CC BY
29
УДК 544.773.32+616-066.6+615.014.674
Мищенко Е.В., Гилева А.М., Марквичева Е.А., Королёва М.Ю., Юртов Е.В.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОНИКНОВЕНИЯ НАНОЭМУЛЬСИЙ В РАКОВЫЕ КЛЕТКИ МЕТОДОМ КОНФОКАЛЬНОЙ МИКРОСКОПИИ
Мищенко Екатерина Валерьевна, магистрант 1 года кафедры наноматериалов и нанотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, e-mail: mishchenkoek@list.ru;
Гилева Анастасия Михайловна, аспирант 4 года Группы биомедицинских материалов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН;
Марквичева Елена Арнольдовна, д.х.н., вед. науч. сотр. руководитель группы биомедицинских материалов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Королёва Марина Юрьевна, д.х.н., профессор кафедры наноматериалов и нанотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева;
Юртов Евгений Васильевич, член-корр., РАН, зав. кафедрой наноматериалов и нанотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125047, Москва, Миусская площадь, д. 9
Наноэмульсии являются перспективными носителями лиофильных лекарственных соединений в клетки. в том числе в раковые клетки. В данной работе было исследовано проникновение капель наноэмульсии, стабилизированные Tween 60 и Span 60, в раковые клетки глиомы крысы С6. Средний размер капель наноэмульсии-60 нм. Изучение проникновение наноэмульсии в клетки показало, что капли наноэмульсии накапливаются в цитоплазме и клеточных органоидах.
Ключевые слова: наноэмульсия, адресная доставка лекарств, клетки глиомы крысы С6
STUDY OF PENETRATION OF NANOEMULSIONS INTO CANCER CELLS BY CONFOCAL MICROSCOPY METHOD
Mishchenko E.V.1, Gileva A.M.2, Markvicheva E.A.2, Koroleva M.Y.1, Yurtov E.V.1 :D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
Nanoemulsions are promising carriers of lyophilic drug compounds in cells. including cancer cells. In this paper, the penetration of nanoemulsion droplets stabilized by Tween 60 and Span 60 into C6 cells from rat was investigated. The average size of nanoemulsion droplets was 60 nm. A study of the effectiveness of nanoemulsion penetration into cells showed that nanoemulsion droplets accumulated in the cytoplasm and cell organoids.
Key words: nanoemulsion, targeted drug delivery, C6 cell line from rat
Одним из перспективных направлений в настоящее время является направленная доставка лекарственных соединений в организм человека, в том числе и различных противораковых средств. Для повышения эффективности доставки лиофильных лекарственных соединений к пораженному органу могут быть использованы различные липидные носители: липосомы, твердые липидные наночастицы, наноэмульсии [1-2]. Особый интерес представляют наноэмульсии с размером капель дисперсной фазы 15-70 нм [3-4]. Такие нанокапсулы, состоящие из жидкого ядра, окруженного твердой оболочкой, перспективны для инкапсулирования лиофильных лекарственных веществ [5].
В данной работе были получены наноэмульсии, состоящие из углеводородного масла (Britol 20, USP) в качестве дисперсной фазы наноэмульсий. Дисперсионная среда представляла собой 0,9 мас.% водный раствор NaCl. Для стабилизации наноэмульсий были использованы неионогенные ПАВ Span 60 - сорбитанмоноолеат с ГЛБ 4,7, а
также Tween 60 - полиэтиленгликоль сорбитанмоноолеат с ГЛБ 14,9 (Sigma-Aldrich). Смесь молекул ПАВ на поверхности капель наноэмульсии образовывала твердую оболочку.
Размер капель наноэмульсии, определенный с помощью метода динамического светорассеяния (Zeta Sizer Nano, Malvern) варьировался от 40 до 90 нм, средний размер составлял 60 нм.
В состав наноэмульсий был включен флуоресцентный краситель Нильский красный (Nile Red), который используется для определения локализации нейтральных липидных включений в клетках. Концентрация Нильского красного в эмульсии составляла 0,025 мг/мл.
Эффективность проникновения капель наноэмульсии в раковые клетки была исследована на клеточной линии глиомы крысы С6 с помощью конфокальной микроскопии. Клетки С6 (106 /мл среды ДМЕМ) были помещены в 96-луночный планшет и помещены в СО2-инкубатор на 24 ч. Затем клетки были последовательно окрашены
сначалаИеиш^Ю (10ц1 концентрированного стока на 1 ml среды) в течение 5 мин, затем Hoechst (110 стока на 1 ml среды) в течение 15 мин. После каждого окрашивания клетки отмывались от избытка красителя физиологическим раствором 2-3 раза. После окрашивание во все лунки добавлялась наноэмульсия в количестве 40 на 1 ml среды, и содержимое выдерживалось в инкубаторе 15 и 60
Ялрл Цитоплазма в мембраны
Hoechst Neum-DiO
мин. После отмывки физиологическим раствором клетки фиксировали 5% раствором формалина.
Проникновение наночастиц эмульсии в клетки изучали с помощью конфокального лазерного микроскопа Nikon TE-2000 с конфокальным лазером EZ-C1 (Япония). Микрофотографии были получены с помощью программного обеспечения (ПО) Nikon EZ-C1 (рис. 1).
Частицы
Рис. 1. Микрофотографии клеток глиомы крысы С6 после инкубации с наноэмульсией в течение 15 мин, полученные методом конфокальной микроскопии. Цитоплазма клеток окрашена витальным красителем Neuro-Dio (зеленый), ядра клеток - красителем Hoechst (синий), капли наноэмульсии - красителем Nile Red (красный). Шкала - 30 мкм.
Как видно из фотографий, приведенных на рис. 1, через 15 мин после начала эксперимента наноэмульсия проникает в клетку и накапливается в цитоплазме и клеточных органоидах (возможно, в эндосомах, лизосомах). Проникновения в ядро не происходит даже после 60 минут контакта клеток с наноэмульсий. По вертикальным срезам (рис. 2) видно, что частицы находятся внутри клетки, а не на ее поверхности.
Таким образом, капли наноэмульсии с твердой оболочкой из молекул ПАВ проникают в клетки, поэтому возможно их использование для доставки лиофильных лекарственных средств в раковые клетки.
Данная работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках базовой части государственного задания контракт № 10.4650.2017/6.7.
Список литературы
1. Королева М. Ю., Юртов Е. В. Наноэмульсии: свойства методы получения и перспективные области применения // Успехи химии. — 2012. — Т. 81, № 1. — С. 21-43.
2. Koroleva M.Y., Nagovitsina T.Y., Bydanov D.A., Gorbachevski O.S. Nano- and microcapsules as drug-delivery systems // Resource-Efficient Technologies. - 2016. - Vol. 2. - P. 233-239.
3. Koroleva M., Nagovitsina T., Yurtov E. Nanoemulsions stabilized by non-ionic surfactants: stability and degradation mechanisms // Physical Chemistry Chemical Physics. — 2018. — Vol. 20. — P. 10369-10377
4. Королева М. Ю., Наговицына Т. Ю, Быданов Д. А., Юртов Е. В. Прямые наноэмульсии, стабилизированные смесями неионогенных ПАВ // Бутлеровские сообщения. — 2014. — Т. 38, № 4. — С. 119-125.
5. Koroleva M.Y., Nagovitsina T.Y., Yurtov E.V. Properties of nanocapsules obtained from oil-in-water nanoemulsions // Mendeleev Communications. - 2015. -Vol 25 - P. 389-390.
