CC BY
16в
еегникАПК ,„ ,
Животноводство
№ 3(35), 2019
25
УДК 591.151:636.32/.38.082.13
DOI: 10.31279/2222-9345-2019-8-35-25-29
М. И. Селионова, Д. А. Ковалев, Л. Н. Скорых, Н. С. Сафонова, Н. И. Ефимова
Selionova M. I., Kovalev D. A., Skorykh L. N., Safonova N. S., Efimova N. I.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ГОРМОНА РОСТА, ЛЕПТИНА У ОВЕЦ ПОРОДЫ СОВЕТСКИЙ МЕРИНОС
RESEARCH OF GROWTH HORMONE, LEPTIN GENE POLYMORPHISM IN SPEEP OF SOVIET MERINO BREED
В настоящее время значительный интерес представляют разработка и освоение маркерной селекции (Marker Assisted Selection - MAS), основанной на использовании ДНК-маркеров, ассоциированных с уровнем проявления признаков продуктивности. Наибольшие успехи в этом направлении достигнуты в молочном скотоводстве. Выявлено значительное число генов, ассоциированных с молочной продуктивностью и качеством молока. В овцеводстве такие исследования получили развитие лишь в последнее время. При этом приоритет отдается изучению генов, контролирующих мясную продуктивность, в связи с возрастающим интересом к производству молодой баранины и ягнятины. В качестве потенциальных маркеров мясной продуктивности овец рассматриваются аллели генов соматотропина (GH) и лептина (LEP). Однако изучение генов соматотропи-на, лептина у овец отечественных пород ранее не выполнялось, в то время как у овец импортной селекции этому вопросу посвящено большое количество исследований. В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение полиморфизма генов GH и LEP у овец породы советский меринос, разводимой в Ставропольском крае. Анализ полиморфизма генов соматотропина, лептина проводили методом ПЦР и капиллярного секвенирования по Сэнгеру. Секвенирование генов GH, LEP позволило выявить точечные мутации в структуре генома овец породы советский меринос. Выявлено, что полиморфизм гена GH представлен двумя аллелями - С и Т с частотой встречаемости 70,0 и 30,0 % соответственно. В исследуемом полиморфизме гена LEP, представленном двумя аллелями G и T, установлена высокая частота встречаемости аллеля G (73 %), но низкая - аллеля T (27 %). Полученные результаты в процессе проведения исследований свидетельствуют об установлении разнообразия аллельных вариантов генов соматотро-пина, лептина у овец породы советский меринос.
Ключевые слова: соматотропин, лептин, секвениро-вание, SNP, советский меринос.
At present, the development and mastering of marker selection (Marker Assisted Selection, MAS), based on the use of DNA markers associated with the level of productivity traits manifestation is acquiring considerable interest. The greatest successes in this direction have been achieved in dairy cattle breeding. It is revealed a significant number of genes associated with milk productiwity and milk quality. In sheep breeding, such studies have been developed only recently. At the same time, priority is given to the study of genes controlling meat productivity in connection with the growing interest in the production of young mutton and lamb meat. Alleles of somatotropin (GH) and leptin (LEP) genes are considered as potential markers of sheep meat productivity. However, the study of somatotropin, leptin genes in sheep of domestic breeds has not previously been carried out, while in sheep of import selection a large amount of research has been devoted to this issue. In this regard, the purpose of this research was to study the polymorphism of the GH and LEP genes in sheep of the Soviet merino breed bred in the Stavropol Territory. Analysis of somatotropin, leptin gene polymorphism was performed by PCR and capillary sequencing methods according to Sanger. Sequencing of the GH and LEP genes made it possible to identify point mutations in the structure of the Soviet merino sheep genome. It was revealed that the polymorphism of the GH gene is represented by two alleles, C and T, with occurrence frequency of 70.0 % and 30.0 % respectively. In the studied polymorphism of the LEP gene, represented by two alleles (G and T), a high occurrence frequency of the allele G (73 %) was established, but a low frequency of the allele T (27 %) was found. The results obtained in the process of research indicate the establishment of the allelic variants diversity of somatotropin and leptin genes in the Soviet merino sheep breed.
Key words: somatotropin, leptin, sequencing, SNP, Soviet merino.
Селионова Марина Ивановна -
доктор биологических наук, профессор РАН, директор Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства
ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный научный
аграрный центр»
г. Михайловск
РИНЦ SPIN-код: 4408-9865
Тел.: 8(8652)37-10-39
E-mail: [email protected]
Ковалев Дмитрий Анатольевич -
кандидат химических наук,
заведующий лабораторией биохимии
ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский
противочумный институт Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека»
г. Ставрополь
РИНЦ SPIN-код: 6678-2528
Тел.: 8(8652)26-03-12
E-mail: [email protected]
Selionova Marina Ivanovna -
Doctor of Biological Sciences, Professor of the Russian Academy of Sciences, Director of the All-Russian Research Institute of Sheep Breeding and Goat Breeding
FSBSI «North Caucasus Federal Agrarian Research Center» Mikhaylovsk
RSCI SPIN-сodе: 4408-9865 Tel.: 8(8652)37-10-39 E-mail: [email protected]
Kovalev Dmitry Anatolyevich -
Ph.D of Chemical Sciences, Head of Laboratory of Biochemistry
FGIH «Stavropol Plague Control
Research Institute of the Federal Service
for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights
Protection and Human Welfare»
Stavropol
RSCI SPIN-code: 6678-2528 Tel.: 8(8652)26-03-12 E-mail: [email protected]
26
,,„ „„„,„,„,„„,„„. Jj Ставрополья
научно-практическии журнал
Скорых Лариса Николаевна -
доктор биологических наук, доцент, ведущий
научныхй сотрудник отдела овцеводства
ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный научный
аграрный центр»
г. Михайловск
РИНЦ SPIN-код: 8979-4755
Тел.: 8(8652)71-81-55
E-mail: [email protected]
Сафонова Надежда Сергеевна -
аспирант отдела овцеводства
ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный научный
аграрный центр»
г. Михайловск
РИНЦ SPIN-код: 1043-7760
Тел.: 8-918-750-72-21
E-mail: [email protected]
Ефимова Нина Ивановна -
кандидат сельскохозяйственных наук,
ведущий научный сотрудник отдела овцеводства
ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный научный
аграрный центр»
г. Михайловск
Тел.: 8(8652)71-95-58
E-mail: [email protected]
На современном этапе развития животноводства повышается интерес к технологиям, основанным на использовании ДНК-маркеров [1]. Наиболее значимым направлением практической генетики является маркер-ассоциированная селекция (Marker Assisted Selection, MAS), которая находит все большее применение в национальных селекционных программах большинства стран с развитым животноводством [2]. Значительные успехи в этом направлении достигнуты в овцеводстве ряда зарубежных стран. Так, крупнейшие производители баранины, а именно Австралия, Новая Зеландия, активно реализуют программы по маркер-ориентированной и геномной селекции [3]. На сегодняшний день продолжается работа по идентификации генов, связанных с продуктивными качествами овец. При этом наибольший интерес проявляется к генетическим маркерам, взаимосвязанным с генами (генами-кандидатами), белковый продукт которых выполняет существенную роль в формировании или регуляции физиолого-биохимических процессов [4]. В качестве потенциальных маркеров продуктивности овец могут рассматриваться аллели генов соматотропина (GH) и лептина (LEP).
Ген гормона роста (соматотропин, сомато-тропный гормон, GH) - один из перспективных генов-кандидатов, контролирующих синтез белка, имеющего молекулярную массу около 22000, состоящего из полипептидной цепи 191 аминокислотного остатка). Ген GH обладает широким спектром биологического действия и оказывает влияние на все клетки организма. Он активизирует анаболические процессы, сопровождающиеся увеличением массы тела, стимуляцией роста скелета. Кроме того, он координирует и регулирует скорость протекания
Skorykh Larisa Nikolayevna -
Doctor of Biological Sciences, Associate Professor, Leading Researcher of the Department of Sheep Breeding FSBSI «North Caucasus Federal Agrarian Research Center» Mikhaylovsk
RSCI SPIN-code: 8979-4755 Tеl.: 8(8652)71-81-55 E-mail: [email protected]
Safonova Nadezhda Sergeevna -
Postgraduate Student of the Department of Sheep Breeding
FSBSI «North Caucasus Federal Agrarian Research Center» Mikhaylovsk
RSCI SPIN-code: 1043-7760 Tel.: 8-918-750-72-21 E-mail: [email protected]
Efimova Nina Ivanovna -
Ph.D of Agricultural Sciences, Leading Researcher
of the Department of Sheep Breeding
FSBSI «North Caucasus Federal Agrarian Research
Center»
Mikhaylovsk
Tеl.: 8(8652)71-95-58
E-mail: [email protected]
обменных процессов [5]. Полученные экспериментальные данные на животных свидетельствуют о том, что суперэкспрессия гена GH способствует ускоренному росту и развитию их организма [6].
Одним из гормонов, ответственных за регуляцию жирового обмена, является лептин (СЕР) - это белковый гормон, образуемый преимущественно адипоцитами. Ген СЕР состоит из трех экзонов и двух интронов. Он играет значительную роль в биологических процессах, таких как регулирование воспроизводства и иммунной реакции. Выявлена связь между отдельным нуклеотидным полиморфизмом в гене лептина с ростом склетных мышц и качеством мяса у овец пород дорсет и суффолк [7].
Однако полиморфизм генов соматотропи-на, лептина у овец отечественных пород находится только на стадии изучения, в то время как у овец импортной селекции этому вопросу уделяется существенное внимание.
Вышеизложенное явилось основанием к изучению полиморфизма генов соматотропи-на ^Н), лептина (ЬЕР) у овец породы советский меринос.
Экспериментальная часть исследований проводились в условиях СПК колхоза-племза-вода им. Ленина Арзгирского района Ставропольского края. Лабораторные исследования проводили на базе ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора. Объектом исследования являлся молодняк овец (ярки) породы советский меринос. Отбор генетического материала осуществлялся у молодняка овец в возрасте 4 месяцев, численностью 30 голов. В качестве биоматериала для проведения ДНК-генотипирования у животных использовалась кровь. Генетический анализ осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и капиллярного секвенирования по Сэнгеру.
в
естник АПК
Ставрополья
№ 3(35), 2019
Животноводство
27
Выделение ДНК проводили методом нуклео-сорбции с использованием сертифицированного набора «ДНК сорб-В» (ИнтерЛабСервис, Россия). Для постановки ПЦР использовали реагенты производства «ИнтерЛабСервис» (Россия): смесь дНТФ, воск для ПЦР 15 % (температура плавления 37 °С), ПЦР-смесь-2 red
(2,5-кратный ПЦР-буфер, крезоловый красный, 5,5 мМ MgCl2). Олигонуклеотидные праймеры для амплификации участков генов LEP [8], GH [9] представлены в таблице 1.
Амплификацию проводили на термоциклере планшетного типа («Bio-Rad», США), используя условия, указанные в таблице 2.
Таблица 1 - Последовательность олигонуклеотидных праймеров для амплификации участков
генов лептина (LEP), соматотропина (GH)
Ген Праймер Длина фрагмента, п.н.
LEP/ BcnI, SsiI и OliI F: 5'- AGGAAGCACCTCTACGCTC -3', R: 5'- CTTCAAGGCTTCAGCACC -3' 471
GH/ HaeIII F: 5'-GAAACCTCCTTCCTCGCCC-3' R: 5'- CCAGGGTCTAGGAAGCCACA-3' 365
Таблица 2 - Условия проведения амплификации для генов GH и LEP
Этап GH LEP
t, °С Время Кол-во циклов t, °С Время Кол-во циклов
Удержание температуры 94 5 мин 1 94 5 мин 1
Циклирование 95 30 сек 35 94 30 сек 35
65 30 сек 59 30 сек
72 45 сек 72 30 сек
Завершающая элонгация 72 5 мин 1 72 5 мин 1
Размер полученных ампликонов определяли с помощью набора «Комплект реагентов для электрофоретической детекции в агароз-ном геле» и ДНК-маркера молекулярного веса 50 п.н. («ИнтерЛабСервис», Россия). Очистку ПЦР-продуктов осуществляли с помощью набора реагентов Agencourt AMPure XP («Beckman Coulter Inc», США). Реакцию секвенирования проводили с использованием набора реагентов BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit в соответствии с инструкцией производителя. Продукты реакции очищали преципитацией 75 %-ным изо-пропиловым спиртом. Секвенирование осуществляли с использованием генетического анализатора ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer.
В процессе проведения молекулярно-гене-тических исследований у овец породы советский меринос выявлены аллельные варианты генов соматотропина и лептина.
Таблица 3 - Частота аллелей и генотипов гена GH овец породы советский меринос
SNP позиция Размер амплико-на, п.н. Генотип, % Аллель, %
СС СГ TT C T
C 321 T (HaeIII) 365 53,3 33,3 13,4 70 30
Выявлено, что полиморфизм гена GH представлен двумя аллелями - С и Т, с высокой частотой встречаемости аллеля С (70,0 %) и низкой - аллеля Т (30,0 %) у овец породы советский меринос. Выявленная закономерность отразилась в частоте встречаемости гомозиготных (СС, ТТ) генотипов, составившей 53,3; 13,4 % соответственно, гетерозиготных (СТ) - 33,3 %.
Рисунок 1 - Фрагмент секвенограммы, включающий ЭЫР в экзоне 3 гена GH у овец
породы советский меринос
28
,,„ „„„,„,„,„„,„„. Jj Ставрополья
научно-практическии журнал
Рисунок 2 - Фрагмент секвенограммы, включающий ЭЫР в экзоне 3 гена LEP у овец
породы советский меринос
Таблица 4 - Частота аллелей и генотипов гена LEP овец породы советский меринос
SNP позиция Размер амплико-на, п.н. Генотип, % Аллель, %
GG GT TT G T
G 387 T (OliI) 471 73,3 26,7 0 73 27
G 271 A (BcnI) 471 Был обнаружен только один геновариант (СС)
A 316 C (Ssil) 471 Был обнаружен только один геновариант (СС)
В исследуемом полиморфизме гена LEP, представленном двумя аллелями О и Т, установлена
высокая частота встречаемости аллеля О (73,0 %), но низкая частота встречаемости аллеля Т (27,0 %). Распределение частот генотипов выявило отсутствие гомозиготного варианта ТТ и выразилось в следующем: гомозиготный (ОО) генотип составил 73,3 % и гетерозиготный (ОТ) вариант - 26,7 %.
Полученные результаты свидетельствуют об установлении разнообразия аллельных вариантов генов соматотропина (ОН), лептина ^ЕР) у овец породы советский меринос.
Таким образом, возрастает интерес к поиску генов-кандидатов, маркирующих мясную продуктивность у овец. В этой связи гены сомато-тропин, лептин перспективны для дальнейшего изучения у разных пород.
Литература
1. Биотехнологические методы изучения полиморфизма гена гормона роста / Ю. А. Колосов, Н. В. Кобыляцкий, П. С. Широкова, Л. В. Гетманцева, Н. Ф. Бакоев // Дальневосточный аграрный вестник. 2017. Т. 2, № 42. С. 82-86.
2. Генетические маркеры мясной продуктивности овец (ovisariesl.). Сообщение I. Мио-статин, кальпаин, кальпастатин / В. И. Тру-хачев, М. И. Селионова, А. Ю. Криворучко, А. М. Айбазов // Сельскохозяйственная биология. 2018. Т. 53, № 6. С. 1107-1119.
3. Factors influencing the efficiency of a marker-assisted introgression programme in Merino sheep / S. Dominik, J. Henshall, J. O'grady, K. Marshall // Genetics, selection, evolution: GSE. BioMed Central. 2007. Vol. 39, № 5. P. 495-511.
4. Polymorphism of the GDF9 Gene in Russian Sheep Breeds / Yu. A. Kolosov, L. V. Getmantseva, N. V. Shirockova [et al.] // Cytol. & Histol. 2015. 6:305. DOI: 10.4172/21577099.1000305
5. Effect of GH gene polymorphisms on biometric traits in Makooeisheep / A. Hajihosseinlo, A. Semsarnejad, E. Abollow [et al.] // Ann. Biol. Res. 2013. 4(6):351-355.
6. Effect of ovine growth hormone transgenesis on performance of Merino sheep at pasture / L. R. Piper, A. M. Bell, K. A. Ward,
References
1. Biotechnological methods for studying the growth hormone polymorphism gene / Yu. A. Kolosov, N. V. Kobylyatsky, P. S. Shirokova, L. V. Getmantseva, N. F. Bakoev // Far Eastern Agrarian Bulletin. 2017. Vol. 2, № 42. P. 82-86.
2. Genetic markers of sheep meat productivity (ovisariesl.). Report I. Myostatin, Calpain, Calpastatin / V. I. Trukhachev, M. I. Selionova, A. Ya. Krivoruchko, A. M. Aybazov // Agricultural Biology. 2018. Vol. 53, № 6. P. 1107-1119.
3. Factors influencing the efficiency of a marker-assisted introgression programme in Merino sheep / S. Dominik, J. Henshall, J. O'grady, K. Marshall // Genetics, selection, evolution: GSE. BioMed Central. 2007. Vol. 39, № 5. P. 495-511.
4. Polymorphism of the GDF9 Gene in Russian Sheep Breeds / Yu. A. Kolosov, L. V. Getmantseva, N. V. Shirockova [et al.] // Cytol. & Histol. 2015. 6:305. DOI: 10.4172/21577099.1000305
5. Effect of GH gene polymorphisms on biometric traits in Makooeisheep / A. Hajihosseinlo, A. Semsarnejad, E. Abollow [et al.] // Ann. Biol. Res. 2013. 4(6):351-355.
6. Effect of ovine growth hormone transgenesis on performance of Merino sheep at pasture / L. R. Piper, A. M. Bell, K. A. Ward,
в
естник АПК
Ставрополья
№ 3(35), 2019
Животноводство
B. W. Brown // Growth and wool traits to 12 months of age. Proc. Assoc. Adv. Anim. Breed. Gen. 2001;14:257-260.
7. Detection of polymorphisms in the ovine leptin (LEP) gene: association of single nucleotide polymorphism with muscle growth and meat quality traits / D. Boucher, M. F. Palin, F. Castonguay, C. Gariepy, F. Pothier // Can. J. Anim. Sci. 2006. 86:31-35.
8. Polymorphism of the exon 3 of leptin gene in Malpura sheep / A. S. Meena, R. S. Bhatt, А. Sahoo, S. Kumar // Indian J. Anim. Res. 2017. 51 (3):469-473.
9. OthmanPolymorphism of growth hormonegene and its association with wool traits in Egyptian sheep breeds / Ibrahim M. Farag, Ahmed M. Darwish, Hassan R. Darwish, K. B. Abdel Aziz, W. A. Ramadan, M. I. Mohamed, E. Othman // African Journal of Biotechnology. 2016. Vol. 15 (14). P. 549-556.
29
B. W. Brown // Growth and wool traits to 12 months of age. Proc. Assoc. Adv. Anim. Breed. Gen. 2001;14:257-260.
7. Detection of polymorphisms in the ovine leptin (LEP) gene: association of single nucleotide polymorphism with muscle growth and meat quality traits / D. Boucher, M. F. Palin, F. Castonguay, C. Gariepy, F. Pothier // Can. J. Anim. Sci. 2006. 86:31-35.
8. Polymorphism of the exon 3 of leptin gene in Malpura sheep / A. S. Meena, R. S. Bhatt, А. Sahoo, S. Kumar // Indian J. Anim. Res. 2017. 51 (3):469-473.
9. Othman Polymorphism ofgrowthhormone gene and its association with wool traits in Egyptian sheep breeds / Ibrahim M. Farag, Ahmed M. Darwish, Hassan R. Darwish, K. B. Abdel Aziz, W. A. Ramadan, M. I. Mohamed, E. Othman // African Journal of Biotechnology. 2016. Vol. 15 (14). P. 549-556.
