CC BY
25
© Н.В.Чеботарева, Н.В.Непринцева, И.Н.Бобкова, Л.В.Козловская, В.А.Варшавский, 2015 УДК 616.611-002-036.12:577.15.04
Н.В. Чеботарева1, Н.В. Непринцева2, И.Н. Бобкова1,2, Л.В. Козловская3, В.А. Варшавский4
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТЕКТИВНЫХ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА В МОЧЕ, СЫВОРОТКЕ КРОВИ И ТКАНИ ПОЧКИ У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКИМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТОМ
1Научно-исследовательский отдел нефрологии Научно-исследовательского центра; 2 кафедра нефрологии и гемодиализа Института профессионального образования; 3 кафедра внутренних, профессиональных заболеваний и пульмонологии медико-профилактического факультета; 4 кафедра патологической анатомии лечебного факультета Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова
N.V. Chebotareva1, N.V. Neprintseva2, I.N. Bobkova1,2, L.V. Kozlovskaya3, V.A.Varshavskif4
STUDY OF PROTECTIVE HEAT SHOCK PROTEINS IN URINE, SERUM AND KIDNEY TISSUE IN PATIENTS WITH CHRONIC GLOMERULONEPHRITIS
1 Department of nephrology research center, 2department of nephrology and hemodialysis, 3Department of internal diseases and pulmonology, "Department of pathological anatomy I.M.Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, Russia
РЕФЕРАТ
ЦЕЛЬ - уточнить ценность определения белков теплового шока (БТШ) в моче в оценке активности и прогноза ХГН. ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ. Обследовано 75 больных с активными формами хронического ХГН: 1-я группа - 34 больных с мочевым синдромом и 2-я группа - 41 больной с нефротическим синдромом, у которых мочевой синдром был результатом неполной ремиссии нефротического синдрома. Группы сравнения - 10 больных с протеинурией менее 0,5 г/ сут и 10 здоровых. Методом ELISA в сыворотке крови определяли уровень антител к БТШ-70, в моче - уровни БТШ-27 и БТШ-70, ИЛ-6 и ИЛ-10. В ткани почки (иммуногистохимическим пероксидазным методом) определяли экспрессию БТШ-70 в различных структурах; экспрессию FoxP3. РЕЗУЛЬТАТЫ. Экскреция БТШ-27 и БТШ-70 с мочой увеличивалась по мере нарастания активности ХГН, Установлены прямые корреляции концентрации в моче БТШ-27 и БТШ-70 с признаками активности ХГН. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Подтверждена возможность оценки механизмов «самозащиты» почки с помощью изучения одного из ее звеньев - БТШ. Ключевые слова: НЕТ
ABSTRACT
THE AIM is to clarify the value of determination of heat shock proteins (HSP) in urine to assess the activity and prognosis of CGN. PATIENTS AND METHODS. Study included 75 patients with active forms of chronic GN: group 1 -34 patients with bladder syndrome and group 2 - 41 patient with nephrotic syndrome who have urinary syndrome was the result of incomplete remission of nephrotic syndrome. The comparison group of 10 patients with proteinuria < 0.5 g/day and 10 healthy. Method ELISA) in serum was determined by the level of antibodies to HSP-70 in urinary levels of HSP-27 and HSP-70, IL-6 and IL-10. In kidney tissue (peroxidase immunohistochemical method) was determined by the expression of HSP-70 in various structures; the expression of FoxP3. RESULTS. Excretion of HSP-27 and -70 urine was increased by increasing the activity of CGN, Established direct correlation to the concentration in the urine HSP-27 and -70 with signs of activity CS. CONCLUSION. Confirmed kidney «self-defense» mechanisms capability assessment using the study of one of its parts - HSP. Key words: chronic glomerulonephritis, nephrotic syndrome, heat shock proteins.
ВВЕДЕНИЕ
Среди механизмов, определяющих течение и исход заболеваний почек, в настоящее время наиболее изучены повреждающие звенья патогенеза. Однако в экспериментальных работах было по-
Чеботарева Н.В. 143400, г. Красногорск, ул. Ленина, д. 27, кв. 16. Тел.: 8-905-543-42-50, e-mail: [email protected],
казано, что течение патологического процесса в почке, независимо от его этиологии, определяется балансом локально воздействующих повреждающих факторов и противостоящих им механизмов самозащиты, среди которых особое место занимают белки теплового шока (БТШ) [1-3].
Благодаря достижениям современной молекуляр-
ной биологии и инновационным клеточным технологиям установлены фундаментальные защитные функции БТШ, которые заключаются в поддержании нормальной структуры белков в клетке [4].
Роль БТШ в механизмах, ограничивающих повреждение почечной ткани, а также иммуноре-гуляторная функция этих белков при хроническом гломерулонефрите (ХГН) изучены недостаточно. Данное направление исследований представлено, главным образом, экспериментальными и единичными клиническими работами по оценке экспрессии отдельных БТШ в различных структурах почки [5-7].
Вместе с тем, изучение БТШ, способных модулировать процессы повреждения, приобретает особый интерес для понимания основных закономерностей прогрессирования ХГН и представляется перспективным для разработки новых методов торможения нефросклероза.
В этой связи целью нашего исследования было оценить состояние системы «самозащиты» почки у больных с ХГН по уровню в моче, крови и экспрессии в почке основных защитных БТШ, уточнить значение изменений этих факторов в оценке активности и прогноза ХГН.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Обследовано 75 больных с активными формами ХГН: 31 женщина и 44 мужчины в возрасте от 16 до 67 лет (в среднем 35,5 [27; 51] лет), наблюдавшихся в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева Первого МГМУ им. И.М. Сеченова с 2011 по 2013 годы.
В 1-ю группу включены 34 пациента с выраженным мочевым синдромом (МС) - 23 больных, у которых ХГН изначально протекал с МС и персистировал в течение 7 [2; 12] мес, а также 11 больных, у которых МС был результатом неполной ремиссии нефротического синдрома (НС). Клинически эта группа характеризовалась протеинурией (ПУ) от 1 до 3,5 г/сут (2,4 [1,24; 3,5] г/сут); у 13 больных выявлялась изолированная ПУ субнеф-ротического уровня, у 21 пациента ПУ сочеталась с эритроцитурией.
У 7 больных 1-й группы, наряду с ПУ, выявлено нарушение функции почек (креатинин от 1,26 до 2,97 мг/дл, в среднем 1,35 [1,27; 1,71] мг/дл, СКФ - 53,5 [49; 67]), как проявление высокой активности нефрита. У 5 пациентов, несмотря на прием антигипертензивных препаратов, выявлялась артериальная гипертония (АГ) (АД 160-170/100 мм рт. ст.). Длительность нефрита в этой группе составила в среднем 45 [9,5; 96] мес.
2-ю группу составил 41 больной с ХГН с НС. По степени тяжести НС были выделены подгруппы: 2А, включающая 31 пациента с умеренным НС (ПУ 6,4 [4,8; 10] г/сут, альбумин сыворотки 27,7 [24,8; 30] г/л, общий белок сыворотки 46,6 [43,2; 49,7]), и 2Б, в которую вошли 10 больных с выраженным НС (анасарка, ПУ 11,32 [7,52; 18] г/сут, гипоаль-буминемия менее 20 г/л - в среднем 19 [17,7; 19,9] г/л, общий белок сыворотки 34,45 [33,6-38,7] г/л).
У 15 больных 2-й группы НС сочетался с гематурией (от 10-15 до сплошь в поле зрения). АГ отмечалась у 9 пациентов. У 14 больных 2-й группы, наряду с НС, выявлено нарушение функции почек (креатинин 1,55 [1,39; 1,99] мг/дл, СКФ - 53 [42; 71]) как проявление высокой активности нефрита, у 6 из них также отмечались выраженная гематурия и АГ, которые расценивались в рамках остронефритического синдрома. Длительность нефрита во 2-й группе составила в среднем 11,5 [4; 42,5] мес, длительность НС к моменту обследования - 4 [2; 7] мес.
У 72 больных диагноз ХГН был подтвержден морфологически: у 29 выявлен мезангиопроли-феративный нефрит (МПГН), у 13 - мезангиока-пиллярный нефрит (МКГН), у 13 - мембранозный нефрит (МН), у 7 - фокально-сегментарный гломе-рулосклероз (ФСГС), у 4 - болезнь минимальных изменений (МИ), у 6 - нефросклероз в исходе ХГН.
Группы сравнения были представлены 10 пациентами с неактивным ХГН (ПУ менее 0,5 г/ сут - в среднем 0,23 [0,18; 0,3] г/сут; у 2 - больных микрогематурия до 15-20 в поле зрения, АГ отсутствовала или была умеренной, поддавалась коррекции антигипертензивными препаратами), а также 10 здоровыми лицами, сопоставимыми по полу и возрасту.
Наряду с общеклиническим обследованием, нами были изучены:
в моче (методом ЕLISA): уровни БТШ-27 и БТШ-70 - защитных белков-шаперонов клеточного происхождения; уровень провоспалительного интерлейкина (ИЛ) - ИЛ-6 и уровень основного противовоспалительного интерлейкина - ИЛ-10;
в сыворотке крови (методом ЕLISA): уровень антител (АТ) к БТШ-70 как отражение внеклеточных эффектов БТШ (показатель иммунорегулятор-ной функции этих белков);
в ткани почки (иммуногистохимическим пе-роксидазным методом): экспрессия БТШ-70 в различных структурах; экспрессия FoxP3 - фактора транскрипции регуляторных Т-лимфоцитов (CD4+CD25+), секретирующих противовоспалительный ИЛ-10.
Результаты иммуногистохимического исследования изучаемых медиаторов оценивали полуколичественным методом: (-) экспрессия отсутствует; (+) очаги слабой экспрессии, (++) множественные очаги умеренной экспрессии, (+++) множественные очаги выраженной экспрессии.
C помощью морфометрического подсчета FoxP3+-ядер оценено число противовоспалительных клеток в ткани почки.
Для иммуногистохимического исследования использовали материал парафиновых срезов биопсий почек 39 пациентов с ХГН (пациенты отобраны на основании наличия достаточного количества материала в парафиновых блоках).
Статистический анализ данных проводили с применением стандартных статистических методик с помощью программы STATISTICA 6,0. Для сравнения двух групп использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции Спирмена. Достоверность различий частот в двух группах оценивали по х2 с поправкой Йетса. Для оценки прогностического значения показателей применен метод Каплана-Майера, достоверность различий определялась по лог-ранговому критерию.
РЕЗУЛЬТАТЫ
У больных с ХГН нами выявлены изменения экскреции с мочой БТШ-27 и БТШ-70, характер которых зависел от клинических особенностей заболевания. Так, у пациентов с МС (1-я группа) эти показатели имели тенденцию к увеличению по сравнению с контрольными группами (таблица). Наиболее высокие индивидуальные значения были у 3 больных с яркими признаками активности ХГН - ПУ субнефротического уровня, выраженной эритроцитурией и нарушением функции почек.
У пациентов с НС (2-я группа) увеличение уровня БТШ-27 и БТШ-70 в моче было статистически значимым по сравнению со здоровыми, неактив-
ным ГН и пациентами с МС (см. таблицу). При выраженном НС (11Б гр.) уровни БТШ-27 и БТШ-70 в моче были достоверно выше, чем при умеренном НС (2А группа) (см. таблицу).
У больных с ХГН с НС показатели экскреции БТШ-27 и БТШ-70 прямо коррелировали с величиной суточной ПУ ^=0,40, р<0,05 и Rs=0,34, р<0,05 соответственно) и обратно с уровнем альбумина сыворотки крови ^8=-0,36, р<0,05 и к.б=-0,31, р<0,05 соответственно).
Мы не выявили зависимости уровня мочевой экскреции исследуемых БТШ от морфологических типов ХГН. Максимальные индивидуальные уровни БТШ-27 в моче отмечались у 2 больных с ФСГС и МН (22,4 и 15,37 нг/мл соответственно), а БТШ-70 - при МИ (1,699 нг/мл), ФСГС (1,628 нг/мл), МН (2,588 нг/мл). Именно у этих больных клиническая картина ХГН характеризовалась выраженным НС, у части больных в сочетании с дисфункцией почек.
Для подтверждения локально-почечного происхождения БТШ, экскретируемых с мочой, мы исследовали экспрессию БТШ-70 в ткани почки у больных с ХГН. У всех больных с активным ХГН с выявленной экскрецией БТШ-70 с мочой мы обнаружили этот белок и в ткани почки. Он выявлялся в клубочках (главным образом, в по-доцитах, в меньшей степени - в париетальных клетках капсулы Шумлянского-Боумена), а также в тубулоинтерстиции (в эпителиальных клетках канальцев, строме, клетках лимфогистиоцитарного инфильтрата, миофибробластах).
При всех активных протеинурических формах ХГН, независимо от его морфологического варианта, преобладала тубулоинтерстициальная локализация БТШ-70. Умеренная (++) и выраженная (+++) экспрессия БТШ-70 в тубулоинтерстиции отмечалась у 80% больных с НС и лишь у 30% пациентов с МС. В клубочках почек обследованных с ХГН с МС и НС выявлялась преимущественно слабая (+) (у 85 и 70%) и умеренная (++) (у 15 и 25%) экспрессия БТШ-70. Интенсивность тубулоинтерстициальной
Уровень экскреции с мочой БТШ-27 и БТШ-70 у больных с ХГН
Таблица
Группа п БТШ-27 (нг/мл) БТШ-70(нг/мл)
Активный ХГН: 75
1. ХГН с МС 34 0,76 [0,68; 1,14] 0,43[0,41; 0,45]
2. ХГН с НС 41 1,1 [0,73; 1,83] * 0,46 [0,43; 0,50] *
2А. НС умеренный 31 0,94[0,71; 1,73] 0,43[0,41; 0,51]
2Б. НС выраженный 10 1,88 [0,8; 7,195] * ** 0,6 [0,5; 2,5] * **
Неактивный ХГН 10 0,72 [0,65; 0,98] 0,42 [0,41; 0,43]
Здоровые 10 0,73 [0,66; 0,96] 0,42 [0,40; 0,43]
Примечание. В таблице представлена медиана, в скобках - интерквартильный размах [25; 75 %]. * р<0,05 по сравнению с 1-й группой, неактивным ХГН и здоровыми; ** р<0,05 по сравнению с 2А группой (ХГН с умеренным НС).
о
X
з" ш о а.
о о. о о л и ш
о
■
В [Б
р < 0,01 — ..............<->
р < 0,05
• МесЯап I I 25-75% ~Г М1п-Мах
ИЛ-6 пил-ю
Неактивный ГН МС
НС
Рис. 1. Уровень антител к БТШ-70 в сыворотке крови у больных с ХГН.
экспрессии БТШ-70 прямо коррелировала с показателем его мочевой экскреции ^=0,731, р<0,01), отражая индукцию синтеза БТШ в этих структурах почки в процессе повреждения.
У больных с НС наиболее выраженная окраска БТШ-70 выявлялась в эпителиальных клетках канальцев и прямо коррелировала со степенью ПУ ^=0,362, р<0,05), что, как мы полагаем, может отражать индукцию синтеза БТШ в канальцах в ответ на повреждение не только иммунными факторами, но и компонентами ПУ.
Для оценки внеклеточных иммунорегуляторных эффектов БТШ-70 мы изучили уровень циркулирующих АТ к БТШ-70 в сыворотке крови и оценили баланс ИЛ-6 и ИЛ-10 в моче.
Сывороточный уровень АТ к БТШ-70 у больных с активным ХГН (как с МС, так и с НС) был значимо выше, чем у пациентов с латентным течением заболевания (рис.1). В то же время, в общей группе пациентов с НС величина данного показателя была несколько ниже, чем при МС, и обратно коррелировала с уровнем ПУ ^=-0,439, р<0,05). Более сильная связь отмечена в группе больных с выраженным НС ^=-0,974, р<0,05).
При высокоактивном течении заболевания (см. рис. 1), клинически характеризующимся сочетанием тяжелого НС с дисфункцией почек, снижение уровня АТ к БТШ-70 было более выраженным, чем при умеренном НС с сохранной функцией почек (20,3 [15,3; 24,3]х106 и 25,6 [18,7; 31,9] х106 нг/мл соответственно, р<0,05).
Нами установлено, что при нарастании активности ХГН от МС к НС и по мере усугубления степени выраженности НС наблюдается увеличение в моче провоспалительного ИЛ-6 и снижение
ХГН с МС ХГН с умерен НС ХГН с тяжел НС
Рис. 2. Экскреция интерлейкинов 6 и 10 с мочой у больных с ХГН.
противовоспалительного ИЛ-10 (рис.2).
Величина экскреции ИЛ-6 прямо коррелировала с выраженностью ПУ ^=0,378, р=0,01), уровнем креатинина сыворотки крови (для больных с НС Rs=0,53, р<0,01) и длительностью сохраняющейся активности ХГН ^=0,344, р<0,01).
По-нашему мнению, такой дисбаланс ИЛ-6/ ИЛ-10 и снижение уровня АТ к БТШ подчеркивает значение нарушений иммунорегуляторных эффектов БТШ и недостаточности противовоспалительной защиты почки в целом при высокоактивных формах нефрита.
На это указывают и результаты проведенного нами морфометрического исследования. Мы оценили в инфильтратах количество регуляторных Т-лимфоцитов ^охР3+), секретирующих ИЛ-10. У больных с ХГН с НС, по сравнению с пациентами с МС, отмечалось достоверное снижение в ткани почек FoxP3+-клеток (2 [0,44; 4] и 8,5 [3; 16] в поле зрения соответственно, р<0,05), и именно в этой группе пациентов мы выявляли резкое снижение уровня ИЛ-10 в моче и АТ к БТШ-70 в сыворотке крови (см. рис.1 и 2).
Полагая, что неэффективная регуляция хронического иммунного воспаления у больных с ХГН, в том числе с участием БТШ, может способствовать персистированию и дальнейшей хронизации болезни, и напротив, при состоятельности этой системы можно прогнозировать более благоприятное течение нефрита, мы проанализировали характер течения заболевания и ответ на иммуносупрес-сивную терапию у 37 больных с активным ХГН в зависимости от исходной величины АТ к БТШ-70.
Достижение ремиссии ХГН в течение ближайших месяцев иммуносупрессивной терапии на-
Рис. 3. Параметры системы «самозащиты» почки при разной степени активности ХГН.
блюдалось у больных с высоким (выше 21 пг/мл) исходным уровнем антител к БТШ-70 в сыворотке крови. Так, у 13 из 16 (80%) пациентов с высоким уровнем антител ответ на лечение был получен в течение 12 мес, у 8 (50%) - в течение ближайших 5 мес. Напротив, у 12 из 21 (57%) пациента с титрами антител ниже 21 пг/мл НС персистировал, несмотря на проводимое более 1 года лечение, рекомендованное для данных форм заболевания.
Комплексный анализ изменений изученных нами мочевых и сывороточных тестов на разных этапах течения ХГН показал, что по мере нарастания активности формируется дисбаланс повреждающих и защитных факторов с преобладанием воспалительных реакций (рис.3).
Об активности воспалительной реакции в ткани почки и выраженности клеточного повреждения у больных с ХГН свидетельствует снижение уровня АТ к БТШ-70 в сыворотке крови и ИЛ-10 в моче при повышении экскреции БТШ-27 и БТШ-70 и ИЛ-6 с мочой. Прогрессирующий характер этих нарушений является неблагоприятным прогностическим признаком, указывающим на риск хронизации болезни и худшего ответа на лечение.
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящее время фундаментальными исследованиями подтверждена важная роль БТШ в восстановлении клеток, поврежденных под действием медиаторов воспаления, оксидативного стресса, различных токсинов, неблагоприятных факторов внешней среды и др. [4]. Эти защитные свойства БТШ связаны с их универсальными клеточными функциями: как белки-шапероны они участвуют
в образовании вторичной и третичной структуры протеинов, репарации поврежденных и элиминации денатурированных белков [4, 8, 9].
Среди белков теплового шока при ХГН особый интерес представляют БТШ-27, регулирующие структуру и функцию актин-содержащих клеток почки (подоцитов и тубулярных клеток), а также БТШ-70, который, как полагают, помимо внутриклеточной защиты, участвует в регуляции иммунного воспалительного ответа [3].
По нашим данным, экскреция БТШ-27 и БТШ-70 с мочой увеличивалась по мере нарастания активности ХГН, достигая наиболее высоких значений у больных с НС, особенно при его тяжелом течении. Нами установлены прямые корреляции мочевых показателей БТШ-27 и БТШ-70 с клинической активностью нефрита, в первую очередь, с выраженностью ПУ и почечной дисфункции, что отражает активацию механизмов внутриклеточной защиты в ответ на действие повреждающих факторов. В этой связи повышенный уровень БТШ в моче можно рассматривать не только как показатель индукции синтеза этих защитных белков в различных клетках ткани почки, но и как косвенный маркер клеточного повреждения.
Наиболее тесная связь с тяжестью НС была получена для БТШ-27, что находит объяснение в свете современных представлений об участии этого белка в поддержании цитоскелета подоцитов, и в частности, в регулировании формы его ножек -ключевого звена развития нефротической ПУ. Установлено, что защитными свойствами обладают нефосфорилированные олигомеры БТШ-27. В процессе клеточного повреждения происходит их фосфорилирование с помощью р38 МАРкиназы, что влечет за собой потерю связи БТШ-27 с ак-тиновыми микрофиламентам и ремоделирование актиновой сети в клетке [10, 11]. В результате этих процессов наблюдается слияние ножек подо-цитов с развитием ПУ, поврежденные подоциты слущиваются в мочевое пространство (подоци-турия), а БТШ начинают интенсивно выделяться из поврежденных клеток в мочу [12, 13]. Важную роль БТШ-27 играют в поддержании цитоскелета и других актин-содержащих клеток почек - ка-нальцевых эпителиоцитов. Ослабление защитных свойств БТШ-27 в поврежденных эпителиальных клетках приводит к нарушению их каркаса, полярности, межклеточных контактов и связи с ту-булярной базальной мембраной с последующим слущиванием эпителиоцитов в просвет канальца и формированием в местах оголения мембраны очагов тубулоинтерстициального фиброза.
В семейство БТШ-70 входят конституциональный белок БТШ-73кДа и индуцибельный белок БТШ-72кДА. В эксперименте установлено, что БТШ-73 в норме экспрессируется преимущественно клетками дистальных канальцев, в меньшей степени - проксимальных, а БТШ-72 - вдоль кортикопапиллярных областей [5]. При патологических состояниях экспрессия БТШ-73 и БТШ-72 локализуется преимущественно в области повреждающего воздействия. Так, при экспериментальном PAN-нефрозе внутриклеточная экспрессия БТШ-73 обнаруживалась в подоцитах, являющихся мишенью повреждении при данной форме нефрита, а также в тубулярных клетках, отражая их защитную реакцию на токсическое действие нефротической ПУ [5]. При экспериментальном остром повреждении почек ишемической и токсической природы усиленная экспрессия БТШ-73 и БТШ-72 выявлялась в проксимальных тубулярных клетках [14-16]. Т. Mueller и соавт. изучили экскрецию БТШ-72 с мочой у больных после пересадки почки. Резкое повышение экскреции БТШ-72 отмечено в первые часы после операции, что отражает процесс нарушения целостности тубулярного эпителия и может указывать на степень почечного повреждения [17].
В настоящее время имеются лишь единичные работы, посвященные изучению экспрессии БТШ-70 в ткани почки у больных с различными формами ХГН. Выявлена депозиция БТШ-70 в подоцитах, тубулярных клетках дистальных канальцев и собирательных трубочек, очагах интерстициальной инфильтрации [7, 18].
В нашем исследовании экспрессия БТШ-70 обнаружена у всех больных с ХГН с выявленной экскрецией БТШ-70 с мочой. В целом, изменения тканевых и мочевых показателей БТШ-70 у больных ХГН были однотипны: отмечались интенсивная экспрессия этого фактора в почке и усиленная его экскреция с мочой при активных формах ХГН, главным образом, при НС. Полученные нами данные подтверждают локально-почечное происхождение БТШ-70, выявляемого в моче, и указывают на возможность использования мочевых показателей БТШ для оценки механизмов защиты в почке и выраженности повреждения.
Экспрессия БТШ-70 выявлена нами у больных с ХГН в разных структурах ткани почки, но преимущественно в тубулоинтерстиции, что согласуется с результатами исследований других авторов. Интенсивность тубулоинтерстициальной экспрессии БТШ-70 коррелировала с уровнем экскреции БТШ-70 с мочой. Наиболее выраженная окраска на БТШ-70 у больных с НС выявлялась в
эпителиальных клетках канальцев, прямо коррелируя с выраженностью ПУ. В свете современных представлений о механизмах нефротоксичности ПУ это можно расценивать как защитную реакцию тубулярных клеток в ответ на повреждение не только иммунными факторами, но компонентами ПУ.
В последние годы, помимо внутриклеточной защитной функции БТШ-70, в литературе обсуждается их особая протективная роль, которая заключается в контроле хронического иммунного воспаления [19, 20]. Полагают, что внеклеточные эпитопы БТШ, экспрессируемые в очаге воспаления, распознаются Т-лимфоцитами с формированием регуляторных клонов реактивных Т-клеток CD4+CD25+ ^охР3+), которые обеспечивают противовоспалительный эффект как за счет прямой элиминации цитоток-сических Т-клеток, так и за счет гуморального звена - секреции противовоспалительных цитоки-нов, в первую очередь ИЛ-10 [21]. Есть основания полагать, что неэффективная иммунорегуляция противовоспалительного ответа с участием БТШ-70 может способствовать хронизации воспаления. Так, L. Магеес и соавт. показали, что снижение степени экспрессии БТШ-72 на поверхности моноцитов периферической крови у пациентов с рядом хронических заболеваний почек, а также у больных с терминальной почечной недостаточностью, сочетается с развитием системного воспаления [22].
Мы оценили взаимосвязь уровня в моче защитных БТШ с показателями мочевой экскреции противовоспалительного цитокина ИЛ-10 и провоспа-лительного ИЛ-6. По мере нарастания активности нефрита и развития его прогрессирующих форм мы наблюдали увеличение экскреции с мочой БТШ-27 и БТШ-70, коррелирующие с уровнем ИЛ-6 в моче, как показателя активности иммунного воспаления в почке, в то время как уровень ИЛ-10, наоборот, прогрессивно снижался до следовых показателей. Полученные нами данные свидетельствуют о развитии у больных с выраженным иммунным воспалением в почке дисбаланса повреждающих и защитных механизмов с ослаблением его противовоспалительного компонента.
Для оценки иммунорегуляторной функции БТШ мы также изучили содержание в сыворотке крови циркулирующих АТ к БТШ-70. Их уровень у больных с активным ХГН (как с мочевым, так и с НС) был значимо выше, чем у пациентов с латентным течением заболевания. Вместе с тем, при высокоактивном течении заболевания, характеризующимся сочетанием тяжелого НС с преходящим нарушением функции почек, мы выявили достоверное снижение уровня АТ к БТШ-70 в сыворотке крови.
Патогенетическое значение и прогностическая роль АТ к БТШ-70 при иммунной патологии изучены пока еще недостаточно. Имеются ряд исследований, демонстрирующих увеличение титра АТ к БТШ, в том числе к БТШ-70, при иммуно-воспалительных и аутоиммунных заболеваниях (системной красной волчанке, ревматоидном артрите, васкулитах, дерматомиозите и др.) [23]. Н.А. Мухин и соавт. показали увеличение уровня АТ к БТШ-70 в сыворотке крови у больных с ХГН и амилоидозом с НС [24]. В нескольких исследованиях подтверждено значение уровня АТ к БТШ-70 в сыворотке крови как предикторов неблагоприятного прогноза у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями и атеросклерозом. Так, X. Zhanq и соавт. показали, что высокое содержание БТШ-70 в сыворотке крови в сочетании с низким титром АТ к БТШ-70 ассоциировано с высоким риском прогрес-сирования атеросклероза и сердечно-сосудистых осложнений в популяции [25]. По данным Е. Dulin и соавт., снижение уровня циркулирующих АТ к БТШ имеет неблагоприятное прогностическое значение при ишемической болезни сердца [26].
В нашем исследовании снижение уровня АТ к БТШ-70 в сыворотке крови у пациентов с тяжелым течением ХГН коррелировало с уменьшением количества Т-регуляторных FoxP3+ клеток в ткани почки и низким уровнем ИЛ-10 в моче. В этом случае заболевание характеризовалось торпидным течением, несмотря на длительное лечение различными иммуносупрессивными препаратами. Снижение уровня АТ к БТШ-70 у этой группы пациентов может косвенно отражать недостаточность иммунорегуляторных эффектов БТШ-70 со снижением количества БТШ-специфичных Т-регуляторных клеток и общей противовоспалительной активности.
Комплексный анализ изменений всех изученных мочевых и сывороточных тестов на разных этапах течения ХГН показал, что при нарастании активности заболевания (прежде всего, увеличении ПУ) в ответ на активацию факторов повреждения (увеличение уровня в моче воспалительного ИЛ-6) наблюдаются адаптивные изменения в системе самозащиты почки - усиленная экскреция с мочой БТШ-27 и БТШ-70, рост уровня в моче противовоспалительного ИЛ-10, а в сыворотке крови - АТ к БТШ-70 (как отражение активации внутри- и внеклеточных защитных эффектов БТШ). При прогрессирующем течении ХГН (развитии НС, усугублении степени его тяжести, особенно в сочетании с нарушением функции почек) баланс повреждающих и защитных механизмов наруша-
ется: при продолжающемся росте уровня ИЛ-6 в моче и увеличении экскреции с мочой БТШ-27 и БТШ-70 наблюдаются резкое снижение уровня ИЛ-10 в моче (вплоть до неопределяемых значений) и уменьшение АТ к БТШ-70 в сыворотке крови, что отражает ослабление иммунорегуляторных и противовоспалительных эффектов БТШ. Такой спектр биомаркеров указывает на риск дальнейшего прогрессирования воспалительных изменений в почке и худший ответ на лечение.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в результате проведенного исследования подтверждена возможность оценки механизмов «самозащиты» почки с помощью изучения одного из ее звеньев - белков теплового шока. Тесные корреляции изученных мочевых и сывороточных показателей БТШ с клиническими и морфологическими признаками активности ХГН позволяют использовать эти биомаркеры для мониторирования процессов повреждения в почке и прогнозировать течение ХГН, что важно для определения тактики лечения больных на каждом этапе течения заболевания.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Kitamura N, Fine LG The concept of glomerular self-defense. Kidney Int 1999; 55: 1639-1671
2. Бобкова ИН, Чеботарева НВ, Козловская ЛВ, Неприн-цева НВ. Система самозащиты почки: современный взгляд на механизмы, определяющие течение и исход гломеруло-нефрита. Нефрология идиализ 2013; 15(3): 174-183 [Bobkova IN, Chebotareva NV, Kozlovskaia LV, Neprintceva NV. Sistema samozashchity' pochki: sovremennyT vzgliad na mehanizmy', opredeliaiushchie techenie i ishod glomerulonefrita. Nefrologiia i dializ 2013; 15(3): 174-183]
3. Бобкова ИН, Чеботарева НВ, Козловская ЛВ, Неприн-цева НВ. Защитное действие белков теплового шока при заболеваниях почек. Клин нефрол 2011; 6: 59 -66 [Bobkova IN, Chebotareva NV, Kozlovskaia LV, Neprintceva NV. Zashchitnoe dei'stvie belkov teplovogo shoka pri zabolevaniiakh pochek. Clin-icheskaia nefrologiia 2011; 6: 59 -66]
4. Welch WJ. Mammalian stress response: Cell physiology, structure/function of stress proteins, and implication for medicine and disease. Physiol Rev 1992; 72: 1063-1081
5. Komatsuda A, Wakui H, Imai H et al. Renal localization of the constitutive 73-kDa heat-shock protein in normal and PAN rats. Kidney Int 1992; 41: 1204-1212
6. Tsagalis GC, Nikolopoulou N, Sotsiou F et al. The Expression of heat shock proteins 27 and 70 in lupus nephritis. Hospital Chronicles 2006; 1(3): 125-129
7. Venkataseshan VS, Marquet E. Heat shock protein 72/73 in normal and diseased kidneys. Nephron 1996; 73:442-449
8. Ивашкин ВТ, Драпкина ОМ. Клиническое значение оксида азота и белков теплового шока. ГЭОТАР-Медиа, М., 2011 [Ivashkin VT, Drapkina OM. Clinicheskoe znachenie oksida azota i belkov teplovogo shoka. GEOTAR-Media, M., 2011]
9. Панасенко ОО, Ким МВ, Гусев НБ. Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи биологической химии 2003; 43: 59-98 [Panasenko OO, Kim MV, Gusev NB. Struktura i svoi'stva maly'kh belkov teplovogo shoka. Uspehi biologicheskoi' himii 2003; 43: 59-98]
10. Mehlen P, Hickey E, Weber LA et al. Large unphos-phorylated aggregates as the active form of hsp27 which controls intracellular reactive oxygen species and glutathione levels and generated a protection against TNFa Preville X, Schultz H, Knauf U et al. Analysis of the role of Hsp27 phosphorylation reveals the importance of the oligomerization state of this small heat shock protein in its protective function against TNF-a Smoyer WE, Gupta A, Mundel P et al. Altered expression of glomerular heat shock protein 27 in experimental nephrotic syndrome. J Clin Invest 1996; 97: 2697-2704
11. Preville X, Schultz H, Knauf U et al. Analysis of the role of Hsp27 phosphorylation reveals the importance of the oligomerization state of this small heat shock protein in its protective function against TNF-a and hydrogen peroxide-induced cell death. J Cell Biochem 1998; 69: 436-452
12. Smoyer WE, Gupta A, Mundel P et al. Altered expression of glomerular heat shock protein 27 in experimental nephrotic syndrome. J Clin Invest 1996; 97: 2697-2704
13. Чеботарева НВ, Непринцева НВ, Еськова ОА и др. Определение уровня в моче маркеров повреждения и факторов самозащиты подоцитов у больных хроническим гло-мерулонефритом. Клин нефрол 2013; 4: 33-37 [Chebotareva NV, Neprintceva NV, Es'kova OA i dr. Opredelenie urovnia v moche markerov povrezhdeniia i faktorov samozashchity' podotcitov u bol'ny'kh khronicheskim glomerulonefritom. Clinicheskaia ne-frologiia 2013; 4: 33-37]
14. Morita K, Wakui H, Komatsuda A et al. Induction of heat-shock proteins HSP73 and HSP90 in rat kidneys after ischemia. Ren Fail 1995; 17: 405-419
15. Komatsuda G, Wakui H, Satoh K et al. Altered localization of 73-kilodalton heat-shock protein in rat kidneys with gentamicin-induced acute tubular injury. Lab Invest 1993; 68: 687-695
16. Aufricht C, Lu E, Thulin G et al. ATP releases HSP72 from protein aggregates after renal ischemia. Am J Physiol Renal Physiol 1998; 274: 268-274
17. Mueller T, Bidmon B, Pichler P et al. Urinary heat shock protein-72 excretion in clinical and experimental renal ischemia.
Pediatr Nephrol 2003; 18: 97-99
18. Dodd SM, Martin JE, Swash M et al. Expression of heat shock protein epitopes in renal disease. Clinical Nephrology 1993; 39(5): 239-244
19. Van Eden W, Tholet JER, van der Zee R et al. Cloning of the mycobacterial epitope recognized by T lymphocyte in adjuvant arthritis. Nature 1988; 331: 171-173
20. Multhoff G, Hightower LE. Cell surface expression of heat shock proteins and the immune response. Cell Stress Chaperones 1996; 1: 167-176
21. Anderton SM, van der Zee R, Prakken B et al. Activation of T cells recognizing self 60-kDa heat shock protein can protect against experimental arthritis. J Exp Med 1995; 181: 943-952
22. Marzec L, Zdrojewski Z, Liberek T et al. Expression of Hsp 72 protein in chronic kidney disease patients. Scandinavian J Urol and Nephrol 2009; 43(5): 400-408
23. Wu T, Tanguay RM. Antibodies against heat shock proteins in environmental stresses and diseases: friend or foe? Cell Stress and Chaperones 2006; 11(1): 1-12
24. Мухин НА, Ляшко ВН, Маргулис БА и др. Амилоидоз и антитела к белкам теплового шока. Терапевт арх 1992; 64; 79-82 [Muhin NA, Liashko VN, Margulis BA i dr. Amiloidoz i antitela k belkam teplovogo shoka. Terapevticheskii' arhiv 1992; 64; 79-82]
25. Zhang X, Xu Z, Zhou L et al. Plasma levels of Hsp 70 and anti-Hsp70 antibody predict risk of coronary syndrome. Cell Stress and Chaperones 2010; 15: 675-686
26. Dulin E, Barreno PG, Guisasola MC. Extracellular heat shock protein 70 (HSPA1A) and classical vascular risk factors in a general population. Cell Stress and Chaperones 2010; 15: 929-937
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Поступила в редакцию: 12.09.2014 г.
Принята в печать: 14.01.2015 г.
