CC BY
17УДК: 616.211.154-07:616-092.4+612.014.4
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНОЙ АКТИВНОСТИ СИНОНАЗАЛЬНОГО СЕКРЕТА ПРИ ОСТРОМ ГНОЙНОМ РИНОСИНУСИТЕ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТА
А. А. Завалий, А. В. Кубышкин
Кафедра общей и клинической патофизиологии Медицинская академия имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ имени В. И. Вернадского»
Адрес переписки: бул. Ленина. 5/7, г. Симферополь, Республика Крым, Российская Федерация E-mail: antonzavalii@gmail.com, anatoly_diltek@mail.ru
РЕЗЮМЕ
Проведено экспериментальное исследование динамики показателей поверхностной активности смывов из околоносовых пазух методом изучения стабильности пузырьков пены смывов в висячей капле в условиях экспериментального острого гнойного риносинусита на фоне мукоактивной терапии. Исследование выполнено на 40 кроликах породы «Шиншилла», у которых был моделирован верхнечелюстной синусит c использованием S. aureus 106 КОЕ/мл. Животные были разделены на группы в зависимости от примененного мукоактивного препарата: ацетилцистеина, карбоксиметилцистеина, фитонирингового препарата BN0-101.
В результате были выявлены достоверные отличия между группами. Экспериментальные исследования позволяют предположить, что применение ацетилцистеина целесообразно в течение первых 4-х суток от начала болезни, карбометилцистеин - в течение не более 6-7 дней, т.к. можно ожидать развитие синдрома «затопления» слизистой оболочки. В случае течения острого риносинусита без значительного снижения поверхностной активности можно до 10 дней применять фитониринговый препарат BN0-10.
Предложенный метод мониторинга функционального состояния мукоцилиарного аппарата околоносовых пазух даёт возможность получать количественные показатели, поддающиеся статистическому анализу и имеющие динамическую изменчивость в течение болезни и в процессе лечения.
THESTUDYOFSURFACEACTIVITYOFTHESINONASALDISCHARGEINACUTEPURULE NTRHINOSINUSITISINTHEEXPERIMENTALSETTINGS
А. А. Zavalii, А. V. Kubyshkin
SUMMARY
In experimental study has been conducted investigation of the changes in the surface activity parameters of the paranasal sinuses over time via a method studying the stability of the bubbles in the hanging drop obtained from the foam of the swabs in the experimental model of acute purulent rhinosinusitis during the mucoactive therapy. The study was performed on 40 Chinchilla rabbits using a model of maxillary sinusitis (S. aureus106 CFU/ml). The animals were divided into groups depending on the used mucoactive agents: acetylcysteine, carboxymethylcysteine, phytoneering BN0-101.
As a result, significant differences were observed between the groups. Using in experiment of acetylcysteine is reasonable for the first 4 days from the disease onset, but the use of carboxymethylcysteine - within no more than 6-7 days because the syndrome of «flooding» of the mucous membrane may develop. In case of acute rhinosinusitis without significant reduction of the surface activity the phytoneering BN0-101 may be used up to 10 days.
The proposed method monitoring the functional state of the mucociliary apparatus in the paranasal sinuses makes it possible to obtain quantitative parameters which can be statistically analyzed during the disease course and the treatment process.
Ключевые слова: острое гнойное воспаление околоносовых пазух, мониторинг функции мукоцилиарной транспортной системы, поверхностная активность, мукоактивная терапия
Актуальность. Воспалительный отёк слизистой оболочки и гиперсекреция слизи являются ключевыми патогенетическими факторами ри-носинуситов [1, 2]. Отёк в первую очередь вызывает недостаток слизи на поверхности эпителия, а затем и расстройство секреторной функции желез слизистой оболочки, которое усугубляет нарушение реологических свойств секрета, то есть, развивается дисбалланс гель-фазы и золь-фазы [3]. В этих условиях мукоцилиарный
транспорт работает с избыточной нагрузкой и не в состоянии обеспечивать должный клиренс, в результате чего в околоносовых синусах скапливается склонная к инфицированию слизь.
Таким образом, риносинусит любой этиологии сопряжён с нарушением функции мукоци-лиарной транспортной системы (МЦТС), которое приводит к поражению дренажной функции соустий синусов. При этом в МЦТС выделяют два ключевых компонента: морфологический
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
и секреторный [4, 5]. Для осуществления эффективного мукоцилиарного транспорта требуется содружественное взаимодействие обоих компонентов МЦТС: двигательная активность ресничек, необходимая для перемещения фиксирующей инородные агенты поверхностной гель-фазы секрета, возможна только в жидкой среде, которая представлена подлежащей фазой золя [6]. Таким образом, нарушение соотношения фаз слизи в любую из сторон влечёт к снижению эффективности транспорта, и, как следствие, к ухудшению работы МЦТС в целом.
Из двух компонентов МЦТС именно секреторный является восполнимым и регулируемым фактором, так как его нарушения имеют физико-химический характер, а не морфологический, проявляющийся повреждением эпителиальных структур. Реологические свойства секрета - вязкость и эластичность, отражающие динамику изменений в условиях воспаления - могут быть выражены через физическую величину поверхностное натяжение (ПН), прямо пропорциональную вязкости. В условиях начального этапа гиперсекреции ПН слизи падает, к моменту формирования застойных явлений в синусах ПН поднимается выше нормальных показателей, причём обе ситуации отрицательно отражаются на транспортной функции МЦТС [2]. В связи с этим исследование поверхностной активности (ПА) может быть использовано для интегральной оценки состояния функции МЦТС и оценки эффективности применяемых мукоактивных препаратов.
Цель работы изучить динамику показателей поверхностной активности смывов из околоносовых пазух в условиях экспериментального острого гнойного риноси-нусита в процессе мукоактивной терапии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперимент проводили на 40 кроликах породы «Шиншилла» массой 3,0±0,5 кг, возрастом 12±3 мес., обоих полов. Острый верхнечелюстной гнойный синусит моделировали путем блока соустья и введением S. aureus 106 КОЕ/мл [7]. На следующий день после введения микробной взвеси у кролей появлялись клинические симптомы риносинусита, после чего в экспериментальных группах животных начиналось применение препаратов. Животные были разделены на 4 группы в зависимости от применяемого мукоактивного препарата: в 1-й группе (n=10) применяли N-ацетилцистеин (АЦЦ) в дозе 12,5 мг/кг в сутки на два приема. Во 2-й группе (n=10) S-карбоксиметилцистеин (КМЦ) в дозе 2,5 мг/кг в сутки, разделенной на два приема. В 3-й группе (n=10) животные получали 1,0 мл в
сутки за два приема растительный фитонирин-говый препарат (BNO-101) - «Синупрет». Все препараты использовались в жидкой форме и вводились животным per os. Четвертая группа была контрольная, её составили 10 кролей, которые мукоактивные препараты не получали.
Забор материала проводился ежедневно в течение десяти дней лечения. Промывание верхнечелюстных пазух через дренажную трубку, установленную в пазухе, 0,9% раствором хлорида натрия выполняли всем животным в течение 10 дней после момента взятия материала. Полученные смывы центрифугировались при 1200 й в течение 10 минут, для осаждения тяжёлых белковых фракций, клеточных элементов и формирование слоя надосадочной жидкости, содержащего фракции поверхностно-активных липидов.
Исследование поверхностной активности смывов проводилось методом изучения стабильности пузырьков пены в висячей капле (компьютерная реализация метода Паттла). Использовали светооптический микроскоп Olympus CX 40 с цифровой камерой Olympus C3030-ADU и программным обеспечением Olympus DP-Soft 3.2 и Cam2Com. С помощью программы Cam2Com выполнялись снимки поля зрения на увеличении х10х100 в течение 10 минут с момента формирования висячей капли с интервалом в 30 сек. В программе Olympus DP-Soft 3.2 при помощи на последнем за 10 минут снимке сначала измерялись 10 пузырьков, затем по серии промежуточных снимков прослеживалось перемещение пузырьков в поле зрения, что позволяло обнаружить их на первом снимке (рис. 1). Исследовались пузырьки среднего диаметра: 20-30 мкм и 30-40мкм. Далее вычисляли индекс стабильности (ИС) по следующей формуле: ИС=2ф10)2/2ф0)2, где D10 - диаметр пузырька в конце 10-минутного периода наблюдения, D0 - диаметр пузырька в начале наблюдения. ИС является адекватным числовым выражением ПА, позволяющим проводить её сравнительную оценку в динамике.
Статистический анализ поводили при сравнении двух линий регрессии, построение последних выполняли с использованием метода наименьших квадратов [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного исследования было установлено, что моделирование воспалительного процесса приводило к появлению клинических симптомов острого гнойного ри-носинусита: гнойных выделений из верхнечелюстной пазухи, снижению аппетита, адинамии, гипертермии. Проведенное экспериментальное лечение у всех кроликов приводило к купиро-
Рис. 1. Поле зрения висячей капли с пеной в начале и в конце периода наблюдения.
ванию острого гнойного воспаления, которое оценивалось по прекращению выделений из носа, восстановлению аппетита и активного поведения животного, отсутствия патогенном микрофлоры в контрольных посевах смывов околоносовых пазух. К 6-му дню лечения во всех группах отмечалась положительная динамика, однако затем обнаружилось отставание в клиническом улучшении 1-ой и контрольной группах. На 8-е сутки у животных этих двух групп сохранялось слизистое отделяемое в смывах, причем в 1-ой группе выделения были обильные и менее вязкие, чем в 4-ой (контрольной). На 10-е сутки лечения промывная жидкость была чистая, но у трех животных из первой группы сохранялись серозные выделения в умеренном количестве. В группе контроля у четырех животных в промывной жидкости присутствовали единичные слизистые сгустки. Контрольное микробиологическое исследование подтвердило отсутствие S. аureus в конце лечения. Гистологическое исследование биопсийного материала коррелировало с наблюдаемой клинически динамикой воспаления во всех группах лечения.
Определение индекса стабильности сино-назальных смывов показало характерную динамику в процессе лечения. Значение нормы определяли у всех животных после установки катетеров до введения микробной взвеси. ИС в норме составил 1,0062+0,0021. Значение ИС при развитии экспериментального риносину-сита в начале лечения составлял 0,6131+0,033, такой уровень показателя указывает на низкую ПА мукоцилиарной системы (табл.1). В процессе лечения зарегистрирован рост показателя, но скорость его изменения отличалась во всех группах. В 1-й группе уровень ИС достигал нормального уровня к 4-5 дню лече-
ния, затем продолжал расти и к концу лечения превышал норму на 19,21%. Во 2-ой группе на 7-й день значение ИС соответствовало уровню нормы, но к 10 дню превышало её на 9,71%. У животных в 3-ей группы нормализация ИС отмечена на 8-9 и на 10 день оставалась на уровне величины, близкой к норме, разница составила лишь 0,45%. В контрольной группе через 10 дней после моделирования процесса ИС оставался ниже нормы на 15,47% (рис.2).
Сравнительный анализ групп наблюдений для определения достоверности отличий выборок экспериментальных данных с использованием метода наименьших квадратов показал следующие коэффициенты корреляции линии регрессии №2): для 1-й группы (АЦЦ) у = 0,060x + 0,681 R2 = 0,932; для 2-й группы (КМЦ) у = 0,052x + 0,632 R2 = 0,975; для 3-й группы (BNO-101) у = 0,044x + 0,597 R2 = 0,936; для группы контроля у = 0,024x + 0,608 R2 = 0,933. В приведенных уравнениях х -дни наблюдения, у - величина ИС.
Затем, выполняли оценку достоверности отличий полученных уравнений регрессии, сравнивая по парам: группу с применением АЦЦ и КМЦ, 2-ю группу (КМЦ) с 3-ей (BNO-101), третью (BNO-101) с контрольной. Достоверность отличий соседних пар групп гарантирует достоверность отличий всех групп экспериментальных данных Анализ выполняли в соответствии с методикой описанной С. Гланцом [8]. Методика включает сравнение линии регрессии в целом, сравнение коэффициента наклона Ь и сравнение коэффициента сдвига a (см. табл. 2, 3, 4).
Таблица 1
Мониторинг индекса стабильности (ИС) при лечении экспериментального риносинусита, средние
величины в группах по дням лечения
Дни лечения 1-я группа (АЦЦ) 2-я группа (КМЦ) 3-я группа (БМО-101) 4-я(контроль)
до лечения 0,6063 0,5997 0,6297 0,6168
1 0,7071 0,6555 0,6588 0,6369
2 0,7991 0,7429 0,6673 0,6493
3 0,8793 0,8119 0,7056 0,6585
4 0,9807 0,8525 0,7241 0,6853
5 1,0473 0,9147 0,7832 0,7305
6 1,0991 0,9785 0,9033 0,7849
7 1,1495 1,0139 0,9648 0,8145
8 1,1683 1,0679 1,0025 0,8045
9 1,1837 1,0895 1,0036 0,7913
10 1,1991 1,1015 1,0017 0,8505
Рис. 2. Динамика индекса стабильности (ИС) в экспериментальных группах
Результат оценки достоверности отличий между 1-й и 2-й группами
Таблица 2
Показатели 1-я группа (АЦЦ) 2-я группа (КМЦ) Объединенная
Численность группы 10 10 20
Коэффициенты регрессии
сдвиг а 0,681918182 0,632136364 0,657027273
станд.ошибка Ба 0,031920857 0,016477865 0,025959188
наклон Ь 0,060334545 0,052272727 0,056303636
станд.ошибка БЬ 0,00539561 0,002785268 0,004387904
остаточное ст.откл. Бху 0,028821478 0,007680138 0,084716272
Бхуобщл2 0,000444831
Бхуобъедл2 0,007176847
БхувыигрЛ2 0,060588141
Б 136,204836
Бкр (0.01;меж;внутр) 6,22623528
Таблица 3
Результат оценки достоверности отличий между 2-й и 3-й группами
Показатели 2-я группа (КМЦ) 3-я группа ^N0-101) Объединенная
Численность группы 10 10 20
Коэффициенты регрессии
сдвиг а 0,632136364 0,597581818 0,614859091
станд.ошибка Ба 0,016477865 0,023005055 0,020638222
наклон Ь 0,052272727 0,044930909 0,048601818
станд.ошибка БЬ 0,002785268 0,003888564 0,003488496
остаточное ст.откл. Бху 0,007680138 0,01496972 0,053546267
Бхуобщл2 0,000141539
Бхуобъедл2 0,002867203
БхувыигрЛ2 0,024530978
Б 173,3166121
Бкр (0.01; меж; внутр) 6,22623528
Таблица 4 Результат оценки достоверности отличий между 3-й и 4-й группами
Показатели 3-я группа ^N0-101) 4-я (Контроль) Объединенная
Численность группы 10 10 20
Коэффициенты регрессии
сдвиг а 0,597581818 0,608311 0,602946364
станд.ошибка Ба 0,023005055 0,012752 0,026848435
наклон Ь 0,044930909 0,024211 0,034570909
станд.ошибка БЬ 0,003888564 0,002156 0,004538214
остаточное ст.откл. Бху 0,01496972 0,0046 0,090619694
БхуобщЛ2 0,000122626
БхуобъедЛ2 0,008211929
БхувыигрЛ2 0,072803727
Б 593,7057501
Бкр (0.01; меж; внутр) 6,22623528
Достоверность отличия 1-й и 2-й групп подтверждается тем, что критерий Фишера (Б) «выигрыша» описания групп отдельными зависимостями по сравнению с объединенной зависимостью составил 136,2, 2-й и 3-й групп Б= 173,3, между 3-й и 4-й группой Б= 593,71, что существенно превышает критическое значение критерия Фишера (Бкр) для доверительной вероятности р<0,01 (Бкр =6,226).
Таким образом, индекс стабильности пузырька пены является параметром, адекватно характеризующим поверхностную активность, а следовательно, и функциональное состояние МЦТС. Применяемый нами метод позволяет регистрировать в динамике различия в эффекте лечения с использовани-
ем различных групп препаратов, обладающих доказанным мукоактивным действием.
Полученные в результате экспериментальных исследований достоверные отличия между группами позволяют полагать, что применение ацетилцистеина целесообразно в течение первых 4-х суток от начала болезни, карбометил-цистеин - в течение не более 6-7 дней, т.к. можно ожидать развитие синдрома «затопления» слизистой оболочки. В случае течения острого риносинусита без значительного снижения поверхностной активности оптимально до 10 дней применять фитониринговый препарат БМО-Ю1.
Различия, обнаруженные в экспериментальных группах, по всей видимости, обусловлены особенностями фармакодинамики препаратов.
2016, т. 6, №2
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
Механизм действия АЦЦ связан с разрывом би-сульфидных связей кислых мукополисахаридов патологического секрета, благодаря наличию в молекуле препарата свободной сульфгидриль-ной группы. За счет этого наблюдается уменьшение вязкости секрета и улучшается работа МЦТС. В то же время, КМЦ обладает одновременно как муколитическим, так и мукорегули-рующим эффектом. Как муколитик он уменьшает вязкость и тягучесть секрета мерцательного эпителия, обеспечивая его экспекторацию, а как мукорегулятор — увеличивает синтез сиа-ломуцинов. Механизм действия карбоцистеина связан с активацией сиаловой трансферазы — фермента бокаловидных клеток слизистой оболочки дыхательных путей. Также, под действием карбоцистеина происходит регенерация слизистой оболочки, восстановление ее структуры, уменьшение /нормализация количества бокаловидных клеток. А препарат BNO-101 регулирует секрецию, нормализует вязкость слизи, устраняет мукостаз, тем самым, восстанавливая мукоцилиарный клиренс. Снижение вязкости секрета происходит за счет стимуляции секреторных клеток слизистой оболочки, вырабатывающих нейтральные мукополисахариды. Регуляция секреции осуществляется афферентным парасимпатическим путем (вагусный гастро-пульмональный рефлекс). Кроме того, препарат оказывает противоотечное и противовоспалительное воздействие на слизистую оболочку; способствует восстановлению дренажной и вентиляционной функции околоносовых пазух [9].
ВЫВОДЫ
1. Предложен метод контроля уровня поверхностной активности синоназального секрета путем компьютерной реализации метода Паттла при определении индекса стабильности, который может быть перспективным для клинического применения в качестве чувствительного теста объективного контроля качества лечения больных воспалительными заболеваниями околоносовых пазух.
2. Выявление особенности действия изученных мукоактивных препаратов позволяют обосновать целесообразность их применения в зависимости от функционального состояния мукоцилиарной транспортной системы.
3. Оценка влияния местного и центрального действия препаратов на поверхностную активность синоназального секрета показало, что применение ацетилцистеина и карбоксиметил-цистеина наиболее оптимально в начале болезни при значительном снижении поверхностной активности коротким курсом до 5 дней, а фито-ниринговый препарат BNO-101 целесообразно
использовать в случае неосложненного течения риносинусита без существенного снижения поверхностной активности в течение 10 дней, что требует дальнейших клинических исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лопатин А.С., Свистушкин В.М. Острый синусит: этиология патогенез, диагностика и принципы лечения. Клинические рекомендации. М.: 2009, 28.
2. Кобылянский В.И. Мукоцилиарная система. Фундаментальные и прикладные аспекты. М.: БИНОМ; 2008: 416.
3. Захарова Г.П., Янов Ю.К., Шабалин В.В. Мукоцилиарная система верхних дыхательных путей. СПб.: Диалог; 2010: 360.
4. Gudziol H, Blau B, Stadeler M. Investigations of nasal deposition efficiency of wheaten flour and corn starch. Laryngorhinootologie. 2009; 88(6): 398-404.
5. Ural A, Oktemer TK, Kizil Y, Ileri F, Uslu S. Impact of isotonic and hypertonic saline solutions on mucociliary activity in various nasal pathologies: clinical study. J Laryngol Otol. 2009; 123:517-521.
6. Quraishi MS, Jones NS, Mason J. The rheology of nasal mucus: a review. Clin Otolaryngol Allied Sci.1998;23:403-413.
7. Завалий М.А. Экспериментальное исследование поверхностной активности мукоцилиарной системы околоносовых пазух. Журнал ушных носовых и горловых болезней. 2005; 6: 18-22.
8. С. Гланц Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М: Практика; 1999: 459.
9. Тарасова ГД. Секретолитическое лечение при воспалении дыхательных путей в детском возрасте. Лечащий врач. 2000; 1: 35-37.
REFERENCES
1. LopatinA.S., SvistushkinV.M. Acute sinusitis: etiology, pathogenesis, diagnostics and principles of treatment. Clinical recommendations. М.: 2009: 28 p.
2. Kobylyanskiy V.I. Mucociliary system. Fundamental and application aspects^.: BINOM 2008: 416.
3. Zakharova G.P., Yanov Yu.K., Shabalin V.V. Mucociliary system of the upper respiratory tract. SPb.: Dialog; 2010: 360.
4. Gudziol H, Blau B, Stadeler M. Investigations of nasal deposition efficiency of wheaten flour and corn starch. Laryngorhinootologie. 2009; 88(6): 398-404.
5. Ural A, Oktemer TK, Kizil Y, Ileri F, Uslu S. Impact of isotonic and hypertonic saline solutions on mucociliary activity in various nasal pathologies: clinical study. J Laryngol Otol. 2009;123: 517-521.
6. Quraishi MS, Jones NS, Mason J. The rheology of nasal mucus: a review. Clin Otolaryngol Allied Sci.1998; 23: 403-413.
7. Zavalii M.A.Experimentalinvestigationofthesurfacea ctivityofthemucociliarysystemof the paranasal sinuses. The Journal of the Ear, Nose and Throat Diseases. 2005; 6: 1822.
8. S. Glantz. Primer of B i o s t a t i s t i c s . Translated from English. М.: Praktika; 1999: 459.
9. Tarasova G.D.Secretolytic treatment of the respiratory tract inflammation in children. Attending Physician. 2000; 1: 35-37.
