CC BY
60
formance / Xiaoyan Zhang [et al.] // Journal of Animal Science. 2020. Vol. 98. P. 5-7. 12. Association between MspI calpastatin gene polymorphisms, growth performance, and meat characteristics of Awassi sheep / Khaleel I Jawasreh [et al.] // Indian Journal of Animal Sciences. 2017. Vol. 87 (5). P. 635-639.
Суховеева Ангелина Владимировна, младший научный сотрудник лаборатории геномной селекции и репродуктивной криобиологии в животноводстве ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ», г. Ставрополь, [email protected]
Sukhoveeva Angelina Vladimirovna, Junior Researcher of_Genomic Selection and Reproductive Cryobiology in Animal Breeding Laboratory, Federal State Budgetary Scientific Institution "North Caucasus FARC", Stavropol, [email protected]
DOI 10.25930/2687-1254/014.5.13.2020 УДК 591.151:636.32/.38.082.13
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ СОМАТОТРОПИНА И КАЛЬПАСТАТИНА
И.О. Фоминова, Л.Н. Скорых, Д.В. Коваленко
Возрастающая заинтересованность к технологиям, основанным на использовании ДНК-маркеров, вполне обоснована верификацией связи генов-кандидатов и значимых селекционных признаков. Данные технологии успешно применяются в национальных селекционных программах многих стран с развитым животноводством. При этом существенных успехов в данном направлении добились в мясном скотоводстве. Выявлены гены, ассоциированные с количественно- качественными показателями говядины от мясных пород скота. Однако в овцеводстве такие изыскания получили развитие лишь в последнее время. В связи с современным ростом производства баранины, отмечающимся во всем мире, связано увеличение доли специализированных мясных пород и возрастающие требования к мясной продуктивности для мясо-шерстных и шерстных овец. Изыскиваются ассоциированные с показателями мясной продуктивности гены-кандидаты для их использования в селекции.
В роли потенциальных маркеров мясной продуктивности овец могут выступать аллели генов кальпастатина (CAST) и гормона роста (GH). В связи с этим целью наших исследований явилось изучение полиморфизма генов GH и CAST у мясо-шерстных овец генотипа / полл дорсет х / северокавказская мясо-шерстная, разводимых в условиях Ставропольского края. Анализ полиморфизма генов соматотропина и кальпастатина проводили методом ПЦР-ПДРФ Полиморфизм гена кальпастатина представлен двумя аллелями - M и N. При этом определена высокая частота встречаемости аллеля M (0,94) и достаточно низкая - аллеля N (0,06). В исследуемом полиморфизме гена GH, представленном также двумя аллелями - А и В, выявлена несущественная разница в частоте встречаемости. Полученные результаты исследований указывают на разнообразие аллельных вариантов гена GH и гена CAST у мясо-шерстных овец.
Ключевые слова: овцы, полиморфизм, генотип, соматотропин, кальпастатин.
BIOTECHNOLOGICAL METHODS OF STUDYING GENE POLYMORPHISM OF SOMATOTROPIN AND CALPASTATIN
I.O. Fominova, L.N. Skorykh, D.V. Kovalenko
The growing interest in technologies based on the use of DNA markers is fully justified by the verification of the association between candidate genes and significant selective breeding traits. These technologies are successfully used in national selective breeding programs in many countries with developed livestock breeding. Thus, significant success in this field has been achieved in beef breeding. There was identification of genes which were associated with the quantitative and qualitative indicators of beef meat breeds. However, in sheep breeding, such kind of research is recent. As a result of the modern growth of worldwide mutton production, there is an increase in the share of specialized meat breeds. In addition, one can observe the increasing requirements for meat productivity of mutton-wool sheep. Candidate genes associated with such parameters are being searched for their use in selective breeding. Alleles in calpastatin gene (CAST) and growth hormone (GH) can be potential markers of sheep meat productivity. In this regard, the purpose of our research was to study the gene polymorphism of GH and CAST in mutton-wool sheep of the / Poll Dorset x / North Caucasian meat and wool genotype, which were bred in the Stavropol Territory. The analysis of the gene polymorphism of somatotropin and calpastatin was performed by PCR-RFLP method. The gene polymorphism of calpastatin was represented by two alleles, M and N. Thus, there was determined a high frequency of occurrence of the M allele (0.94) and a rather low frequency of the N allele (0.06). In the studied gene polymorphism of GH, represented by two alleles A and B, there was insignificant difference in the frequency of occurrence. The obtained results of the research demonstrate a variety of allelic variations of GH and CAST genes in mutton-wool sheep.
Key words: sheep, polymorphism, genotype, somatotropin, calpastatin.
Введение. Все большую популярность на современном этапе развития животноводства приобретают технологии, базирующиеся на применении ДНК-маркеров, ассоциированных с уровнем проявления продуктивных качеств [1]. В качестве значимого направления практической генетики важно отметить маркер-ассоциированную селекцию, обретающую более широкое применение в национальных селекционных программах большей части стран с развитым животноводством. Изыскание генов, ассоциированных с мясной продуктивностью животных, развивалось слегка медленнее, однако в этом направлении достигнуты значительные результаты. В таких странах, как Европа, Америка, Австралия, используется тестирование по генам, ассоциированным с количественно- качественными признаками говядины от специализированных пород мясного скота - миостатина (MSTN), кальпастин-кальпаинового каскада (CAPN1, CAST), лептина (LEP), ростового дифференцирующего фактора (GDF5) и другие [2].
Однако в овцеводстве подобные исследования приобрели развитие лишь в последнее время. В связи с этим приоритет уделяется изысканию генов, контролирующих мясную продуктивность, так как повышается интерес к производству молодой баранины и ягнятины [3, 4]. В странах Австралия и Новая Зеландия, являющихся крупнейшими производителями баранины, широкую популярность приобретают программы по маркер-ориентированной и геномной селекциям [5].
Безусловно, в большей степени проявляется внимание к генетическим маркерам, взаимосвязанным с генами-кандидатами, белковые продукты которых осуществляют ключевые позиции в создании и управлении физиолого-биохимических процессов [6].
Наибольший интерес представляют полиморфизм гена кальпастатина (CAST) и гена гормона роста (GH).
Кальпастатин (CAST) - эндогенный белковый ингибитор кальпаина (кальций-зависимой протеазы цистеина), играет основную роль в естественной тендеризации мышечных волокон. Нежность мяса является одним из самых важных потребительских качеств и комплексным признаком, на который влияет множество факторов [7]. После убоя процессы, происходящие в мясе, играют главную роль для этого признака. В результате прекращения насыщения мышечных клеток кислородом в мясе запускаются метаболические процессы при анаэробных условиях, тем самым происходит снижение уровня АТФ в мышечных клетках. В данных условиях в мышечной ткани формируются поперечные мостики актомиозина, приводящие к окоченению и повышению плотности мяса. После завершения стадии окоченения начинается стадия естественной тендериза-ции мяса и увеличение его нежности.
Проведенные исследования у овец позволили выявить связь полиморфных вариантов гена CAST с нежностью мяса при созревании после проведения убоя. Одним из рассматриваемых вариантов полиморфности является олигонуклеатидная замена G/A в гене кальпастатина (CAST) [8].
Соматотропин -полипептидный гормон, выделяемый передней долей гипофиза, оказывающий анаболическое и антикатаболическое действия. Он осуществляет обеспечение регуляции белкового обмена, стимуляцию синтеза белка, тормозит его распад, вызывает снижение отложения подкожного жира, повышение соотношения мышечной массы к жировой [9].
Действие гормона роста на органы и ткани осуществляется непосредственно, однако существенная часть его эффектов происходит по средствам инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1), вырабатывающегося под действием соматотропина в печени и усиливает развитие внутренних органов [10].
Таким образом, уровень экспрессии гена гормона роста и кальпастатина оказывает значительное влияние на биологические процессы, рост и развитие организма животного, что дает основание рассматривать их как маркеры мясной продуктивности и качества мяса.
Вышеизложенное дало основание к исследованию полиморфизма гена кальпас-татина (CAST) и гена гормона роста (GH) у мясо-шерстных овец, разводимых в условиях Ставропольского края.
Материал и методы исследований. Работа осуществлялась на территории опытной станции ВНИИОК - филиала ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ», расположенной в пос. Цимлянский Шпаковского района Ставропольского края. Молекулярно-генетические исследования выполнялись в лаборатории иммуногенетики и ДНК-технологий ВНИИОК - филиала ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ». Объектом исследований являлся молодняк численностью 91 голова мясо-шерстных овец генотипа V полл дорсет х V северокавказская мясо-шерстная (V ПД х V СК).
Отбор генетического материала проводили у ягнят в одномесячном возрасте. Биоматериалом для проведения ДНК-генотипирования у ярок служила венозная кровь. Выделение ДНК проделывали с помощью набора реагентов «DIAtom tmDNAPrep» (IsoGeneLab, г. Москва) в соответствии с прилагаемой инструкцией.
Определение фрагментов гена CAST и GH делали методом ПЦР-ПДРФ. Амплификация генов кальпастатина (CAST) и (GH) гормона роста выполнялась на наборах GenPakPCRCore (IsoGeneLab, г. Москва) на четырехканальном амплификаторе «Тер-цик», г. Москва. В качестве праймеров применялись следующие нуклеотидные последовательности: для амплификации участков гена кальпастатина (CAST) - F:5'-TGGGGCCCAATGACGCCATCGATG-3', R:5'-GGTGGAGCAGCACTTCTGATCACC-3'(ампликационный фрагмент - 622 п. н.); для амплификации участков гена гормона роста (GH) - F: 5'-GAAACCTCCTTCCTCGCCC - 3', R: 5'-CCAGGGTCTAGGAAGCCACA - 3' (ампликационный фрагмент - 934 п. н.).
Условия проведения амплификации были следующими: для гена кальпастатина (CAST): денатурация - 95 °С 4 мин.), далее 35 циклов - 95 °С, 62 °С и 72 °С (по 45 сек.), элонгация - при 72 °С (7 мин.); для гена GH: денатурация - 95 °С (5 мин.), далее 33 цикла - 95 °С, 60 °С и 72 °С (по 45 сек.), элонгация - 72 °С (10 мин.). Рестрикцию амплифицированных фрагментов осуществляли с помощью набора реагентов эндо-нуклеаз MspI/CAST и HaeIII/GH согласно инструкции производителя фермента (ООО «СибЭнзим», г. Москва). Амплификаты расщепляли рестрикцией CAST (MspI) и GH (HaeIII) (ООО «СибЭнзим», г. Москва) в соответствии с инструкцией производителя фермента, анализировали методом электрофореза в 2% и 4% агарозном геле в присутствии бромистого этидия.
Результаты исследований и их обсуждение. Полученные результаты молеку-лярно-генетических исследований у животных свидетельствуют о наличии аллельных вариантов генов кальпастатина (CAST) и гормона роста (GH). Полиморфизм гена каль-пастатина представлен двумя аллелями - M и N. При этом обнаружена достаточно высокая частота аллеля M, составившая 0,94, но значительно низкая (0,06) - аллеля N. В исследуемом полиморфизме гена соматотропина (GH), также представленном двумя аллелями - А и В, определена незначительная разница в частоте встречаемости, составившая 0,51 и 0,49.
Установлены генотипы кальпастатина и соматотропина, представленные следующими фрагментами: CAST 336-, 286- п.н. (генотип MM), 622, 336-, 286- п.н. (генотип MN), 662- п.н. (генотип NN); GH 277-, 256-, 202-, 110-, 100-, 94-, 68-, 49-, 22-, 21-, 8-, 4-п.н. (генотип АВ); 256-, 202-, 110-, 100-, 94-, 68-, 49-, 22-, 21-, 8-, 4- п.н. (генотип ВВ); 277-, 202-, 110-, 100-, 94-, 68-, 49-, 22-, 8-, 4- п.н. (генотип АА).
Анализ полученных результатов по гену CAST в популяции мясо-шерстных овец представлен следующими генотипами: MM, MN, с различной частотой встречаемости. Частота встречаемости генотипов гена CAST распределилась следующим образом: гомозиготный вариант MM составил 87,9%, гетерозиготный генотип MN - 12,1% от общего числа типированных животных. Гомозиготный генотип NN отсутствовал у животных данной популяции.
При исследовании полиморфизма гена GH у исследуемых животных обнаружены три генотипа - АА, АВ и ВВ - также с различной частотой встречаемости. Установлено, что наибольшее количество животных имели гетерозиготный генотип АВ -42,8%, частота встречаемости гомозиготных вариантов АА и ВВ составила 29,7% и 27,5%.
Заключение. Результаты молекулярно-генетических исследований у мясо-шерстных овец генотипа / полл дорсет х / северокавказская мясо-шерстная подтверждают наличие полиморфизма генов CAST и GH. Полученные результаты указывают на разнообразие аллельных вариантов генов кальпастатина и гормона роста.
Литература
1. Исследование полиморфизма генов гормона роста, лептина у овец породы советский меринос / М.И. Селионова, Д.А. Ковалев, Л.Н. Скорых, Н.С. Сафонова, Н.И. Ефимова // Вестник АПК Ставрополья, 2019. № 3 (35). С. 25-29.
2. Генетические маркеры мясной продуктивности овец (ovisariesl.). Сообщение I. Миостатин, кальпаин, кальпастатин / В.И. Трухачев, М.И. Селионова, А.Ю. Криворучко, А.-М.М. Айбазов // Сельскохозяйственная биология, 2018. Т. 53. № 6. С. 1107-1119.
3. Копылов И.А., Скорых Л.Н., Ефимова Н.И. Мясность молодняка овец породы советский меринос и их помесей с австралийскими баранами / И.А. Копылов // Овцы, козы, шерстяное дело, 2017. № 2. С. 26-27.
4. Using genetic markers in breeding sheep / D.Y. Degtyarev, L.N. Skorykh, D.V. Kovalenko, S.A. Emelyanov, N.V. Konik // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 2016. Т. 7. № 4. С. 2137-2139.
5. Геномная селекция в овцеводстве / М.И. Селионова, Л.Н. Скорых, И.О. Фоминова, Н.С. Сафонова // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства, 2017. Т. 1. № 10. - С. 275-280.
6. Features of polymorphism of calpastatin and somatotropin genes in young sheep, obtained from crossing ewes of Kalmyk fat-rumped sheeps and dorper rams / Vladimir Pogodaev, Bator Aduchiev, Lydia Kononova, Maya Aslanukova and Irina Kardanova // E3S Web of Conferences 175, 03020 (2020) intergromash, 2020.
7. Погодаев В.А., Кононова Л.В., Адучиев Б.К. Полиморфизм генов кальпастатина и соматотропина у овец калмыцкой курдючной породы и помесей (^ калмыцкая курдючная + ^ дорпер) /В.А. Погодаев // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, 2019. № 3 (47). С.141-145.
8. Методы ПЦР-ПДРФ генов CAST, IGFBP-3 и GDF9 в исследовании овец тувинской короткожирнохвостой породы / Ю.А. Юлдашбаев, К.А. Куликова, М.И. Донгак, С.А. Хататаев, Л.А. Калашникова, Я.А. Хабибрахманова, И.Ю. Павлова // Изв. Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2018. № 2. С. 153-163.
9. Генетические маркеры в мясном овцеводстве / А.В. Дейкин, М.И. Селионова, А.Ю. Криворучко и др. // Вавиловский журнал генетики и селекции, 2016. Т. 20. № 5. С. 576-583.
10. Effect of ovine growth hormone transgenesis on performance of Merino sheep at pasture / L. R. Piper, A. M. Bell, K. A. Ward, B. W. Brown // Growth and wool traits to 12 months of age. Proc. Assoc. Adv. Anim. Breed. Gen. 2001; 14: 257-260.
Фоминова Ирина Олеговна, соискатель лаборатории иммуногенетики и ДНК-технологий ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный научный аграрный центр», 355017, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 15, е-mail: [email protected]
Скорых Лариса Николаевна, доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник отдела овцеводства, ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный научный аграрный центр», 355017, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 15, 8(8652)71-81-55, е-mail: [email protected]
Коваленко Дмитрий Вадимович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела овцеводства, ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный
научный аграрный центр», 355017, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 15, тел. 8(8652)71-57-55, е-mail: [email protected]
Fominova Irina Olegovna - Degree-Seeking Student of the Immunogenetics and DNA Technologies Laboratory of the Federal State Budgetary Scientific Institution "North Caucasus FARC", 355017 Stavropol, Zootechnichesky Ln., 15, e-mail: [email protected]
Skorykh Larisa Nikolaevna - Doctor of Biological Sciences, Associate Professor, Leading Researcher of the Sheep Breeding Department, Federal State Budgetary Scientific Institution "North Caucasus FARC", 355017 Stavropol, Zootechnichesky Ln., 15, tel. 8 (8652) 71-81-55, e-mail: [email protected]
Kovalenko Dmitry Vadimovich - Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher of the Sheep Breeding Department, Federal State Budgetary Scientific Institution "North Caucasus FARC", 355017, Stavropol, Zootechnichesky Ln., 15, tel. 8 (8652) 71-5755, e-mail: [email protected]
DOI 10.25930/2687-1254/015.5.13.2020 УДК 616.314.17
СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ НИОСОМАЛЬНЫХ ВЕЗИКУЛ
ВН. Шахова
Таргетность - явление, при котором распределение лекарственного средства в организме происходит таким образом, что основная его часть взаимодействует с тканью -мишенью на клеточном или субклеточном уровне для достижения желаемого фармакологического эффекта на выбранном участке без нежелательных взаимодействий в других органах. Это может быть достигнуто с использованием системы доставки лекарств, такой как ниосомы. Они представляют собой везикулы (50-800 нм), состоящие из двойного слоя неионного сурфактанта, часто дополнительно содержащие холестерин или его производные. Структура ниосом позволяет инкапсулировать в них как гидрофильные, так и липофильные соединения, при этом гидрофильный агент располагается во внутреннем водном пространстве, а липофильный - внутри бислоя. Свойства данных везикул могут варьировать в зависимости от размера, ламеллярности и заряда поверхности. В качестве системы доставки ниосомы обладают некоторыми преимуществами перед классическими липосомами: имеют большее время полужизни, просты в получении и легко подвергаются модификациям, обладают высокой совместимостью с биологическими системами и низкой токсичностью благодаря своей неионной природе, неиммуногенны и подвергаются биодеградации. Кроме того, ниосомы практически не распознаются ретикулоэндотелиальной системой. Ниосомы являются перспективными средствами доставки лекарств. Они рассматриваются как способ целенаправленной доставки действующего вещества и возможности контролируемого высвобождения лекарственных препаратов в терапии онкологии, аутоиммунных заболеваний, вирусных и других инфекционных заболеваний. Инкапсуляция лекарственного средства в везикулярную систему продлевает его присутствие в системном кровообращении и повышает возможность проникновения в ткань-мишень, снижает токсичность.
Ключевые слова: ниосомы, везикулы, таргетность, холестерин, дисперсия, проникновение, ткань-мишень.
