CC BY
43
© И.Н.Бобкова, Н.В.Чеботарева, Л.В.Козловская, В.А.Варшавский, Е.П.Голицина, 2006 УДК 616.611-002-036.12:616.61-002.17]-07:616.633.96
И.Н. Бобкова, Н.В. Чеботарева, Л.В. Козловская, В.А. Варшавский, Е.П. Голицина
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭКСКРЕЦИИ С МОЧОЙ МОНОЦИТАРНОГО ХЕМОТАКСИЧЕСКОГО ПРОТЕИНА-1 (МСР-1) И ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА-ß! (TGF-ß1) -НЕИНВАЗИВНЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ ТУБУЛОИНТЕРСТИЦИАЛЬНОГО ФИБРОЗА ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТЕ
I.N. Bobkova, N.V. Chebotareva, L.V. Kozlovskaya, V.A. Varshavsky, E.P. Golitsina
DETERMINATION OF URINARY EXCRETION OF MONOCYTE CHEMOTACTIC PROTEIN-1 (MCP-1) AND TRANSFORMING GROWTH FACTOR-ß1 (TGF-ß1) IS AN INVASIVE METHOD OF ASSESSMENT OF TUBULOINTERSTITIAL FIBROSIS WITH CHRONIC GLOMERULONEPHRITIS
Отдел нефрологии Научно-исследовательского центра и кафедра патологической анатомии Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова, Россия
РЕФЕРАТ
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Определить содержание в моче и почечной ткани больных ХГН профиброгенных медиаторов -моноцитарного хемотаксического протеина (МСР-1) и трансформирующего фактора роста-pi (TGF-pi) и уточнить их значение для оценки процессов воспаления и фиброза в почке и как критериев прогноза. ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ. У 63 больных активными протеинурическими формами ХГН изучены экскреция с мочой МСР-1 и TGF-pi с помощью иммуно-ферментного (ELISA) метода, экспрессия TGF-pi в ткани почки иммуногистохимическим методом. Для измерения площади интерстиция использован морфометрический метод. РЕЗУЛЬТАТЫ. У больных активными протеинурическими формами ХГН в отличие от здоровых лиц отмечается повышение экскреции с мочой МСР-1 и TGF-pi. Установлено, что уровень мочевой экскреции МСР-i у больных с нефротическим синдромом был достоверно выше, чем у больных с умеренным мочевым синдромом. Особенно высоким мочевой показатель МСР-i был у больных со стойкой почечной недостаточностью. Экскреция TGF-pi зависела, главным образом, от величины креатининемии, наиболее высокой она была у больных с выраженной протеинурией и стойким нарушением функции почек. Интенсивная экскреция TGF-pi с мочой обнаруживалась у тех больных ХГН, у которых выявлялась экспрессия этого цитокина в интерстиции почки, что подтверждает его локально-почечное происхождение. Определена связь мочевых показателей МСР-i и TGF-pi с величиной тубуло-интер-стициального фиброза. Впервые показана высокая информативность (чувствительность и специфичность) мочевых показателей МСР-i и TGF-pi как маркеров степени интерстициального фиброза и их значение в определении прогноза ХГН. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Результаты исследования демонстрируют важную роль МСР-i и TGF-pi в процессе ремоделирования тубулоинтерстиция. Изученные показатели являются маркерами ТИФ, а определение уровня МСР-i и TGF-pi в моче является информативным неинвазивным методом, позволяющим мониторировать активность заболевания и стадии фиброза, оценивать прогноз ХГН.
Ключевые слова: хронический гломерулонефрит, интерстициальный фиброз, моноцитарный хемотаксический проте-ин-i (МСР-i), трансформирующий фактор роста pi (TGF-pi), мочевая экскреция.
ABSTRACT
THE AIM of the investigation was to determine the concentration in urine and renal tissue of CGN patients of fibrinogenic mediators - monocyte chemotactic protein-i (MCP-i) and transforming growth factor-pi (TGF-pi) and to specify their significance for the assessment of processes of inflammation and fibrosis in the kidney and as the prognosis criteria. PATIENTS AND METHODS. Urinary excretion of MCP-i and TGF-pi using the immunoenzyme method (ELISA), and expression of TGF-pi in kidney tissue using the immunohistochenical method were studied in 63 patients with active proteinuric forms of CGN. The interstitium area was measured by the morphometric method. RESULTS. Patients with active proteinuric forms of CGN unlike healthy subjects had higher urinary excretion of MCP-i and TGF-pi. It was found that the level of urinary excretion of MCP-i in patients with nephrotic syndrome was reliably higher than that in patients with a mild urinary syndrome. The urinary index MCP-i was particularly high in patients with a stable renal failure. TGF-pi excretion depended mainly on the creatininemia value, being the highest in patients with pronounced proteinuria and stable impairment of the kidney function. Intensive urinary excretion of TGF-pi was observed in patients with CGN in whom expression of this cytokine in the kidney interstitium was revealed which confirmed its local-renal origin. The relationship of the urinary indices of MCP-i and TGF-pi was determined with the value of tubulo-interstitial fibrosis. For the first time, high informative value (sensitivity and specificity) of urinary indices of MCP-i and TGF-pi as markers
of the interstitial fibrosis degree was demonstrated and their significance in the prognosis of CGN. CONCLUSION. The investigation has demonstrated an important role of MCP-1 and TGF-p1 in the process of remodeling of tubulointerstitium. The indices under study are markers of TIF, and the determination of the level of MCP-1 and TGF-p1 in urine is an informative noninvasive method allowing activity of the disease and fibrosis stage to be monitored, and to estimate the prognosis of CGN.
Key words: chronic glomerulonephritis, interstitial fibrosis, monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), transforming growth factor-p1 (TGF-p1), urinary excretion.
ВВЕДЕНИЕ
Одной из наиболее важных проблем нефрологии является изучение механизмов прогрессиро-вания хронического гломерулонефрита (ХГН) с целью торможения развития терминальной почечной недостаточности (ПН), требующей применения дорогостоящей заместительной почечной терапии хроническим гемодиализом. В настоящее время благодаря многочисленным исследованиям, главным образом в эксперименте, подтверждено первостепенное значение тубулоинтерстициально-го фиброза (ТИФ) как патоморфологической основы ПН, и установлена важная роль протеинурии (ПУ) в его развитии. Показано, что нефротокси-ческий эффект ПУ реализуется через интерстици-альное воспаление, заканчивающееся развитием ТИФ [1]. В основе ТИФ лежат процессы накопления компонентов экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) (фибронектина, коллагена I, III, IV типов, ламинина и гепарансульфат-протеогликанов) и апоп-тоз тубулярных клеток, ведущие к атрофии канальцев, расширению интерстициального объема и потере перитубулярных капилляров [2, 3].
Центральным звеном в этих механизмах является активация тубулярных эпителиальных клеток под действием повреждающих компонентов ПУ с продукцией ими молекулярных медиаторов воспаления и фиброза - моноцитарного хемотаксичес-кого протеина -1 (МСР-1) и трансформирующего фактора роста - р1 (ТвР-р1), осуществляющих паракринно-аутокринную регуляцию процессов формирования и прогрессирования ТИФ [4, 5].
В последние годы появилась возможность определения отдельных молекулярных медиаторов воспаления в моче больных ХГН, однако имеются лишь единичные клинические работы, демонстрирующие взаимосвязь уровня экскреции МСР-1 и ТвР-р1 со степенью выраженности тубулоинтер-стициального повреждения и фиброза [6,7].
Цель исследования - определить содержание в моче и почечной ткани больных ХГН профиброген-ных медиаторов МСР-1и ТвР-р1 и уточнить их значение для оценки интерстициального фиброза в почке и как критериев прогрессирования заболевания.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
Обследовано 63 больных активными формами ХГН - 32 женщины и 31 мужчина в возрасте от 15
до 69 лет (в среднем 33±15 лет). Контрольную группу составили 12 здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с больными ХГН. Среди 63 пациентов у 25 диагноз ХГН был подтвержден морфологически (у 10 выявлен мезангиопролифе-ративный нефрит, у 3 - мезангиокапиллярный нефрит, у 3 - мембранозный нефрит, у 2 - фокально-сегментарный гломерулосклероз, у 2 - нефрит с минимальными изменениями, у 5 - фибропласти-ческий гломерулонефрит).
Результаты исследования молекулярных медиаторов сравнивали в 3-х группах больных, различающихся по степени выраженности ПУ и ПН. I группу составили 23 пациента с умеренным мочевым синдромом: ПУ в среднем 1,3±0,2 г/сут.; у 7 из них выявлялась изолированная ПУ субнефро-тического уровня, у 9 - в сочетании с умеренной эритроцитурией (до 30-40 в п/зр.) и у 7 - с выраженной эритроцитурией (сплошь все п/зр.). Функция почек у всех больных I группы была в пределах нормы (креатинин сыворотки крови 1,06±0,04 мг/дл), артериальная гипертензия (максимально до 170/100 мм рт. ст.) наблюдалась у 3 больных. Во II группу включены 29 пациентов с нефротичес-ким синдромом (НС), признаки которого были отчетливо выражены: отеки различной степени и локализации, ПУ, достигавшая в отдельных случаях 12-13,5 г/сут (в среднем 5,5±0,6г/сут.), гипоальбу-минемия (2,5±0,11 г/дл), у 19 больных также выявлялась гематурия. У 13 больных наряду с массивной ПУ отмечалось преходящее нарушение функции почек (креатинин от 1,6мг/дл до 2,8 мг/дл, в среднем 1,9±0,07мг/дл) и артериальная гипертен-зия, что расценено как наличие у них остронефритического синдрома. В III группу вошли 11 больных, у которых наряду с выраженной ПУ (у 13 -нефротического уровня, в среднем 4,6±0,8 г/сут) и гематурией (от 10-15 в п/зр. до сплошь в п/зр.) отмечалось стойкое нарушение функции почек (креатинин сыворотки крови в среднем 3,6±0,8 мг/дл) и высокая артериальная гипертензия (АД систолическое 160 - 220 мм рт.ст., АД диастолическое 100 - 130 мм рт. ст.). При морфологическом исследовании ткани почки у больных этой группы выявлен значительный фиброз.
Экскрецию с мочой профиброгенных молекулярных медиаторов исследовали методом непрямого иммуноферментного анализа (ELISA) с ис-
пользованием для МСР-1 системы BioSource International, Immunoassay Kit (США, Бельгия), для TGF-p1 - системы DRG MTPL EIA-1864 (ФРГ). Мочевые показатели МСР-1 и TGF-p1 были стандартизованы по величине креатинина в утренней моче.
У 16 больных параллельно исследованию TGF-р1 в моче изучили экспрессию этого цитокина в ткани почки с помощью иммуногистохимического пероксидазного метода с использованием монокло-нальных антител мыши к TGF-p1 (клон TB21, BioSource International, USA, Belgium). Результат реакции оценивали по интенсивности коричневой окраски.
В ткани почек 45 больных ХГН определяли экспрессию маркера миофибробластов - гладко-мышечного а-актина (а-ГМА) иммуногистохими-ческим пероксидазным методом с использованием моноклональных антител мыши к а-ГМА (клон 1А4, DAKO, Дания). Результат реакции оценивали морфометрически по интенсивности коричневой окраски (модифицированный принцип Weibel). Для контроля указанные показатели также были оценены в 7 образцах ткани здоровой почки, полученной в ходе различных оперативных вмешательств (без признаков опухоли или сосудистой патологии).
Среди 45 больных ХГН, которым была проведена биопсия почки, у 25 измеряли площадь (относительный объем) интерстиция коркового слоя почки (в 10-12 полях зрения при увеличении х400) и степень клеточной воспалительной лейкоцитарной инфильтрации по количеству ядер в корковом слое почек на участке в 1,5мм2 с использованием программ для морфометрии (ДиаМОРФ, ADOBE PHOTOSHOP CS). Данные морфометрического анализа сравнивались с клиническими и морфологическими признаками активности нефрита и с мочевыми показателями МСР-1 и TGF-p1.
РЕЗУЛЬТАТЫ
У всех больных ХГН уровень экскреции МСР-1 с мочой был выше, чем у здоровых лиц. У больных с НС он был достоверно выше, чем у пациентов с умеренным мочевым синдромом (табл. 1). Установлена прямая достоверная корреляция между уровнем МСР-1 в моче и величиной суточной ПУ, а также показателем ПУ/креатинин мочи (RS =0,51 и 0,55 соответственно, p<0,001). Наиболее высокая мочевая экскреция МСР-1 отмечена у больных III группы с выраженной ПН (см. табл. 1). О профиброгенной направленности действия этого хемокина свидетельствуют и результаты рассмотрения мочевого показателя МСР-1 отдельно в группе больных с НС: у пациентов с НС и пре-
Таблица 1
Уровень экскреции МСР-1 и TGF-ß1 с мочой больных ХГН
Группа обследованных n МСР-1 пг/мл/ TGF-ß1 пг/мл/
креатинин мочи креатинин мочи
Здоровые 12 0,34 (0,21-0,86) 0,2 (0-0,4)
I. Больные ХГН
с мочевым синдромом 23 4,08* (1,7-7,6) 1,65* (0,7-2,2)
II. Больные ХГН с НС 29 7,85* (4,6-16) 1,1* (0,4-2,4)
Ш.ХГН со стойкой ПН 11 26,5*° (16-56) 2,5*°(2,2-3,5)
* р<0,01 по сравнению с контрольной группой, • р<0,01 по сравнению с I группой, ° р<0,05 по сравнению с I и II группами. В таблице представлены показатели медианы и интер-квартильного размаха.
Таблица 2
Уровень экскреции МСР-1 с мочой больных ХГН в зависимости от локализации фиброза в клубочках и интерстиции (п=25)
Локализация фиброзных n МСР-1
изменений в почке пг/мл/креатинин
мочи
1. Гломерулосклероз (-) ТИФ (-) 12 4,6 (1,9-8,1)
2. Гломерулосклероз (+) ТИФ (-) 5 2,9 (2,1-2,9)
3. Гломерулосклероз (+) ТИФ (+) 8 30,5*° (18,3-52,5)
*p<0,01 по сравнению с 1, ° p<0,01 по сравнению с 2. В таблице представлены показатели медианы и интерквар-тильного размаха.
ходящей ПН он был достоверно выше (11,0пг/мл (7,2-29) ), чем у больных с сохранной функцией почек (6,5пг/мл (3,1-10,5) )(p<0,05).
Участие продуцируемого эпителиальными клетками канальцев МСР-1 в механизме формирования интерстициального фиброза подтверждается результатами проведенного нами морфомет-рического анализа: у больных с площадью интерстиция более 10% экскреция с мочой МСР-1 была достоверно выше, чем у больных с площадью интерстиция менее 10% (p<0,05). У больных с площадью интерстиция более 20% эта разница была высоко достоверной (p<0,001). Между этими показателями выявлена сильная прямая корреляция (r=0,8, p<0,001). Роль МСР-1 как основного хемо-кина, действующего преимущественно на территории интерстиция, подтверждается также тем, что его уровень был минимальным при преимущественной локализации фиброза в почечных клубочках, и в 6 раз выше - при локализации фиброза в интерстиции почки (табл. 2).
В отличие от МСР-1, уровень экскреции с мочой фиброгенного фактора роста TGF-ß1 у больных с умеренным мочевым и нефротическим синдромами практически не различался, хотя и был достоверно выше, чем у здоровых лиц. В то же время у больных III группы со стойкой ПН мочевая экскреция TGF-ß1 была значимо выше не только по сравнению со здоровыми лицами, но и по срав-
Таблица 3
Экспрессия а-ГМА миофибробластами в интерстиции почек больных ХГН (n=45)
Группы больных ХГН n Экспрессия а-ГМА
в интерстиции, %
I. С мочевым синдромом 11 9,0 (6,6-10,0)
II. С НС И.1.с НС без ПН 15 9,5 (7,1-11,9)
II.2. с НС и
преходящей ПН 6 21,6^ (21,4-24,2)
III. С НС и стойкой ПН 13 25,3* (18,6-31,7)
• p<0,05, *p<0,01 по сравнению с I и II.1.
нению с больными двух предыдущих групп (см. табл. 1).
Выявлена прямая корреляция между показателем экскреции ТвР-р1 и уровнем сывороточного креатинина (г = 0,5, р<0,05) и обратная корреляция между уровнем ТвР-р1 в моче и скоростью клу-бочковой фильтрации, рассчитанной по Кокрофту-Гоулту (г = -0,6, р<0,01).
При морфометрическом исследовании биопта-тов ткани почки больных ХГН нами установлена зависимость между площадью интерстиция и величиной экскреции ТвР-р1 с мочой: при площади интерстиция более 20%, то есть при выраженном интерстициальном фиброзе, экскреция ТвР-р1 была значительно выше (2,5пг/мл (2,2-4,6)), чем при площади интерстиция менее 20% (0,7 пг/мл (0,141,7)). Высокий уровень ТвР-р1 в моче обнаруживался у тех больных ХГН, у которых выявлялась экспрессия этого цитокина в интерстиции почки, что подтверждает, с одной стороны, его локально-почечное происхождение, с другой стороны, участие ТвР-р1 в формировании интерстициального фиброза.
У больных ХГН с ПН нами отмечена тесная корреляция между экскрецией с мочой МСР-1 и
МСР-1(пг/мл/креатинин мочи)
ГС>1-[11 (пг/мл/креатинин мочи)
Рис. 1. Информативность показателей экскреции с мочой МСР-1 и TGF-p1 для оценки выраженного интерстициального фиброза (>20% коркового слоя) почек у больных ХГН.
ТвР-р1 (г8=0,6,р<0,01), свидетельствующая о содружественном участии этих цитокинов в процессе формирования интерстициального фиброза.
В интерстиции почек больных ХГН изучили содержание основных продуцентов экстрацеллю-лярного матрикса - миофибробластов, экспресси-рующих а-ГМА. Наиболее высокой экспрессия а-ГМА в интерстиции была у больных ХГН с НС и преходящей ПН и у пациентов со стойкой ПН, то есть высокоактивными прогрессирующими формами ХГН (табл. 3). Именно у больных с ПН отмечена прямая корреляция между количеством мио-фибробластов в интерстиции и уровнем креатинина сыворотки крови (г=0,7, р <0,001).
При морфометрическом исследовании отмечена зависимость экспрессии а-ГМА в интерстиции от площади ТИФ (гз =0,8 р<0,001). Нами выявлена сильная прямая корреляция между уровнем интер-стициальной экспрессии а-ГМА и показателями мочевой экскреции МСР-1 (Я =0,7, р<0,05) и ТвР-р1 (Я =0,6, р<0,05). Обнаружена экспрессия а-ГМА клетками канальцев почек, причем именно у больных с высоким содержанием ТвР-р1 в моче. Это подтверждает установленный преимущественно в эксперименте факт трансформации под влиянием ТвР-р1 клеток тубулярного эпителия в миофиб-робласты, которые пополняют пул интерстициаль-ных миофибробластов, продуцирующих ЭЦМ.
Для определения информативности изученных нами мочевых показателей МСР-1 и ТвР-р1 как тестов оценки интерстициального фиброза мы сопоставили разные концентрации этих цитокинов с площадью ТИФ. Оказалось, что с наибольшей точностью формирование интерстициального фиброза (более 20% общей площади) отражают дискриминационные точки на уровне пересечения кривых чувствительности и специфичности: для мочевого показателя МСР-1 - концентрация более 20пг/мл (чувствительность теста составляет 100%, специфичность 89%), а для ТвР-р1 - выше 2,0пг/мл (чувствительность 83%, специфичность 78%) (рис. 1).
В клинических условиях с целью выявления больных с начальными (потенциально обратимыми) изменениями в интерстиции и определения возможных путей торможения дальнейшего прогрес-сирования фиброза важна ранняя диагностика ТИФ. Мы попытались установить минимальные концентрации МСР-1 и ТвР-р1 в моче, достаточные для того, чтобы судить о ранних интерстици-альных изменениях. Было показано, что, начиная с уровня в моче 4,0 пг/мл, МСР-1 уже может отражать увеличение площади интерстиция более 10% (рис. 2). И хотя чувствительность (82%) и специфичность (75%) этого показателя экскреции МСР-
МСР-1(ш7мл/креатинин мочи)
ГСiК-fVI (пг/мл/креатинин мочи)
—♦— чувствительность • специфичность
Рис. 2. Информативность показателей экскреции с мочой МСР-1 и TGF-pi для оценки начальных фиброзных (>10% коркового слоя) изменений в интерстиции почек у больных ХГН.
1 были ниже, чем предыдущего, но достаточны для того, чтобы применять данный мочевой тест как маркер ранней фазы формирования фиброза (см. рис. 2). В то же время концентрация TGF-p1 в моче ниже 2 пг/мл оказалась недостаточно чувствительным (56%) и специфичным (50%) тестом оценки начальной стадии ТИФ (рис. 2). В этой связи мы считаем, что уровень TGF-p1 в моче более 2,0 пг/ мл в сочетании с высокой концентрацией МСР-1 более 20пг /мл является отражением уже сформированного фиброза.
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящее время изучение молекулярных механизмов прогрессирования ХГН, среди которых важное место отводят профиброгенным цитокинам (хемокины, факторы роста), считают перспективным направлением в нефрологии. Интерес к этой проблеме значительно возрос в связи с появлением доступных методов определения уровня цито-кинов в моче и ткани почки (иммунохимические методы, гибридизации in situ и др.), позволяющих оценивать активность и стадию почечного процесса и предполагать характер морфологических изменений в почках.
Важную роль в патогенезе ХГН играет хемо-кин МСР-1, который обеспечивает накопление в очаге воспаления моноцитов (макрофагов) и лимфоцитов, активирует эндотелиальные и гладкомы-шечные клетки сосудов, регулирует основные этапы острого и хронического воспаления в почке, его интеграцию с процессами накопления ЭЦМ, ведущими к ТИФ [5].
В экспериментальных исследованиях подтверждено, что МСР-1 вовлечен в прогрессирование ХГН, главным образом за счет тубулоинтерстици-ального повреждения. Так на модели нефротокси-ческого нефрита было показано, что при одинаковой степени гломерулярных изменений более выраженное тубулоинтерстициальное повреждение развивается у мышей «дикого» типа, способных к экспрессии MCP-1, по сравнению с трансгенными мышами, не синтезирующими MCP-1 [8]. Было установлено, что в ткани почки больных ХГН МСР-1 экспрессируется преимущественно тубу-лярным эпителием, мононуклеарными клетками в зонах интерстициального воспаления, а также эндотелием сосудов интерстиция, и практически не продуцируется клетками клубочка [7].
В нашем исследовании отмечено повышение уровня МСР-1 в моче у больных ХГН по мере нарастания активности нефрита. Уровень МСР-1 в моче прямо коррелировал с величиной суточной протеинурии, что согласуется с современными представлениями о нефротоксическом действии ПУ и подтверждает результаты других клинических и экспериментальных работ [1, 9]. C.J. Burton и со-авт. на культуре монослоя поляризованных тубуляр-ных клеток показали, что под воздействием альбумина происходит секреция МСР-1 тубулярными клетками как в базолатеральных, так и в апикальных отделах [10]. Предполагают, что МСР-1, выделяемый тубулярными клетками со стороны апикальной мембраны, является основным его источником в моче при большинстве форм ХГН. Лишь небольшое количество МСР-1 поступает в просвет канальцев и в мочу, фильтруясь из крови через стенку капилляров клубочков. По-видимому, этот путь имеет большее значение при быстропрогрессирующих формах гломерулонефрита, когда выраженные воспалительные изменения, локализующиеся в клубочках, значительно изменяют их проницаемость, в том числе для воспалительных цитокинов [11].
МСР-1, секретируемый в базолатеральных отделах тубулярных клеток, поступает в интерсти-ций и способствует образованию в нем воспалительного инфильтрата. При исследовании биопта-тов почек больных ХГН методом гибридизации in situ было показано, что моноциты/макрофаги воспалительного инфильтрата в интерстиции экспрес-сируют рецепторы к МСР-1, что подтверждает ведущую роль этого хемокина в формировании интерстициального воспаления [12].
О значении МСР-1 как основного хемокина, действующего преимущественно на территории интер-стиция, свидетельствуют выявленные нами высоко значимые корреляции: между уровнем МСР-1 в
моче больных ХГН и величиной ПУ, а также между мочевым показателем МСР-1, степенью воспалительной клеточной инфильтрации интерстиция и площадью фиброза. Полученные взаимосвязи подтверждают существование при ХГН патогенетической цепи «протеинурия - тубулярная секреция МСР-1 - интерстициальное воспаление - фиброз».
Профиброгенное действие МСР-1 объясняют вызываемой им активацией синтеза макрофагами ТвР-р1. В условиях повышенной продукции ТвБ-р1 происходит трансформация резидентных фиб-робластов в миофибробласты - основные профиб-рогенные клетки, обладающие способностью в большом количестве продуцировать компоненты ЭЦМ [13-16]. Мы отметили прямую сильную корреляцию между мочевыми показателями МСР-1 и ТвР-р1 у больных с нарушением функции почек, и именно у этих больных при исследовании био-птатов почек нами обнаружен фиброз интерстиция.
В нашем исследовании у всех больных ХГН с повышенным уровнем ТвР-р1 в моче мы выявили и его экспрессию в почке, главным образом в ту-булоинтерстиции, в то время как в почке здоровых лиц и пациентов, имеющих низкий мочевой показатель ТвР-р1, он не обнаруживался. Допуская, что это может быть связано с недостаточной чувствительностью примененного нами метода окраски, мы, тем не менее, считаем возможным допустить, что экскретируемый с мочой ТвР-р1 имеет местное (в почке) происхождение и позволяет судить о выраженности процессов ТИФ. Подтверждением нашей точки зрения о том, что ТвР-р1 отражает выраженность фиброзных изменений в интерсти-ции, могут служить и установленные нами прямые корреляции между уровнем экскреции ТвР-р1 с мочой и уровнем сывороточного креатинина, а также площадью интерстиция.
В экспериментальных исследованиях установлено, что продукция ТвР-р1 происходит главным образом в клетках воспалительного инфильтрата в интерстиции почки. В работах с использованием культуры клеток показана возможность синтеза ТвР-р1 и тубулярными клетками [3]. Считают, что ТвР-р1 поступает к базолатеральной поверхности тубулярных клеток, которые начинают экспресси-ровать а-ГМА, отделяются от тубулярной базаль-ной мембраны, мигрируют в интерстиций и, пополняя пул резидентных фибробластов, участвуют в продукции компонентов ЭЦМ и формировании ТИФ [13-17]. Можно полагать, что в более поздней фазе формирования ТИФ ТвР-р1 может проникать в мочу через многочисленные разрывы тубулярной базальной мембраны, возникающие в процессе миграции трансдифференцированных тубулярных кле-
ток (миофибробластов) в интерстиций. В нашем исследовании правомерность этой концепции подтверждает пиковое повышение уровня TGF-ß1 в моче больных III группы с почечной недостаточностью и морфологически доказанным интерсти-циальным фиброзом.
В подтверждение процессов трансдифференциации тубулярных клеток в интерстициальные про-фиброгенные миофибробласты мы выявили в био-птатах почек больных ХГН тяжелого прогрессирующего течения с почечной недостаточностью экспрессию а-ГМА как интерстициальными мио-фибробластами, так и клетками тубулярного эпителия. В нашем исследовании преимущественно в тубулоинтерстиции выявлялась и повышенная экспрессия фактора роста для миофибробластов -TGF-ß1, сочетающаяся с высокой экскрецией TGF-ß с мочой этих больных.
Мы оценили информативность (специфичность и чувствительность) показателей экскреции с мочой МСР-1 и TGF-ß1 для мониторирования фибро-генеза в интерстиции почки при ХГН. Нами было показано, что МСР-1, начиная с уровня его в моче 4,0 пг/мл, может быть использован как маркер ранней фазы формирования фиброза (более 10% общей площади коркового слоя). В то же время уровень в моче МСР-1 более 20 пг/мл и TGF-ß1 более 2,0 пг/ мл информативен как маркер уже сформированного фиброза (площадь интерстиция более 20%).
Полученные нами результаты согласуются с результатами исследования Wada T. и соавт., которые предложили использовать мочевые тесты для неинвазивной оценки стадий фиброза при ХГН и прогнозирования ответа на лечение [5, 7]. Tam F. и соавт. показали, что уменьшение уровня МСР-1 в результате иммуносупрессивной терапии является более ранним лабораторным маркером хорошего ответа на проводимую терапию, чем снижение величины протеинурии или уровня креатинина сыворотки, и напротив, сохранение высоких значений МСР-1 в моче является предиктором неблагоприятного прогноза и быстрого прогрессирова-ния почечной недостаточности [11].
В целом результаты нашего исследования подтверждают, что интерстициальный фиброз - динамический процесс, а использование мочи как субстрата, тесно связанного с больным органом (почкой), может предоставить ценную информацию о процессах воспаления и фиброза в почке. В частности, определение в моче уровня профиброгенных цитокинов МСР-1 и TGF-ß1 является информативным неинвазивным методом оценки ТИФ. Есть основания считать, что изученные мочевые тесты найдут практическое применение для монито-
рирования активности заболевания, оценки его прогноза, обоснования терапии. Так выявление ранней, потенциально обратимой стадии фиброза является показанием для активной иммуносупрес-сивной терапии, в то же время констатация развернутой стадии фиброза обосновывает переход к преимущественно нефропротективной стратегии. По нашим данным, МСР-1, начиная с уровня в моче 4,0 пг/мл, является маркером формирующегося интерстициального фиброза, а высокий уровень экскреции МСР-1 с мочой (более 20 пг/ мл) в сочетании с повышенной экскрецией ТвР-р1 (более 2,0 пг/мл) указывает на выраженность процессов фиброза в почке и обосновывает нефроп-ротективную стратегию, то есть применение препаратов, преимущественно действующих на механизмы накопления фиброзной ткани в почке. Кроме уже применяемых с этой целью ингибиторов АПФ и блокаторов рецепторов к ангиотензи-ну, в стадии разработки находится и ряд других средств с анти-ТвР-р1 и антихемокиновым эффектами [5, 18, 19].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в результате проведенного исследования определены два показателя, позволяющие оценивать степень фиброза в почке - уровень экскреции с мочой МСР-1 и ТвР-р1. Благодаря доступности материала исследования с помощью этих «мочевых» тестов стало возможным мониторировать процесс фиброгенеза на разных стадиях, что имеет важное практическое значение для оценки прогноза и определения тактики лечения больных хроническим гломерулонефри-том. Изучение роли молекулярных медиаторов в механизмах индуцируемого протеинурией ремоде-лирования почечного интерстиция открывает перспективу включения средств, целенаправленно воздействующих на эти медиаторы (хемокины и ТвР-р1 и др.) в общую стратегию нефропротекции. Некоторые из них уже сегодня прошли успешную доклиническую апробацию.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Eddy AA. Proteinuria and interstitial injury. Nephrol Dial transplant 2004; 19: 277-281
2. Bohle A, Muller GA, Wehrmann W et al. Pathogenesis of chronic renal failure in the primary glomerulopathies, renal vasculopathies and chronic interstitial nephritides. Kidney Int 1996; 54: 2-9
3. Bottinger EP, Bitzer M. TGF-ß signaling in renal disease. J Am Soc Nephrol 2002; 13: 2600-2610
4. Schneider A, Panzer U, Zahner G et al. Monocyte chemoattractant protein-1 mediates collagen deposition in experimental glomerulonephritis by transforming growth factor-beta. Kidney Int 1999; 56 (1): 135-144
5. Wada T, Yokoyama H, Kobayashi K. Chemokines: new target molecules in renal diseases. Clin Exp Nephrol 2000; 4: 273-280
6. Honkanen E, Teppo A, Tornroth T et al. Urinary transforming growth factor-beta 1 in membranous glomerulonephritis. Nephrol Dials Transplant 1997; 12 (12): 2562-2568
7. Wada T, Yokoyama H, Su S et al. Monitoring urinary levels of monocyte chemotactic and activating factor reflects disease activity of lupus nephritis. Kidney Int 1996; 49: 761-767
8. Tesch GH, Schwarting A, Kinoshita K et al. Monocyte chemoattractant protein-1 promotes macrophage-mediated tubular injury, but not glomerular injury, in nephrotoxic serum nephritis. J Clin Invest 1999; 103 (1): 73-80
9. Remuzzi G, Bertani T. Pathophysiology of progressive nephropathies. N Engl J Med 1998; 20 (339):1448-1456
10. Burton CJ, Combe C, Walls J, Harris KPG. Secretion of chemokines and cytocines by tubular epithelial cells in response to proteins. Nephrol Dial Transplant 1999; 14: 2628-2633
11. Tam FWK, Sanders JS, George A et al. Urinary monocyte chemoattractant protein -1 (MCP-1) is a marker of active renal vasculitis. Nephrol Dial Transplant 2004; 19: 2761-2768
12. Cockwell P, Howie AJ, Adu D et al. In situ analysis of CC chemokine mRNA in human glomerulonephritis. Kidney Int 1998; 54 (3): 827
13. Bottinger EP, Bitzer M. TGF-ß signaling in renal disease. J Am Soc Nephrol 2002; 13: 2600-2610
14. Kalluri R, Neilson EG. Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis. J Clin Invest 2003; 112: 1776-1784
15. Liu Y. Epithelial to mesenchymal transition in renal fibrogenesis: pathologic significance, molecular mechanism and therapeutic intervention. J Am Soc Nephrol 2004; 15: 1-12
16. Masszi A, Ciano CD, Sirokmany G et al. Central role in TGF-ß1-induced a-smooth muscle actin expression during epithelial-mesenchymal transition. Am J Physiol Renal Physiol 2002; 284: 911-924
17. Fan JM, Ng YY, Hill PA et al. Transforming growth factor beta regulates tubular epithelial-myofibroblasts transdifferentiation in vitro. Kidney Int 1999; 56(4): 1455-1467
18. Border WA, Okuda S, Languino LR et al. Suppression of experimental glomerulonephritis by antiserum against transforming growth factor ß1. Nature 1990; 346: 371-374
19. Negri AL. Prevention of progressive fibrosis in chronic renal diseases: Antifibritic agents. J Nephrol 2004; 17 (4): 496-503
Поступила в редакцию 02.10.2006 г.
