ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ФЕРМЕНТАЦИИ ВТОРИЧНОГО СЫРЬЯ МЯСНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Е.Г. Семенова, канд. техн. наук, ст. преподаватель, e-mail: lolena80@mail.ru Буpятская госудаpственная сельскохозяйственная академия им. В.Р. Филиппова

Т.Ф. Чиркина, д-р. техн. наук, проф., e-mail: tmkp@mail.ru Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления

г. Улан-Удэ

УДК 637.523

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ФЕРМЕНТАЦИИ ВТОРИЧНОГО СЫРЬЯ МЯСНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

В статье приведены результаты изучения протеолитических процессов при ферментации соединительнотканного белка эластина раствором панкреатина - фермента поджелудочной железы. Обработку проводили экстрактом поджелудочной железы 0,3 % к массе сырья в соотношении эластичной ткани к экстракту 1:2 при температурных режимах: 2 °С (холодная камера), 20 °С (комнатная температура) и 37°С (термостат) в течение 5 ч.

Протеолиз протеинов эластичной ткани наблюдается при всех режимах, о чем свидетельствует накопление аминного азота. Наибольшая скорость протеолиза белков наблюдается в течение первого часа, что видно по углу наклона кривых, со второго часа обработки она снижается. Наибольшее количество аминного азота наблюдали при 37 С во все сроки ферментации, минимальное - при 2 °С. Отмечено, что при ферментации происходят процессы отщепления белковых фракций, что подтверждается накоплением не только аминного азота, но и растворимого белка.

Ключевые слова: эластин, панкреатин, аминный азот, растворимый белок.

E.G. Semenova, Cand. Sc. Engineering, Senior Lecturer T.F. Chirkina, Dr. Sc. Engineering, Prof.

THE STUDY OF PROTEOLYTIC PROCESSES DURING FERMENTATION OF SECONDARY RAW MATERIALS OF MEAT INDUSTRY

The article presents the results of the study ofproteolytic processes during fermentation of connective protein elastin by solution of Pancreatic - pancreatic enzyme. The processing is done by a pancreatic extract of 0.3 % by weight of raw materials in the ratio of stretch fabric to extract 1:2 at temperature regimes: 2°C (cold chamber), 20°C (room temperature) and 37°C (thermostat) during 5 hours.

Proteolysis is in all modes, as evidenced by the accumulation of amine nitrogen. The highest rate of proteolysis of proteins is observed in the ^ first hour, which is evident by the angle of inclination of the curves, it is reduced in the second hour of the processing. It observes the greatest number of amine nitrogen at 37°C during all the periods of fermentation, minimum - at 2°C. At fermentation, there are eliminating processes of the protein ^ fractions, as confirmed by accumulation of not only amine nitrogen, but also of soluble protein.

Key words: elastin, pancreatic, an amine nitrogen, soluble protein.

В последнее время в рамках рационального использования органического сырья вторичные продукты убоя селскохозяйственных животных получили широкое применение в технологиях изделий в качестве белоксодержащих добавок. Отечественные авторы получили данные, доказывающие, что замена до 20 % мяса высшего сорта соединительнотканным сырьем не вызывает снижения биологической ценности готового продукта, а, наоборот, повышает ее. Источником соединительной ткани при переработке убойных животных в основном служит коллагенсодержащее сырье: субпродукты, кишки, сухожилия, свиная шкурка и др. Перспектива использования коллагеновых белков состоит в получении ряда полезных продуктов различного назначения: мясных продуктов, пищевых пленок, покрытий, колбасных оболочек, хирургических материалов [1]. Вопросы изучения свойств соединительнотканного белка эластина остаются малоизученными.

Низкая биологическая ценность соединительнотканного белка эластина обусловлена разбалансированностью состава аминокислот, особенно незаменимых. Количество триптофана, цистина, метионина незначительны, отсутствует изолейцин, поэтому белок является неполноценным. В составе эластина, как и в коллагеновом белке, присутствуют оксипролин (но в десять раз меньше), много таких аминокислот, как глицин, пролин, аланина и валин, содержание которых достаточно высокое (почти 70 %).

Низкую биологическую ценность, а именно атакуемость соединительнотканных протеинов ферментами желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), можно объяснить их сложным строением. Соединительная ткань представляет собой систему, состоящую из аморфного основного вещества, тончайших волокон и форменных элементов - клеток. Эластическая ткань в основном представлена эластиновыми волокнами, придающими ей исключительную прочность, нерастяжимость и даже жесткость.

Соединительнотканные протеины и полисахариды образуют между собой сложные соединения: протеогликаны и гликопротеины. Образованные белково-полисахаридные комплексы представляют собой своеобразное молекулярное сито, регулирующее диффузию воды и низкомолекулярных продуктов питания и обмена. Гликопротеины - это группа углеводсо-держащих соединительнотканных протеинов, состоящая из белковой молекулы, к полипептидной цепи которой в разных участках присоединены олигосахариды. Вероятно, именно наличие сложных полисахаридов в углеводной части волокон склеропротеинов, которые не способны перевариваться ферментами ЖКТ, дает основание отнести соединительную ткань к пищевым волокнам. Существуют химические, физические и биотехнологические способы модификации свойств коллагенсодержащего мясного сырья [2, 3, 4].

Уникальная особенность структуры эластина, его неперевариваемость пепсином и трипсином ЖКТ, невозможность расщепления ферментами поджелудочной железы в тонком отделе кишечника обусловили необходимость модификации его свойств для дальнейшего использования.

В связи с вышесказанным актуальным является исследование состава и свойств эластической ткани для модификации его функционально-технологических свойств с целью дальнейшего использования в рецептуре мясных изделий.

Материалы и методы

Объектом исследования служили выйная связка, содержащая эластин, поджелудочная железа для выделения фермента. Ферментативную обработку протеинов эластической ткани проводили раствором комплекса ферментов, выделенного из поджелудочной железы КРС и готовой формой этого комплекса - раствором медицинского панкреатина отечественного производства. Комплекс ферментов получали в виде водного экстракта из поджелудочной железы КРС [5, 6]. Учитывая способность эластической ткани ограниченно впитывать влагу, оптимальным соотношением эластичной ткани и экстракта поджелудочной железы выбрали 1 : 2. Обработку проводили экстрактом поджелудочной железы 0,3 % к массе сырья в соотношении эластичной ткани к экстракту 1 : 2 при следующих температурах: 2, 20 и 37 °С в течение 5 ч.

Исследования основных показателей проводили, используя следующие методики: содержание влаги - термогравиметрический метод при 102-105 °С; содержание белка - метод Кьель-даля; содержание коллагена и эластина в эластической ткани - метод В.П. Воловинской; уровень аминного азота - объемный метод; содержание водорастворимого белка - метод Лоури (колориметрирование при Х=750 нм); содержание минеральных веществ - метод сухого озо-ления; содержание кальция - объемный комплексометрический и атомно-абсорбционный методы.

Результаты и их обсуждение

Известно, что предварительная обработка (теплом или ультразвуком) животной ткани делает более доступными белковые молекулы эластина для расщепления ферментами желу-

дочно-кишечного тракта. Эластическая ткань может служить хорошим комплексообразовате-лем, взаимодействуя с металлами, что делает ее их природным детоксикантом тяжелых металлов.

На первом этапе определяли химический состав эластической ткани на примере выйной связки после ее размораживания (табл. 1).

Таблица 1

Химический состав исследуемой выйной связки

Наименование показателя Значения

Массовая доля влаги, % 56,6±0,26

Содержание общего азота, % 7,6±0,05

Содержание аминного азота, мг% 17,0±0,32

Содержание общего белка, % 42,7±0,38

Содержание растворимого белка, % 0,6±0,08

Массовая доля эластина, % 32,0±0,48

Массовая доля коллагена, % 7,5±0,34

Массовая доля золы, % 0,5±0,06

Содержание кальция, мг% 11,0±0,63

Содержание фосфора, мг% 28,4±0,3

Полученные результаты, представленные в таблице 1, согласуются с литературными данными, содержание влаги в соединительной ткани значительно меньше, чем в мышечной. Следует отметить, что в составе сухого остатка преобладают белки - коллаген и эластин, относящиеся к группе склеропротеинов, которые и придают уникальную особенность структуре эластической ткани. Эластин является главным белком эластической ткани, содержание которого в ней составляет 75% от всех белков.

Белок эластин очень устойчив, нерастворим в холодной и горячей воде, солевых растворах, в разбавленных кислотах и щелочах. Даже концентрированная серная кислота оказывает на него слабое воздействие. Нити нативного эластина не перевариваются трипсином или хи-мотрипсином, медленно гидролизуются пепсином при рН=2. Однако некоторые ферменты растений (препараты фицина, папаина, бромелаина) способны изменять структуру эластина. В животных организмах поджелудочной железой вырабатывается зимоген проэластаза, который активизируется трипсином с образованием активной эластазы, которая способна избирательно гидролизовать пептидные связи эластина, состоящие из карбоксильных групп остатков алифатических аминокислот.

Минеральный состав эластической ткани характеризуется низким содержанием почти всех элементов по сравнению с мышечной тканью, исключение составили натрий, кобальт: их содержание было несколько выше. Проведя сравнительный анализ минерального состава эластической ткани относительно мышечной, можно сделать вывод, что несбалансированность мясного сырья по отдельным нутриентам является основной причиной разработки технологий мясных изделий со сбалансированным химическим составом. Оптимизация состава возможна за счет модификации биополимеров мясного сырья или за счет комбинирования мясного сырья с другими видами сырья.

Изменения структуры белков для повышения функционально-технологических свойств можно добиться воздействием физических, химических и биотехнологических факторов. Достоинством воздействия ферментов перед химическими катализаторами является то, что они действуют при нормальном давлении, при температурах от 20 до 70 °С, в диапазоне рН от 4 до 9 и имеют в большинстве случаев высокую субстратную специфичность, что позволяет в сложной смеси биополимеров направленно воздействовать только на определенные соединения.

На следующем этапе исследований для деструкции молекул протеинов эластической ткани применяли ферментный комплекс поджелудочной железы крупного рогатого скота, который обладает генетическим сходством с обрабатываемым сырьем.

Степень гидролиза протеинов эластической ткани определяли по значению аминного азота в исследуемых образцах. Обработку проводили экстрактом поджелудочной железы при следующих температурах: 2, 20 и 37 °С в течение 5 ч. Результаты динамики накопления аминного азота при различных температурах показаны на рисунке 1.

а

ато

ог о н н и м а е и н

а

жа р

е део

С

120

100

80

60

40

20

___« У--- — — —

_____ ^ Г " ____—□

I / / У г __^с

/ х / /

- /- // ^^

1 1 1 1 1

0

0

1

2

3

4

5

Время ферментации, ч —•— Обрбботка при 2 °С —О— Обработка при 20 °С —•- Обработка при 37 °С

Рисунок 1 - Изменение содержания аминного азота в образцах в зависимости от температуры

Протеолиз протеинов эластичной ткани имеет место во всех образцах, т.е. при всех режимах, о чем свидетельствует накопление аминного азота. Наибольшая скорость протеолиза протеинов зафиксирована в течение первого часа, начиная со второго часа обработки, скорость постепенно снижается. Как свидетельствуют полученные данные, при 20°С уровень аминного азота после 60 мин процесса ферментации составил 44 мг%, через 120 мин содержание аминного азота увеличилось по отношению к 60 мин на 15 мг%, а через 180 мин по отношению к 120 мин - на 8 мг%. Максимальное количество аминного азота было при 37 °С во все сроки ферментации, минимальное - при 2 °С. Так, например, через 120 мин протеолиза содержание аминного азота в образце, обрабатываемом при 37 °С, возросло в 5,8 раз, при 20 °С - в 4,5 раз, при 2 °С - в 3 раза, в дальнейшем скорость денатурации протеинов и пептидов на аминокислоты уменьшалась. Необходимо отметить, что содержание аминного азота в эластической ткани нативной выйной связки составляло 17 мг%.

Дальнейшие исследования было решено проводить при температуре 20 °С с повышением концентрации вводимого ферментного препарата. Такое решение обосновывается тем, что, во-первых, в промышленных условиях на поддержание температуры 37 °С необходимы дополнительные энергозатраты, во-вторых, температура 37 °С является оптимальной для активной жизнедеятельности бактерий. Также с целью исключения дополнительных операций при получении экстрактов поджелудочной железы взяли готовую форму комплекса ферментов поджелудочной железы - медицинский панкреатин. Для обоснования равнозначности замены экстракта медицинским панкреатином были проведены исследования по ферментации эластической ткани под действием экстракта поджелудочной железы 0,3%-ной концентрации, раствора панкреатина 0,3 и 0,6%-ной концентрации. Обработку проводили при 20 °С в течение 120 мин в соотношении эластической ткани к раствору фермента 1 : 2. Контрольным образцом служила эластическая ткань, погруженная в дистиллированную воду при тех же условиях. Результаты

исследований динамики накопления аминного азота при 20 °С в течение 120 мин при заданных условиях показаны на рисунке 2.

0х и

св

н о

00 03

о

и

о и

И «

<и «

8 а

<и

Ч

О

О

120

100

80

60

40

20

60 120 Продолжительность ферментации, мин

• Обработка дист. водой

А Обработка 0,3%-ным экстрактом поджел. железы

^ Обработка 0,3%-ным раствором панкреатина

_ Обработка 0,6%-ным раствором панкреатина

Рисунок 2 - Влияние условий обработки на содержание аминного азота

0

0

Как свидетельствуют полученные данные, влияние экстракта поджелудочной железы и раствора панкреатина концентрацией 0,3 % на белки эластина практически одинаково во все сроки ферментации. А обработка 0,6%-ным раствором панкреатина позволила получить через 2 ч такое количество аминного азота, которое достигалось при 37 °С за 4 ч. Поэтому дальнейшая обработка эластической ткани проводилась 0,6%-ным раствором панкреатина при 20 °С в течение 2 ч.

Параллельно исследовали динамику изменения содержания водорастворимого белка при обработке 0,3 и 0,6%-ным растворами панкреатина. Водорастворимый белок нативной эластической ткани равен 0,6 %. Результаты представлены в таблице 2 и на рисунке 3.

Таблица 2

Изменение содержания растворимого белка при действии ферментов

Продолжительность ферментации, ч Водорастворимый белок, %

0,3%-ным панкреатином 0,6%-ным панкреатином

1 1,14±0,03 1,72±0,07

2 1,30±0,01 2,04±0,02

3 1,38±0,01 2,17±0,05

4 1,40±0,07 2,26±0,04

5 1,405±0,09 2,30±0,02

6 1,41±0,05 2,32±0,03

Анализ полученных данных доказал существование корреляции динамики накопления растворимого белка с аминным азотом, т.е. параллельно идут процессы отщепления белковых фракций, о чем свидетельствует накопление растворимого белка и накопление аминного азота. При обработке эластической ткани 0,6%-ным раствором фермента количество растворимого белка выше, причем резкое нарастание водорастворимого белка наблюдается в течение первых 60 мин.

Время ферментации, ч

Рисунок 3 - Динамика накопления растворимого белка при обработке 0,6%-ным раствором панкреатина

Начиная с 2-3 ч ферментации скорость образования водорастворимого белка падает и замедляется к 4-5 ч ферментации. Исследования показали возможность выбора эффективного режима обработки ткани при комнатной температуре путем изменения концентрации фермента.

Таким образом, в результате ферментации наблюдаются интенсивные протеолитические процессы эластичной ткани с накоплением растворимых протеинов, что положительно влияет на функциональные характеристики эластина и обосновывает дальнейшее использование модифицированного соединительнотканного белка в производстве обогащенных добавок и рецептуре мясных изделий.

Библиография

1. Будаева А.Е., Баженова Б.А., Мадагаев Ф.А. Пищевая ценность субпродуктов яка // Вестник ВСГУТУ. - 2012. - № 2. - С. 74-78.

2. Будаева А.Е., Забалуева Ю.Ю., Данилов М.Б. К вопросу модификации коллагенсодержащих субпродуктов животных // Мат. VIII Междунар. науч.-практ. конф. Министерство сельского хозяйства РФ, ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова, ООО «Здоровое питание», ИЦ «Функциональное питания», 2014. - С. 64-65.

3. Будаева А.Е., Баженова Б.А.. Данилов А.М. Химическая модификация коллагенсодержащего сырья для применения его в производстве мясопродуктов // Все о мясе. - 2015. - № 1. - С. 31-36.

4. Баженова Б.А. Данилов А.М. Влияние гидролизата желудков крупного рогатого скота на размягчение фарша из рубцов // Материалы XVШ Междунар. науч.-практ. конф. «Развитие биотехнологических и постгеномных технологий для оценки качества сельскохозяйственного сырья и создания продуктов здорового питания». - М.: Изд-во ГНУ ВНИИМП им. Горбатова, 2015. - С. 70-71.

5. Лопарева Е.Г., Битуева Э.Б., Чиркина Т.Ф. Влияние условий ферментации эластической ткани на степень протеолиза ее белков // Сб. науч. тр. ВСГТУ. Серия: Химия и биологически активные вещества. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2004. - Вып. 9. - С. 141.

6. Лопарева Е.Г., Чиркина Т.Ф. Выбор ферментного комплекса для обработки эластической ткани // Сб. науч. тр. ВСГТУ. Серия: Биотехнология, технология пищевых продуктов. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2005. - Вып. 10 . - С. 39-41.

Bibliography

1. Budaeva A.E., Bazhenova B.A., Madagaev F.A. Food value of yak's offal. - Bulletin of ESSUTM, 2012. - N 2. - P.74-78.

2. Budaeva A.E., Zabalueva Yu. Yu., DanilovM.B. On the issue of modification of collagen's of animal offal // Proceedings of VIII Intern. Scientific Pract. Conf. Ministry of Agriculture of the RF, FSBEI HPE "Saratov State Agricultural University of N. I. Vavilov, LLC "Healthy Food", IC "Functional Food", 2014. -P.64-65.

3. Budaeva A.E., Bazhenova B.A., Danilov A.M. Chemical modification of collagen raw materials for technology of meat products // All about Meat. - 2015. - N 1. - P. 31-36.

4. Bazhenova B.A. Danilov A.M. Effect of hydrolyzate stomachs of cattle for softening minced from hem. Proceedings of XVIII Intern. Scientific Pract. Conf. "Development of biotechnological and post-genomic technologies for quality assessment of agricultural raw materials and creation of healthy food products". - M.: SSU of Gorbatov, 2015. - P. 70-71.

5. Lopareva E.G., Bitueva E.B., Chirkina T.F. Effect of conditions of the fermentation of the elastic tissue on degree of proteins proteolysis // Coll. of scientific works of ESSTU. Series: Chemistry and Biologically Active Agents. - Ulan-Ude: ESSTU Publishing, 2004. - Vol. 9. - P. 141.

6. Lopareva E.G., Chirkina T.F. Choosing of the enzyme complex for the treatment of elastic tissue // Coll. of scientific works of ESSTU. Series: Biotechnology, Technology of Food products. - Ulan-Ude: ESSTU Publishing, 2005. - Vol. 10. - P. 39-41.