CC BY
122
&______________
ФАРМАКОЛОГИЯ
БИОМЕДИЦИНА • № 6 2007, с. 103-110
Исследование пролонгированного действия короткоживущих анксиогенных олигопептидов на крысах
И.П. Ашмарин, Р.А. Данилова, О.И. Рудько
Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, Москва
Анксиогенные олигопептиды (AO) характеризуются коротким периодом полураспада in vivo - менее 15 минут, что ведет к расщеплению более чем 99,99% AO уже к 10-15 часу после парентерального введения. Поэтому особенного внимания заслуживают факты пролонгированных до 1-14 суток эффектов таких АО, как холецистокинин-4 и -3, и 5НТ-модулин. Обсуждаются возможные механизмы этого явления: депонирование части АО, последовательная индукция (супрессия) выхода других регуляторных соединений, длительная сенситизация рецепции АО.
Ключевые слова: депрессия, анксиогенные пептиды, короткоживущие пептиды, длительное действие
В 1970-е годы развитие исследований пептидергической регуляции породило надежды на быстрое создание наиболее физиологичных лекарственных средств на основе регуляторных пептидов (РП). Главным препятствием на этом пути явилась неустойчивость большинства РП in vivo, особенно при введении извне. Сроки их полураспада редко превышают 15 минут. К 15-20 часам после парентерального введения пептид полностью распадается. Естественно, внимание исследователей было направлено на эффекты РП, проявляющиеся в течение первых часов после введения. Более поздние, часто менее выраженные эффекты ускользали нередко от основательного изучения. Между тем, постепенно накапливалось всё больше данных об эффектах, проявляющихся на 1-14 сутки и даже далее. При этом следует отметить два типа долговременных эффектов (ДЭ) лабильных РП. Первый тип характеризуется такими эффектами, которые существенно отличаются от начальных. К этому типу ДЭ относятся, в частности, эффекты ряда олигопептидных рилизинг-гормонов гипоталамуса. Они индуцируют выход долгоживущих гормонов и, таким об-
разом, механизм этого типа ДЭ имеет очевидное объяснение. Значительно труднее истолковать механизм второго типа ДЭ, когда возникает эффект идентичный начальному после полного расщепления введенного РП, — на 1- 14-е сутки. Мы также столкнулись с рядом таких явлений [4]. Задача настоящей статьи состоит в обобщении данных о пролонгированных эффектах анксиогенных олигопептидов холецисто-кинина-4 и -3 и 5-НТ-модулина, а также в обсуждении основных гипотез о механизмах долговременных эффектов РП.
Материалы и методы
Работа выполнена на 120 неинбредных крысах (самцах) ШБ1аг из питомника Андреевка. Вес животных составлял 150-250 г, возраст — 8-10 недель. Во время проведения экспериментов животные находились в виварии с контролируемыми БРБ-условиями: температура окружающего воздуха 22±2°С, относительная влажность 50±5%, автоматическая смена светового периода «день» с 8:00 по 20:00, «ночь» с 20:00 по 8:00. Крысы со-
держались в пластмассовых клетках (60х35х20), оборудованных стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением и разделителями, с древесными опилками в качестве подстилочного материала, по 7-8 крыс в клетке. Экструдированный и сбалансированный комбикорм ПК-120-1 для лабораторных крыс и мышей (ООО «ЛАБОРАТОРСНАБ» ГОСТ Р 50258-92) дается ad libitum. Вода — в стандартных питьевых бутылочках со стальными крышками-носиками. Для исследований использованы три пептида: 1) фирменный препарат ССК-4 (TTp-Met-Asp-Phe-NH2 (ICN Biomedical Inc.) и 2) синтезированные НИИМГ РАН препараты ССК-3 (Met-Asp-Phe-NH2) и 3) эндогенный тетрапептид 5-гидрокситрипта-мин-модулин (Leu-Ser-Ala-Leu) 5-НТ-мо-дулин. Указанные препараты вводили инт-раперитонеально в дозах от 40 мкг до 400 мкг на кг веса крысы (объем 0,2 мл). Контрольным группам вводили физиологический раствор в том же объеме. Тестирование отставленных эффектов проводили в интервале от 1 до 20 суток после введения пептидов. Для выявления компонентов тревожности и страха в поведении крыс был использован крестообразный лабиринт и “dark-ligth” тест. Склонность крыс к развитию депрессивно-подобного состояния оценивали по методике Порсольта в тесте неизбегаемого плавания. Для статистической обработки данных использовали непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.
Результаты исследований
Ранее нами показано, что однократное парентеральное введение ССК-4 в дозах от 100 до 400 мкг/кг за 40-60 минут до тестирования оказывает анксиогенный эффект, выражающийся в изменении показателей поведения в крестообразном приподнятом лабиринте, указывающих на наличие компонентов тревожности и страха, и об угнетении двигательной и ориентировочно-исследова-
тельской активности при наличии стрессор-ного звукового раздражителя. Кроме того, показано наличие депрессивных компонентов в поведении крыс — статистически значимое дозозависимое увеличение времени иммобилизации и снижение времени активного плавания в тесте неизбегаемого плавания Порсолта. Исследования с ССК-З также указывают на выраженный анксиогенный эффект через 40-60 минут после парентерального введения во всех используемых тестах, аналогичный эффекту CCK-4, и даже в значительно меньших дозах — 40 мкг/кг.
Однако в дальнейших исследованиях [4, 2] было отмечено, что анксиогенные эффекты после однократного введения пептидов сохраняются на более длительное время (см. табл. 1 и табл. 2). Так, через 1 сутки после введения как ССК-4 (400 мкг/кг), так и ССК-З (40 мкг/кг) по основным показателям в крестообразном лабиринте (число выходов на открытые лучи, время пребывания на них и поведение риска) отмечены изменения, свидетельствующие о повышенном уровне тревожности. На 5-е сутки после однократного введения ССК-4 ан-ксиогенный эффект не только не уменьшился, но и стал более выраженным, как при первичном тестировании через 5 суток после введения пептида, так и в том случае, когда крысы через 5 суток тестировались повторно (первичное тестирование через 40-60 мин после введения). Данные тестирования в светло-темной камере также согласуются с крестообразным лабиринтом и указывают на проявления тревожности — уменьшается латентный период первого ухода из светлого отсека и статистически значимо снижается общее время пребывания в светлом отсеке. Тестирование через 10-12 суток после введения как ССК-4, так и ССК-З показало, что, как в крестообразном лабиринте, так и в темно-светлой камере изменения в поведении, указывающие на проявление тревожности сохранились, но стали менее выраженными.
Таблица 1
Поведенческие эффекты однократного введения ССК-4 (400 мкг/кг)
Тест Время тестирования после введения (в % к контролю)
1 сутки 5 суток 10-12 суток
Крестообразный лабиринт Число выходов в открытые лучи 69,9 29,2 р< 0,05 66,7
Время пребывания в открытых лучах 77 2,9 р< 0,05 4,57 р< 0,05
Соотношение числа выходов в открытые лучи к общему числу переходов 55,9 27 р< 0,05 72,8
Поведение риска 9,8 р< 0.05 11,8 р< 0,05 33,3
Тест Порсолта Время иммобилизации 112,9 103,9
Время активного плавания 73,5 р< 0.05 61,5 р< 0,05
Время пассивного плавания 110 р<0.05 120 р< 0,05
Таблица 2
Эффекты однократного введения ССК-3 (40 мкг/кг)
Тест Время тестирования после введения (в % к контролю)
1 сутки 5 суток 10-12 суток
Число выходов в открытые лучи 74,8 45 р< 0,05 78,6
Время пребывания 78 2,7 26,4
в открытых лучах р< 0,01 р< 0,05
Соотношение числа выходов в открытые лучи к общему числу переходов 50,1 59,4 р<0,05 45,2 р< 0,05
Поведение риска 0 р< 0,05 116,7
Время иммобилизации 140,7 р< 0,05 138,4 р< 0,05
Время активного плавания 75,6 р< 0,05 80,6 р< 0,05
Время пассивного плавания 100 99,2
I
а
ю
(Л
(Л
а
ю
о
о
I—
о
0)
а
о
о
а
о
с
Наряду с повышением тревожности отмечено и наличие депрессивных компонентов в поведении крыс после однократного введения пептидов — увеличение времени иммобилизации и снижение времени активного плавания в тесте Порсолта. Исследования с отставленными сроками тестирования показали, что через 1 сутки, также как и через 40-60 минут после введения пептидов, отмечено снижение времени активного плавания и увеличение времени иммобилизации. Через 5 суток эти изменения не только сохранились, но и стали более выраженными — в группе с ССК-3 достоверно уменьшение времени активного плавания и увеличение времени иммобилизации, а в группе с ССК-4 достоверно уменьшение времени активного плавания и увеличение времени пассивного плавания.
Отставленные эффекты однократного введения пептидов отмечены нами и на биохимическом уровне [4, 2]. Так, через 5 дней после однократного введения ССК-4 наблюдаемые изменения в уровне DA, его метаболитов и отношения их к DA (статистически значимое снижение) имели ту же направленность, что и через 4060 минут после введения и были гораздо более выраженными. Уровень 5-НТ и его метаболита — НІАА при этом статистически значимо снижались.
Через 5 суток после введения ССК-3 отмечалось снижение уровня дофамина (74% от контроля, статистически не значимо) и статистически значимое снижение НУА и повышение соотношения DOPAK/DA, а также уменьшение соотношения НІАА/5-НТ.
Таким образом, однократное введение пептидов ССК-4 и ССК-3 вызывает пролонгированный эффект как на поведенческом, так и на биохимическом уровне.
Начатые нами исследования с пептидом, специфически взаимодействующим
с рецепторами IB-подтипа серотонина — 5НТ-модулином, также свидетельствуют о пролонгированных эффектах однократного введения 5НТ-модулина в дозе 400 мкг/кг веса. Анксиогенные эффекты при введении 400мкг/кг 5НТ-модулина наблюдались через 1 сутки, как при повторном, так и первичном тестировании крыс в крестообразном лабиринте — снижение числа выходов и времени пребывания на открытых лучах и снижение показателей «поведения риска». Признаки тревожного поведения через 1 сутки после введения отмечены и в «dark-light» тесте — снижение числа выходов в светлый отсек (р < 0,001) и времени пребывания на свету (р<0,05).
Результаты теста неизбегаемого плавания указывают на выраженные компоненты депрессивно-подобного поведения у опытных крыс по сравнению с контрольными через 1 сутки после введения 5НТ-модулина — увеличение времени иммобилизации (192% к контролю, р<0/01). Через 2 суток после введения время иммобилизации остается в 1,5 раза больше по сравнению с контролем.
Обсуждение результатов
Представленные данные свидетельствуют о способности анксиогенных олигопептидов ССК-4,-3 и 5-НТ-модулина индуцировать пролонгированные эффекты, идентичные по характеру ранним эффектам этих пептидов в течение 1-14 суток. Периоды полураспада CCK-4, -3 не превышают 13 минут и, следовательно, уже к 10-15 часу после парентерального введения можно полагать их отсутствие в организме [7, 10]. Очевидна трудность объяснения поздних эффектов. Ниже представлены три основных гипотезы, которые могут быть предложены для истолкования этого явления.
1. Резервирование, депонирование РП Исследования динамики распада олигопептидов после парентерального введения свидетельствуют о существовании нескольких фаз процесса. После быстрого распада большей части олигопептида (обычно свыше 99,99 %) следует фаза относительно медленного расщепления оставшейся части. Это связывают с наличием в плазме крови и тканях белков, способных нековалентно взаимодействовать с пептидом и защищать его от протеаз. Таковы давно выявленные нейрофизины — переносчики вазопрессина и окситоцина, а также целый ряд позже найденных белков, с большим или меньшим сродством связывающих энкефалины, эндорфины, кортиколиберин и др. [14, 11, 8, 5 и др.]. Однако, если пытаться объяснить таким образом поздние эффекты, идентичные начальным, то очевидно противоречие между долей оставшегося РП (менее 0,01%) и четкой выраженностью, достоверностью поздних эффектов.
2. Индукция или подавление выхода долгоживущих регуляторных соединений
Известен ряд лабильных олигопептидных РП, способных индуцировать или подавлять выход долгоживущих регуляторов. Таковы многочисленные рилизинг-факторы гипоталамуса, которые вызывают непосредственно быстрые физиологические эффекты и одновременно регулируют выход значительно более устойчивых гормонов. Всесторонне изучены быстрые воздействия тиролиберина на эмоциональный статус, двигательную активность, кровообращение мозга и дыхание при одновременной индукции выхода тиротропина, который, в свою очередь, стимулирует выход гормонов щитовидной железы [1, 12]. Гонадолиберин оказывает быстрое стимулирующее действие на половое поведение, индуцируя при этом выход лютеинизирующего и фолли-кулстимулирующего гормонов, обеспечивающих овуляцию и сперматогенез [6, 9].
Процессы такого типа характеризуются существенными отличиями быстрых начальных и последующих длительных эффектов. Для лабильных РП — таких, как холецисто-кинины-3 и -4 и 5НТ-модулин, такой механизм ДЭ, идентичных начальным, представляется маловероятным. Поздние и начальные эффекты этих пептидов, представленные выше, весьма сходны. Опубликованы исследования, в которых показано возрастание в плазме крови концентраций адре-нокортикотропина, кортизола и С-белка после введения ССК-4 [16, 13]. Однако период, в течение которого это наблюдается, не превышает 1-2 часа. Кроме того, эти соединения в физиологических концентрациях не обладают анксиогенным действием, которое можно было бы сопоставить по интенсивности и ряду особенностей с ХЦК-4. Это не позволяет распространить вторую гипотезу на возможные механизмы пролонгированного действия ССК-4 и -3, хотя, в принципе, нельзя исключить индукцию каких-либо других долгоживущих регуляторных соединений и, наконец, «запуск» последовательной многоступенчатой индукции многих различных регуляторов [3].
3. Длительное изменение возбудимости рецепторов после начального введения РП Привлекательна гипотеза, предполагающая длительное изменение чувствительности рецепторов после кратковременного воздействия АО. Для восприятия этой гипотезы необходимо иметь в виду, что при тестировании тревожности или депрессивности экспериментальных животных в приподнятом крестообразном лабиринте или при не-избегаемом плавании происходит выброс эндогенных АО - ССК-4, ССК-3 и 5-НТ-модулина. Они действуют на рецепторы обычного уровня чувствительности. Если же до тестирования животное уже подвергалось воздействию вводимых извне этих же пептидов, то возможно повышение чувствительности, гиперсенситизация рецепто-
ров. Этот процесс сходен с реакциями проторения синапса, формирования кратковременной или оперативной памяти, длительность которой может измеряться сутками. Они рассмотрены в большом числе исследований последних трех десятилетий и включают, например, такие реакции, как аутофосфорилирование протеинкиназ, демаскирование резервных рецепторов [15] и т.п. В результате при тестировании на 1-14 сутки секретируемый эндогенный АО воздействует на гиперсенситизированные рецепторы, что и объясняет явление пролонгированного эффекта АО. На рис. представлена схема, иллюстрирующая гипотезу. Разумеется, необходимо экспериментальное ее подтверждение с помощью анализа изменений в системе рецепции.
Вывод
Таким образом, представленные выше экспериментальные данные о пролонгированных эффектах анксиогенных пеп-
тидов холецистокинина-4, холецистоки-нина-3 и серотонин-модулина в наибольшей мере согласуются с гипотезой о длительной гипосенситизации рецепторной системы при воздействии введенного извне пептида. В результате реакция на выброс тех же пептидов, происходя -щий при последующем тестировании (в кросс-лабиринте, при неизбегаемом плавании) на поздних сроках, оказывается значительно усиленной. Рецепторная система как бы запоминает мощное первичное воздействие на период до 14 суток, который существенно больше срока существования инъецированного пептида. Следует еще раз отметить, что это явление сходно с проторением синапса при формировании долговременной нейро-логической памяти. Доказательством этой гипотезы может быть лишь биохимический анализ изменений рецепторной системы после однократного введения анксиогенных пептидов.
Исследования поддержаны грантом РФФИ № 05-04-48736а
Рис. Схема, иллюстрирующая процессы, возникающие после введения короткоживущих анксиогеннных олигопептидов (АО)
ЛИТЕРАТУРА
1. Ашмарин И.П., Гурская И.Е., Гусева А.А. и др. Тиролиберин (ТРГ) — новые физиологические эффекты и перспективы клинического применения. // Вестник РАМН, в. 6, с. 40-44, 1992.
2. Ашмарин И.П., Данилова Р.А., Рудько О.И. и др. Долговременное действие пептидных регуляторов: отложенные и инверсные эффекты холецистокинина-4 и -3. // Медицинский академический журнал, т. 4, № 1, с. 4-13, 2004.
3. Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. Регуляторные пептиды, функционально-непрерывная совокупность. // Биохимия, № 3, с. 263-271, 1986.
4. Ashmarin I.P., Rud’ko O.I., Danilova R.A., Andreeva L.A. Postponed effect of chole-cystokinin fragments 30-33 (CCK-4) and 31-33 (CCK-3) on albino rats behavior. // Neurosci. Res. Comm., v 34, № 3, p. 165173, 2004.
5. Behan D.P., Linton E.A., Lowry P./.Isolation of the human plasma corticotrophin-releas-ing factor-binding protein. // /. Endocrinol., v. 122, No.1, p. 23-31, 1989.
6. Conn P.M., Crowley W.F. Gonadotropin-releasing hormone and its analogs. // Annu. Rev. Med., v. 45, p.391-405, 1994.
7. Deschodt-Lanckman М., Bui N.D, Noyer M., Christophe /. Degradation of cholecys-tokinin-like peptides by a crude rat brain synaptosomal fraction: a study by high pressure liquid chromatography. // Regul. Pept., v. 2, No. 1, p. 15-30, 1981.
8. Heldebrand A., Preissner K.T., Muller-Berghaus G., Teschemacher H. A novel -endorphin binding protein (= vitronectin) exhibits specific non-opioid binding sites
for -endorphin upon interaction with heparin or surfaces. // J. Biol. Chem., v.264, No. 26, p. 15429-15434, 1989.
9. Kadar T., Telegdy G., Schally A.V. Behavioral effects of centrally administration LH-RH agonist in cats. // Physiol. Behav, v. 51, No. 3, p. 601-605, 1992.
10. Koulischer D., Moroder L., Deschodt-Lanckman M. Degradation of cholecys-tokinin octapeptide, related fragments and analogs by human and rat plasma in vitro. // Regul. Pept., v.4, No. 3, p. 127-139, 1982.
11. Nakajima S., Komuro T., Shimamura M., Hazato T. Enkephalin-binding protein in human blood. // Biochem. Int., v 19, No.
3, p. 529-536, 1989.
12. O’Leary R., O’Connor B. Thyrotropin-releasing hormone. // J. Neurochem., v 65, No. 3, p. 953-963, 1995.
13. RaduD., Ahlin A., SvanborgP., LindeforsN. Anxiogenic effects of the CCK (B) agonist pentagastrin in humans and dose-dependent increase in plasma C-peptide levels. // Psychopharmacol., v 161, No. 4, p. 396403, 2002.
14. Roscetti G., Venturelli F., Roda L.G. Enkephalin binding systems in human plasma III: comparative protection of different peptides. // Neurochem. Res., v 13, No. 3, p. 221-224, 1988.
15. Siegel G.J., Albers R.W., Brady S., Price D.L. Basic neurochemistry: molecular, cellular and medical aspects. — USA, Academic Press, 1016 p. 2005.
16. Strohle A., Holsboer F., Rupprecht R Increased ACTH concentrations associated with cholecystokinin tetrapeptide-induced. Panic attacks in patients with panic disorder. // Neuropsychopharmacology, v 22, No. 3, p.251-256, 2000.
PROLONGED ACTION OF SHORT-LIVED ANXIOGENIC OLYGOPEPTIDES I.P.Ashmarin, R.A.Danilova, O.I.Rud'ko
Moscow State University, Moscow
Key words: depression, anxiogenic peptides, prolonged action, short-lived peptides.
Anxiogenic olygopeptides (AO) have in vivo a very short lifetime, less than 15 min. It leads to the degradation of more than 99,99% of parenterally administrated AO during 10-15 hours. Therefore, it is important to pay attention to data of prolonged (till 1-14-th day) effects of cholecystokinin-4, -3 and 5-HT-moduline. Some possible mechanisms of such effects are under consideration: partial reservation of AO, induction of other regulatory compounds, releasing and long lasting sensitization of receptors.
