона подавления роста У.Иро1у11са равна 0,85 +/-0,07), однако хвойный экстракт № 47, разбавленный в 10 раз, не облает этими свойствами. В свою очередь, хвойный экстракт № 8 (из древесины ели обыкновенной из Пермского края) не проявил противогрибковых свойств. Таким образом, дальнейшие исследования противогрибковых свойств хвойных полифенолов имеют перспективы, в частности образца № 47.

Литература:

1. Ramakrishna A., Ravishankar G.A. Plant Signal Behav., 2011, vol. 6, no. 11, pp. 1720-1731, DOI: 10.4161/psb.6.11.17613.

2. Chalker-Scott L., Fuchigami L.H. Low temperature stress physiology in crops, Boca Raton: CRC Press, 1989, pp. 68-76.

3. Angelcheva L., MishraY., Antti H., Kjellsen T.D., Funk C., Strimbeck R.G., Schröder W.P. New Phytol., 2014, vol. 204, no. 3, pp. 545-555, DOI: 10.1111/nph.12950

4. Pukacki P.M., Kaminska-Rozek E. Acta Physiol. Plant, 2013, vol. 35, no. 1, pp. 129-138, DOI: 10.1007/s11738-012-1055-2.

5. Dhuli P., Rohloff J., Strimbeck G.R. Front. Plant Sci, 2014, vol. 5, e706, DOI: 10.3389/fpls.2014.00706.

6. Jyske T., Laakso T., Latva-Mäenpää H. Tapaniola T., Saranpää P. Biomass and Bioenergy, 2014, vol. 71, no. 2, pp. 216-227, DOI: 10.1016/j.biombioe.2014.10.005.

7. Akinwumi B.C., Bordun K.M., Anderson H.D. Int. J. Mol. Sci., 2018, vol. 19, no. 3, e792, DOI: 10.3390/ijms19030792.