CC BY
59УДК 675.001.5+616.314-089.843
Рожко П.Д.,
к. мед. н.,
Одесский национальный медицинский университет
Деньга О.В., д. мед. н., Вербицкая Т.Г.
к. биол. н.
Государственное учреждение «Институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии НАМН Украины»
DOI: 10.24411/2520-6990-2020-12039 ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ COL1A1 -1997G/T, MMP1-1607INSG, MMP9 A-8202G, TIMP1C536T У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА, НАПРАВЛЕННЫХ
НА ДЕНТАЛЬНУЮ ИМПЛАНТАЦИЮ
Rozhko P.D.,
candidate of medical Sciences Odessa National Medical University Denga O. V., doctor of medicine Verbitskaya T.G. candidate of medical Sciences
State Establishment« The Institute of Stomatology and Maxillo-Facial Surgery National Academy of Medical Science of Ukraine»
STUDY OF COL1A1 -1997G / T, MMP1-1607INSG, MMP9 A-8202G, TIMP1C536T GENES POLYMORPHISM IN PATIENTS WITH 2 TYPE DIABETES PLANNED FOR DENTAL
IMPLANTATION
Аннотация.
Было проведено изучение генетического полиморфизма генов Col1A1 -1997G/T, MMP1-1607insG, MMP9 A-8202G, TIMP1C536Tу пациентов с сахарным диабетом 2 типа, требующих ортопедического лечения с использованием дентальных имплантатов. Полученные результаты определили группы «риска». 9 % составляли пациенты с функционально неполноценным аллелем Т полиморфизма -1997G/T гена Col1A1. Функционально неполноценные аллели генов ММР1-1607insG и ММР9 A-8202G были выявлены у 31,8% и 54,5% пациентов. Среди обследованных пациентов не было выявлено полиморфизма C536T гена TIMP-1. Аллельный полиморфизм генов необходимо учитывать в процессе предимплантационной подготовки пациентов с сахарным диабетом для проведения адекватной терапии.
Abstract
Genetic polymorphism of the Col1A1 -1997G / T, MMP1 -1607insG, MMP9 A-8202G, TIMP1C536T genes was studied in patients with type 2 diabetes mellitus requiring dental treatment using implantation. Results determined the risk groups. 9% were patients with a functionally defective T allele of -1997G / T polymorphism of the Col1A1 gene. Functionally defective alleles of the MMP1-1607insG and MMP9 A-8202G genes were detected in 31.8% and 54.5% ofpatients. Among the examined patients, no TIMP-1 C536T polymorphism was detected. Allelic polymorphism of genes must be taken into account during the preimplantation preparation of patients with diabetes mellitus in order to conduct adequate therapy.
Keywords: molecular genetic studies, diabetes mellitus, dental implantation.
Ключевые слова: молекулярно-генетические исследования, сахарный диабет, дентальная имплантация.
Дентальная имплантология в настоящее время его успешной остеоинтеграции. Затем первостепен-
является одним из наиболее перспективных ное значение приобретает процесс адекватного ре-
направлений стоматологии. Развитие дентальной моделирования кости. Именно эти процессы обес-
имплантации открывает ряд новых возможностей в печивает долговременную стабильность имплан-
ортопедической стоматологии и челюстно-лицевой тата.
хирургии. Однако, при планировании дентальной Ремоделирование представляет собой тонкое
имплантации необходимо учитывать наличие абсо- равновесие между формированием и деградацией
лютных и относительных противопоказаний [1]. В тканей, контролируемое активностью протеолити-
первых рядах среди факторов риска и относитель- ческих ферментов. Анализ влияния сахарного диа-
ных противопоказаний к оперативным вмешатель- бета на остеоинтеграцию имплантата выявил изме-
ствам, в том числе к дентальной имплантации, нение процессов ремоделирования кости и недоста-
стоит сахарный диабет [2]. «Выживаемость» ден- точную её минерализацию, что приводит к
тального имплантата в первую очередь зависит от замедлению процесса остеоинтеграции [3].
Для улучшения клинического результата или разработки целевой терапии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа важно понимать молекулярные механизмы, которые приводят к отторжению зубного имплантата.
Генетическую основу предрасположенности к долговечности зубных имплантатов составляют сложные взаимодействия между генами коллагенов, ферментами металлопротеиназ и тканевыми ингибиторами, фенотипические эффекты которых в процессе остеоинтеграции могут реализоваться по-разному у пациентов.
Целью исследования являлось изучение генетического полиморфизма генов Col1A1-1997G/T, MMP 1-1607insG, MMP9 A-8202G, TIMP1C536T у пациентов с сахарным диабетом 2 типа, требующих ортопедического лечения с использованием дентальных имплантатов.
Материалы и методы. Для молекулярно-ге-нетического анализа использовали образцы геномной ДНК пациентов с сахарным диабетом 2 типа, направленных на дентальную имплантацию. Выделение ДНК из клеток буккального эпителия пациентов проводили по модифицированной методике с Chelex [4]. Aллельные варианты генов коллагена 1 типа COL1A1 -1997G/T, матричных металлопротеиназ MMP1 -1607insG, MMP9A-8202G, ингибитора протеиназTIMP1 C536T оценивали методом аллель специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) (наборы «SNP-экспресс-ЭФ» НПФ «Литех», Россия). Амплификацию проводили на термоциклерe CFX96 (Bio-Rad). Ампликоны визуализовали методом электрофореза в 2 %-м агарозном геле.
Результаты их обсуждение. Ген COL1A1 кодирует аминокислотную последовательность
Таблица
Частота встречаемости аллелей и генотипов генов коллагена 1 типа Col1A1 -1997G/T, матричных
альфа-1-цепь белка коллагена 1 типа. Коллаген 1 типа является основной составной частью органической матрицы костной ткани (90 %) и соединительной ткани (30 %). Он придаёт механическую прочность и выполняет морфогенетическую функцию, влияя на рост, миграцию и дифференцировку клеток, определяет их секреторную и синтетическую активность.
На образцах ДНК пациентов с СД 2 типа было проведено исследование полиморфизма (-1997G/T) в промоторной области гена коллагена 1 типа COL1A1 (табл.). Установлено, что среди обследованных пациентов по полиморфизму G/T гена COL1A1 преобладают гомозиготы по аллели G (91%). Гомозиготный генотит G/G выявлен у 81,9% пациентов.18,1% составляют пациенты с гетерозиготным генотипом G/T. Гомозиготный минорный генотип Т/Т в данной выборке пациентов не присутствует. Увеличение уровня транскрипции гена COL1A1, вызванное полиморфизмом (-1997G/T) регуляторной области, приводит к изменению соотношения альфа 1 и альфа 2 цепей коллагена. Это вызывает дезорганизацию межклеточного мат-рикса и инициирует процесс прогрессивного снижения минеральной плотности костной ткани [5]. Наиболее выражено это проявляется у гомозиготных носителей минорного генотипа, который среди исследованных пациентов не выявлен. Но даже наличие одной функционально неполноценной аллели Т у гетерозигот также приводит, хотя в меньшей степени, к нарушение нормального соотношения субъединиц в молекуле коллагена I типа, что нарушает функции коллагена.
Аллель, генотип COL1A1 -1997G/T, Аллель, генотип MMP1 -16G7insG Аллель, генотип MMP9 A-2G2G Аллель, генотип TIMP1 C536T
n=11(%) n=11(%) n=11 (%) n=11(%)
G 2G(91) G 15(68,2) A 1G(45.5) С 22(1GG)
T 2(9) 2G 7(31,8) G 12(54,5) Т G
G/G 9(81,8) G/G 6(54,5) A/A 2(18,2 C/C 11(1GG)
G/T 2(18,2) G/2G 3(27,3) A/G 6(54,5) С/Т G
T/T G 2G/2G 2(18,2) G/G 3(27,3) Т/Т G
У пациентов с сахарным диабетом 2 типа процесс образования костной ткани обычно угнетается. Присутствие глюкозы вызывает образование промежуточных продуктов, содержащих высокореактивные дикарбонилы, что в конечном итоге приводит к необратимому накоплению соединений конечных продуктов позднего гликирования, скопления которых определяют образование дефектных коллагенов и активных форм кислорода, вызывая структурные изменения в кости посредством посттрансляционных модификаций [6, 7].
Риск и степень потери альвеолярной кости положительно коррелирует с отсутствием гликемиче-ского контроля. Однако, если лечить гипергликемию и поддерживать уровень глюкозы, близкий к нормальному, то имплантаты будут интегрироваться с большей скоростью в области с преобладанием кортикальной кости [8].
В нашем исследовании молекулярно -генетическое тестирование пациентов c сахарным диабетом 2 типа, требующих ортопедического лечения с использованием дентальных имплантатов, определило группу «риска» с функционально неполноценным аллелем Т полиморфизма -1997G/T гена Col1A1.
Среди молекул, вовлеченных в ремоделирова-ние костной ткани, важную роль играют ферменты из группы матриксных металлопротеиназ (MMPs). ММР представляют собой семейство цинк- и кальций-зависимых эндопептидаз, ферментов, которые отвечают за разложение компонентов внеклеточного матрикса, таких как коллаген, протеогликаны, ламинин, эластин и фибронектин. Они играют центральную роль в ремоделировании периодонталь-ной связки как в физиологических, так и в патологических условиях. Они секретируются в виде зи-могенов (про-MMPs), которые активируются различными протеиназами. ММР1-коллагеназа ответственна за деградацию коллагена I, II и III типа, ММР9-желатиназа -за деградацию коллагена IV, V типов, а также эластина, фибронектина, ламинина и денатурированного коллагена (желатина).
Генотипирование обследованных пациентов показало, что функциональные аллели металлопротеиназ ММР1-1607insG и ММР9 A-8202G составляют 68,2% и 45,5% соответственно. Минорный аллель 2G ММР1выявлен у 31,8% пациентов. Минорный аллель G гена ММР9 представлен у 54,5%. Гомозиготный генотип-2G/2G и гетерозиготный G/2G гена ММР1 составляют 18,2% и 27,3%. 54,5% пациентов имеют функционально полноценный генотип G/G. Функциональный генотип АА -820 гена ММР9 представлен лишь у 18,2% обследованных пациентов. Функционально неполноценные генотипы составляют 27,3% для гомозиготного GG и 54,5% для гетерозиготного варианта АG полиморфизма A-8202G гена MMP9 (табл. 1).
Введение гуанина в положение -1607 гена ММР-1 человека создает аллель 2G, который, как показано, увеличивает транскрипционную активность, изменяет минеральную плотность кости и может влиять на процесс остеоинтеграции [9].
Было показано, что аллель 2G (вставка гуанина в положение -1607 в области промотора человеческой матричной металлопротеназы 1 ММР-1) присутствовал у 50% пациентов с ранней потерей остеоинтегрированных оральных имплантатов, т.е. данный полиморфизм может быть использован в качестве генетического маркера «неудачных» имплантатов [10].
ММР-9 участвует в процессах воспаления, ре-моделирования ткани, заживления ран, мобилизации матрикс-связанных факторов роста и процес-синге цитокинов. У больных со сниженной МПК (остеопения или остеопороз) достоверно чаще выявлялся аллель G в полиморфной позиции -1562 гена MMP9 ДО=1,92, p=0,007) [11]. Полиморфизмы в генах MMP в значительной степени связаны с рядом патологий зубов и костей, и их присутствие в периимплантной жидкости может спровоцировать заболевание периимплантата с дальнейшей потерей костной массы. Обычно эти ферменты экспрессируются в очень небольших количествах и их транскрипция регулируется как в положительную, так и в отрицательную сторону гормонами, цитокинами и факторами роста. Регуляция активности MMP очень важна в процессах ремоделирования ткани и при воспалении.
В условиях избытка глюкозы эндотелиальные клетки и макрофаги человека вырабатывают большее количество ММР [12]. Было показано, что сывороточные уровни MMP1 диабетических пациентов достоверно выше, чем у индивидуумов с нормальным метаболизмом глюкозы. Анализ распределения генотипов у диабетических пациентов выявил ассоциированность генотипа 2G2G с высоким уровнем MMP1[13], что приводит к усиленной деградации фибриллярного коллагена.
Гиперпродукция ММР-9 на фоне сахарного диабета 2 была установлена у больных с хроническим генерализованным пародонтитом (ХГП) [14]. Воспаление оказывает критическое влияние на остеоинтеграцию и успех имплантации. Высокий уровень ММР-9 в раневой жидкости свидетельствует о воспалении и является маркером плохого заживления ран при сахарном диабете [15].
Регуляция активности ферментов на посттрансляционном уровне осуществляется группой эндогенных белков, называемых тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (TIMP) [16]. Т1МР-1 играет роль в регуляции активных форм MMP-1, ММР-3 и ММР-9 благодаря способности образовывать комплекс с про-ММР-9, блокируя активацию фермента.
Среди обследованных пациентов с сахарным диабетом 2 типа не было выявлено полиморфизма C536T гена TIMP-1. По данным литературы частота полиморфизма C536T гена TIMP-1 незначительна.
На целостность соединительных тканей, окружающих зубные имплантаты, влияет баланс между MMP и TIMP1. TIMP1 конститутивно экспрессиру-ется на низком уровне во многих тканях, но в условиях воспаления и повреждения тканей экспрессия Т1МР-1 обычно увеличивается по сравнению со здоровой тканью. В работе [17] была исследована
концентрация TIMP-1 в десневой кревикулярной (щелевой) жидкости у больных с СД 2 типа. Концентрация TIMP-1 у пациентов с СД были сходны с аналогичными показателями у пациентов с гингивитом I хроническим генерализованным паро-донтитом без СД, поэтому было сделано предположение, что СД не оказывает существенного влияния на концентрацию TIMP-1 в десневой кревикулярной жидкости.
Наличие генетического полиморфизма определяет предрасположенность к увеличению транскрипционной активности ферментов, изменению минеральной плотности кости, развитию воспалительных осложнений, усугубляющиеся наличием сахарного диабета, что может повлиять на процесс остеоинтеграции.
Выводы. Молекулярно-генетическое тестирование полиморфизма генов Col1A1 -1997G/T, MMP1-1607insG, MMP9 A-8202G, TIMP1C536T пациентов c сахарным диабетом 2 типа, требующих ортопедического лечения с использованием дентальных имплантатов определило группы «риска»;
- 9% составляют пациенты с функционально неполноценным аллелем Т полиморфизма -1997GIT гена Col1A1;
- Функционально неполноценные аллели генов ММР1-1607insG и ММР9 A-8202G выявлены у 31,8% и 54,5% пациентов соответственно. Среди обследованных пациентов с сахарным диабетом 2 типа не выявлено полиморфизма C536T генаТШР-1;
- Aллельный полиморфизм генов необходимо учитывать в процессе предимплантационной подготовки пациентов с сахарным диабетом для проведения адекватной терапии.
Список литературы
1. Тунева H.A., Богачева Н.В., Тунева Ю.О. Проблемы дентальной имплантации II Вятский медицинский вестник. - 2019. - №2(62). - С. 86-93.
2. Никитин В.С., Капитонова О.П., Aнтонова И.Н. Особенности дентальной имплантации у пациентов с сахарным диабетом II Трансляционная медицина. - 2015. - №2(6). - С. 25-31.
3. Кузнецов С.В. Дентальная имплантация у пациентов с соматической патологией: автореф. дис. на соискание ученой степени к. мед. н.: спец. 14.01.22 «Стоматология» I С.В. Кузнецов. -Москва, 2009 - 26c.
4. Sean Walsh, David A. Metzger, Russell Higu-chi. Chelex 100 as a Medium for Simple Extraction of DNA for PCR-Based Typing from Forensic Material // BioTechniques. - 2013. - Vol.54. - No.3. - P. 134139.
5. Базилевская Е.М., Якубова И.Ш., Топанова A.A. Оценка генетической предрасположенности молодых жителей г. Санкт-Петербурга к заболеваниям, связанным с нарушением обмена кальция II Клинические и экспериментальные исследования. -2014. - №3(52). - С. 96-101.
6. Napoli N. The alliance of mesenchymal stem cells, bone, and diabetes / N. Napoli, R. Strollo, A. Pal-adini, SI. Briganti, P. Pozzilli, S. Epstein // Int J Endocrinol. - 2014;2014:690783. doi:10.1155/2014/690783.]
7. Strollo R. HLA-dependent autoantibodies against post-translationally modified collagen type II in type 1 diabetes mellitus / R. Strollo, P. Rizzo, M. Spole-tini, R. Landy, C. Hughes, F. Ponchel, N. Napoli, A. Palermo, R. Buzzetti, P. Pozzilli, A. Nissim // Diabeto-logia. - 2013. - 56(3). - Р. 563-572. doi: 10.1007/s00125-012-2780-1.
8. Pavya G, Babu N. A. Effect of Diabetes in Os-seointegration of Dental Implant - A Review // Biomed Pharmacol J. - 2015. - №8 (October Spl Edition). Available from: http ://biomedpharmaj ournal.org/?p=3 593>
9. Yamada Y. Association of a poly-morphism of the matrix metalloproteinase-1 gene with bonemin-eral density / Y. Yamada, F. Ando, N. Niino, H. Shimo-kata // Matrix Biology. - 2002. - №21. - С. 389-392.
10. Shilin HE1; Peng XU; Shi BAI. The relationship between MMP-1 genetic polymorphisms and dental implant early failure in Chinese Han nationality Chongqing Medicine. - 2017. - №46(5). - Р. 635-637.
11. Фазуллина О.Н., Шевченко А.В., Прокофьев В.Ф., Коненков В.И Ассоциации полиморфизмов генов цитокинов и матриксных металлопроте-иназ с минеральной плотностью костной ткани у женщин в постменопаузе с сахарным диабетом 2 типа // Сахарный диабет. - 2018. - №21(1). - С.26-33.
12. Blakytny R, Jude E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. - 2006. - №23(6). - Р. 594-608.
13. Drzewoski J, Sliwinska A, Przybylowska K, et al. Gene polymorphisms and antigen levels of matrix metalloproteinase-1 in type 2 diabetes mellitus coexisting with coronary heart disease // Kardiol Pol. - 2008. - V.66(10). -P. 1042-1049.
14. Голицына А.А., Югай Ю.В., Чагина Е.А., Первов Ю.Ю., Романчук А.Л. Сравнительный анализ системы метталопротеиназ и их тканевых ингибиторов при пародонтите у пациентов с сахарным диабетом II типа // Российский иммунологический журнал. - 2018. - T.12(3). - C. 247-254.
15. Liu Y, Min D, Bolton T, Nubé V, Twigg SM, Yue DK, et al. Increased Matrix Metalloproteinase-9 Predicts Poor Wound Healing in Diabetic Foot Ulcers. Diabetes Care. - 2009. - №32(1). - Р. 117-119.
16. Visse R. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemitry / R. Visse, H. Nagase // Circulation Res. - 2003. - N 2. - P. 827-839.
17. Karde§ler L. Crevicular fluid matrix metallo-proteinase-8,-13, and TIMP1 levels in type 2 diabetics / L. Kardesler, B. Biyikoglu, S. Cetinkalp, M. Pitkala, T. Sorsa, N. Buduneli // Oral. Dis. — 2010. - Vol. 16 (5). - Р. 476-481.
