CC BY
30
Раздел - молекулярная медицина
Исследование острой токсичности пептидного соединения MM-D37K на мышах и крысах
Кулинич Т.М., Большакова О.Б., Джикия Е.Л., Шишкин А.М., Иванов А.В., Боженко В.К. ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, 117997 Москва, ул. Профсоюзная, 86 Сведения об авторах
Кулинич Татьяна Михайловна - к.м.н., заведующая лабораторией иммунологии и онкоцитологии
Большакова Оксана Борисовна - младший научный сотрудник лаборатории клеточной и генной терапии
Джикия Екатерина Левановна - к.б.н., научный сотрудник лаборатории иммунологии и онкоцитологии
Шишкин Александр Михайлович - к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории иммунологии и онкоцитологии
Иванов Андрей Валерьевич - к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории иммунологии и онкоцитологии
Боженко Владимир Константинович - д.м.н., профессор, заведующий отделом молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей Контактное лицо
Кулинич Татьяна Михайловна, e-mail: [email protected] Резюме
Оценка острой токсичности является необходимым этапом доклинических исследований лекарственных препаратов. Цель настоящей работы - изучение острой токсичности и
определение максимальной толерантной дозы пептидного препарата MM-D37K при разных способах введения у самцов и самок мышей линии CD-1 и крыс линии SD. Методы. MM-D37K вводили однократно; были исследованы внутрибрюшинное, внутривенное, подкожное и пероральное (per os) введение. Дозы при пероральном введении составили от 5 до 1500 мг/кг, при внутрибрюшинном, внутривенном и, подкожном способах введения на мышах дозы составляли от 5 до 350 мг/кг, на крысах от 5 до 500 мг/кг. Животным контрольных групп вводили по 1 мл 1% раствора крахмала. Оценивали клиническую картину, признаки интоксикации и гибель животных. Эвтаназию и патологоанатомическое вскрытие проводили через 14 суток после введения пептидного препарата.
Результаты. Показано, что пептидный препарат MM-D37K у половозрелых мышей и крыс обоих полов при разных способах введения и однократном применении не влияет на потребление воды и корма, не оказывает влияния на гематологические, биохимические параметры крови. Различий между самками и самцами в действии исследуемого препарата не зарегистрировано. Зарегистрировано местно-раздражающее действие при внутрибрюшинном и подкожном введении. Проведенное исследование позволило установить токсические концентрации MM-D37K, которые существенно выше действующих терапевтических доз разрабатываемого ЛС, что позволяет планирование дальнейших исследований и выход на клинические исследования предлагаемого нового противоопухолевого препарата.
Ключевые слова: острая токсичность, безопасность лекарственных средств, интернализуемые пептиды, ингибиторы циклиновых киназ
Финансирование
Исследование выполнено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 20-015-00068/21).
Research of acute toxicity of the MM-D37K peptide compound in mice and rats
Kulinich T.M., Bolchakova O.B., Dzhikiya E.L., Shishkin A.M. Ivanov A.V., Bozhenko V.K. Federal State Budgetary Institution "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation (RSCRR), Moscow 117997, Profsoyuznaya, 86 Authors
Kulinich T.M. - PhD, M.D., Head of the Laboratory of Immunology and Oncocytology Bolchakova O.B. - junior researcher at the Laboratory of Cell and Gene Therapy Dzhikiya E.L. - PhD, researcher of the Laboratory of Immunology and Oncocytology Shishkin A.M. - PhD, researcher of the Laboratory of Immunology and Oncocytology Ivanov A.V. - PhD, senior researcher of the Laboratory of Immunology and Oncocytology Bozhenko V.K. - PhD, Professor of medicine, Head of the Department of Molecular Biology and Experimental Tumor Therapy
Address for correspondence
Kulinich Tatiana Mikhailovna, e-mail: [email protected] Summary
Acute toxicity studies are a necessary stage of preclinical studies of drugs. The purpose of this work is to study acute toxicity and to determine the maximum tolerant dose of the peptide drug MM-D37K, with different methods of administration in male and female mice of the CD-1 line and rats SD.
Methods. MM-D37K was administered once; intraperitoneal, intravenous, subcutaneous and oral (per os) administration were investigated. Doses for oral administration ranged from 5 to 1500 mg / kg, with intraperitoneal, intravenous and subcutaneous methods of administration, doses ranged in mice from 5 to 350 mg/kg, in rats from 5 to 500 mg/kg. Control animals were injected with 1 ml of 1% starch solution. The clinical picture, signs of intoxication and death of animals were evaluated.
Euthanasia and pathoanatomic autopsy were performed 14 days after the administration of the peptide drug.
Results. The peptide preparation MM-D37K in mature mice and rats of both sexes did not affect the consumption of water and feed, as well as the hematological and biochemical parameters of blood. This phenomenon was shown for different methods of administration and single use. There were no differences between females and males and in the effect of the studied drug. A local irritant effect has been registered with intraperitoneal and subcutaneous administration. The study made it possible to establish the toxic concentrations of MM-D37K, which are significantly higher than the effective therapeutic doses of the drug being developed. This allows planning of further studies and access to clinical trials of the proposed new antitumor drug.
Key words: acute toxicity, drug safety, cyclin dependent kinase inhibitors, internalized peptides (cell penetrating peptides, CPP)
Введение
В ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России с 2000 г. ведутся работы по изучению противоопухолевых свойств пептидных конструкций, включающих интернализуемые фрагменты, обеспечивающие эффективное внутриклеточное проникновение и функциональные группы - различные ингибиторы пролиферативной активности [1 - 3]. Разработано и синтезировано пептидное соединение (MM-D37K), представляющее собой пептидную последовательность, несущую в качестве функционального вектора фрагмент p16INK4a и интернализуемую часть (СРР) - последовательность pAntp. Вся конструкция включает в себя 37 аминокислотных остатка: H-Asp-Ala-Ala-Arg-Glu-Gly-Phe-Leu-Asp-Thr-Leu-Val-Val-Leu-His-Arg-Ala-Gly-Ala-Arg-Ser-Arg-Gin-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH, и имеет формулу - C20iH326N66O49S [4].
В фармакологических экспериментах in vitro и in vivo соединение продемонстрировало выраженное противоопухолевое действие в отношении опухолевых
клеток различной локализации. Показано, что внесение MM-D37K в культуры активно пролиферирующих клеток линий А549 (аденокарцинома легкого человека), НТ29 и HCT116 (колоректальный рак, человек) приводит цитостатическому и цитотоксическому эффекту, вызывая торможение роста и гибель опухолевых клеток [1, 5]. Проведение экспериментальных исследований по оценке эффективности разработанной последовательности в экспериментах на животных показало, что разработанный потенциальный лекарственный препарат способен замедлять рост перевивных опухолей и увеличивать продолжительность жизни животных.
Обязательной процедурой комплекса доклинических исследований является исследование острой токсичности и безопасности потенциальных лекарственных средств, что послужило основой для проведения данного исследования. Цель исследования
Целью настоящего исследования стало определение максимальной толерантной дозы вещества MM-D37K, потенциального противоопухолевого лекарственного средства, при внутрибрюшинном, внутривенном, подкожном и пероральном (per os) способах введениях у самцов и самок мышей линии CD-1 и крыс линии SD. Материалы и методы
Исследование проведено в соответствии с Федеральным законом от 12.04.2010 № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств»; ГОСТ 53434-2009 от 02.12.2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики GLP»; «Методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» [6 - 8]. Протокол исследования рассмотрен и исследование одобрено комитетом по биомедицинской этике ФГБУ "Российский научный центр рентгенорадиологии" Минздрава России (Протокол № 11 от 26.11.20).
В качестве тест-системы были использованы белые беспородные мыши и крысы обоего пола. Выбор животных обусловлен высокой степенью гомологии белков р16, CDK4 и
CDK6 у человека и других животных, в частности мышей и крыс. В ходе данного исследования было использовано: 192 мыши (96 самцов, 96 самок) и 144 крысы (72 самца, 72 самки). Аутбредные мыши линии CD-1 были получены из НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН, г. Пущино. Возраст к моменту начала исследований составлял 10 недель, вес животных - 30±4,2 г самки, 38±6,4 г самцы. Аутбредные белые крысы (SD) были получены из питомника «Рапполово», Всеволожский р-н, д. Рапполово, Ленинградская обл. Возраст к моменту начала исследований составил 3 месяца, вес тела: 200±18,5 г и 300±20,6 г для самок и самцов соответственно. Животные, участвующие в исследовании, содержались в виварии в соответствии с ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Работы с мышами и крысами выполняли в соответствии с общепринятыми нормами обращения с животными на основе стандартных операционных процедур, принятых в ФГУН «Институт токсикологии» ФМБА России, соответствующих правилам Европейской Конвенции ETS 123.
Все животные были специально разведены и ранее не участвовали в исследованиях. Производитель животных предоставил данные последнего контроля здоровья животных, подтверждающие их SPF-статус (животные, свободные от патогенов). Прибывшие животные до начала исследования были помещены в отдельную комнату содержания на период адаптации при групповом содержании в клетках. Во время этого периода у животных контролировали состояние их здоровья, отклонений обнаружено не было.
В экспериментах использовали пептидную последовательность MM-D37K в виде готовой лекарственной формы - лиофилизат для приготовления инфузий. Субстанцию растворяли в воде для инъекций. В качестве контрольного вещества использовалась крахмальная взвесь, растворенная в воде. Использовалось пероральное, подкожное и внутривенное введение, так как эти способы аналогичны планируемым способам использования лекарственного препарата в клинической практике. Как альтернативный путь на грызунах было использовано внутрибрюшинное введение.
При исследовании острой токсичности на мышах и крысах при пероральном введении (Per os) были использованы следующие дозы MM-D37K: 5, 10, 100, 500, 1500 мг/кг (Таблица 1). При исследовании острой токсичности на мышах при внутрибрюшинном, внутривенном и подкожном введении были использованы следующие дозы MM-D37K: 5, 10, 100, 150, 350 мг/кг (Таблица 2). При исследовании острой токсичности на крысах при внутрибрюшинном, внутривенном и подкожном введении были использованы следующие дозы MM-D37K: 5, 10, 100, 150, 500 мг/кг (Таблица 2). Лекарственную форму в виде суспензии вводили однократно мышам и крысам обоего пола в объёме 10 мл/кг. Индивидуальный объем вводимой дозы для каждого животного рассчитывался исходя из значения массы тела, и корректировался после каждого взвешивания. Введение осуществлялось однократно. Однократное подкожное и внутрибрюшинное введение препарата MM-D37K самкам и самцам мышей и крыс осуществляли с использованием стерильных одноразовых шприцев и игл (0,6*25мм).
Общая продолжительность наблюдения за всеми экспериментальными и контрольными животными составляла 14 суток. Первые 8 часов после введения препарата каждое животное находилось в индивидуальной, прозрачной, пластиковой камере и было доступно для непрерывного визуального наблюдения. Для регистрации нежелательных явлений, вызванных острой токсичностью препарата, в течение первого часа после первого введения исследуемого препарата, а также в течение всего 14-дневного периода наблюдения, проводился клинический осмотр каждого животного. В ходе исследования у животных регистрировали клинические признаки отклонений в состоянии здоровья, вес тела и потребление корма.
Через 8 часов все животные перемещались в клетки группового содержания. В последующие сутки для выявления возможной гибели, а также для регистрации общего состояния и поведения животных клетки осматривались ежедневно утром и вечером. В течение эксперимента фиксировали массу тела животных и суточное потребление корма и воды. Массу тела животных определяли перед введением исследуемого лекарственного
средства, первую неделю ежедневно, в дальнейшем — один раз в неделю. Суточное потребление корма и воды животными фиксировали до введения соединения, в первые, седьмые и четырнадцатые сутки и определяли суммарно по группе (клетке) посредством взвешивания оставшегося в кормушке корма и определения объёма выпитой из поилки воды (накануне фиксировали исходные значения показателей массы, корма и объёма воды).
На 14-е сутки после однократного введения MM-D37K или крахмальной взвеси, животные экспериментальных и контрольных групп были выведены из эксперимента, способом дислокации шейных позвонков, в соответствии с ГОСТом [9, 10]. После эвтаназии было проведено взвешивание и патологоанатомическое вскрытие животных с осмотром макроповреждений органов. Дозы и группы
Животных распределяли по группам, используя в качестве критерия массу тела. Начальная
масса тела была одинаковой в каждой группе, и индивидуальная масса животных не
отличалась более чем на 20% от средней массы животных (Таблицы 1, 2).
Таблица 1. Схема исследования острой токсичности пептидного препарата MM-D37K при пероральном введении (Per os)
Номер Кол-во животных (n) Исследуемое вещество Доза Объем введения (мл/кг) День
группы (мг/кг) эвтаназий
Мыши 1 8 (4 & 4$) MM-D37K 5
2 8 (4 & 4$) MM-D37K 10
3 8 (4 &; 4$) MM-D37K 100
4 8 (4 &; 4$) MM-D37K 500 10 На 14 день
5 8 (4 &; 4$) MM-D37K 1500
6 8 (4 &; 4$) крахмальная взвесь
Крысы 1 6 (3 &; 3$) MM-D37K 5
2 6 (3 &; 3$) MM-D37K 10
3 6 (3 &; 3$) MM-D37K 100
4 6 (3 &; 3$) MM-D37K 500 10 На 14 день
5 6 (3 &; 3$) MM-D37K 1500
6 6 (3 &; 3$) крахмальная
взвесь
Таблица 2. Схема исследования острой токсичности пептидного препарата MM-D37K при подкожном, внутривенном и внутрибрюшинном способе введения
Номер группы Подкожное введение/внутривен ное/ внутрибрюшинное Кол-во животных (П) Исследуемо е вещество Доза мг/кг Объем введени я (мл/кг) День эвтанази й
Мыши 1 пк/1вв/1вб 8 (4 & 4?) MM-D37K 5
2 пк/2вв/2вб 8 (4 4?) MM-D37K 10
3 пк/3вв/3вб 8 (4 4?) MM-D37K 100 На 14 день
4пк/4вв/4вб 8 (4 4?) MM-D37K 150 10
5пк/5вв/5вб 8 (4 4?) MM-D37K 350
6пк/6вв/6вб 8 (4 4?) крахмальная взвесь
Крыс 1 пк/1вв/1вб 6 (3 3?) MM-D37K 5
ы 2 пк/2вв/2вб 6 (3 3?) MM-D37K 10
3 пк/3вв/3вб 6 (3 3?) MM-D37K 100 На 14 день
4пк/4вв/4вб 6 (3 3?) MM-D37K 500 10
5пк/5вв/5вб 6 (3 3?) MM-D37K 1500
6пк/6вв/6вб 6 (3 3?) крахмальная взвесь
Результаты Пероральное введение
В результате наблюдений после однократного перорального введения у мышей и крыс на малых дозах препарата (5, 10, 100 мг/кг) клинических проявлений интоксикации не отмечалось в течение всего периода наблюдения. На больших дозах (500 мг/кг) у 2-х мышей (25%) наблюдалась гиподинамия в течение 2 -3 часов после введения. При дозе 1500 мг/кг у 4 мышей (50%) в течение часа наблюдалась гиподинамия, далее состояние нормализовалось. В остальное время животные опытных групп по поведению и внешнему виду не отличались от контрольных. Гибели животных после перорального введения лекарственного средства MM-D37K зарегистрировано не было. Местно-раздражающего действия и половых различий не зафиксировано.
Крысы опытных групп по поведению и внешнему виду не отличались от контрольных. Местно-раздражающего действия и половых различий не зарегистрировано. Ежедневные клинические осмотры животных не выявили какие-либо симптомы
интоксикации ни в одной из групп при пероральном введении потенциального ЛС. Наблюдение за динамикой массы и прироста массы тела мышей и крыс после перорального введения лекарственного препарата MM-D37K в дозах 5, 10, 100, 500, 1500 мг/кг не выявило значимых отличий между экспериментальными и контрольной группами животных. Внутрибрюшинное введение
При введении доз 100-350 мг/кг через 1-3 минуты у всех мышей наблюдались гиподинамия, одышка и проходящая параплегия (в течение первого дня наблюдения мыши при передвижении тянули задние лапки). На вторые сутки состояние нормализовалось. На меньших дозах признаки интоксикации не отмечались. На протяжении оставшихся 12 дней наблюдения животные опытных групп по поведению и внешнему виду не отличались от контрольных. Гибели животных и местно-раздражающего действия зарегистрировано не было.
При введении крысам доз 100-500 мг/кг через 1-3 минуты у всех крыс наблюдалась гиподинамия, одышка. На вторые сутки состояние нормализовалось. На меньших дозах признаки интоксикации не отмечались. На протяжении оставшихся 12 дней наблюдения животные опытных групп по поведению и внешнему виду не отличались от контрольных. На 3-5 день после введения в месте инъекции у части животных групп 4 и 5 (доза лекарственного средства 500 и 1500 мг/кг) образовывался подкожный инфильтрат. Половых различий не зарегистрировано. Внутрибрюшинное введение вещества MM-D37K в дозе до 10 мг/кг не вызывало гибели животных. В дозе 100 мг/кг обнаружена гибель 1-го самца из 6 экспериментальных животных и 1-ой самки из 6 экспериментальных животных. Введение дозы 150 мг также вызвало гибель 2 животных (1 самки и 1 самца), при увеличении дозы до 500 мг/кг наблюдалась гибель 1 самца и 2 самок, что составило 25%. Максимальную толерантную дозу для вещества MM-D37K при однократном внутрибрюшинном введении крысам можно считать 10 мг/кг.
Внутривенное введение
При введении доз 100-350 мг/кг через 1-3 минуты у всех мышей наблюдалась гиподинамия, одышка и проходящая параплегия (в течение первого дня наблюдения мыши при передвижении тянули задние лапки). На вторые сутки состояние нормализовалось. На меньших дозах признаки интоксикации не отмечались. На протяжении оставшихся 12 дней наблюдения животные опытных групп по поведению и внешнему виду не отличались от контрольных. Гибели животных и местно-раздражающего действия зарегистрировано не было.
При введении препарата крысам наблюдалась следующая клиническая картина:
- 5 мг/кг - через 10 мин наблюдались саливация, одышка. В течение часа состояние возвращалось к норме.
- 20 мг/кг - через 10 мин наблюдались гиподинамия, одышка, атаксия, взъерошенность шерсти. Состояние сохранялось в течение 1 суток. На вторые сутки состояние возвращалось к норме.
- 1 00 мг/кг - через 6 мин наблюдались атаксия, гиподинамия, одышка, взъерошенность шерсти. Состояние сохранялось в течение 1 суток. На вторые сутки состояние возвращалось к норме.
- 1 50 мг/кг - через 2 мин наблюдались атаксия, гиподинамия, одышка, взъерошенность шерсти, периодические судорожные подергивания. Состояние сохранялось в течение 3 суток. Зарегистрирована частичная гибель при явлениях паралич на 3 сутки. На третьи сутки у выживших животных состояние возвращалось к норме.
- 500 мг/кг - через 2 мин наблюдались атаксия, гиподинамия, одышка, взъерошенность шерсти, периодические судорожные подергивания. Состояние сохранялось в течение 3 суток. Зарегистрирована частичная гибель при явлениях паралича на 2 сутки. На третьи сутки у выживших животных состояние возвращалось к норме.
При внутривенном введении вещества MM-D37K в дозе 150 мг/кг вызывало гибель 3-х самцов из 6-ти и 3-х самок из 6-ти, что составило 50%. При увеличении дозы до 500 мг/кг погибло 100% животных. Снижение дозы до 100 мг/кг не вызвало гибели животных. Максимальную толерантную дозу для вещества MM-D37K при однократном внутривенном введении можно считать 1 00 мг/кг. Подкожное введение
При введении мышам доз 100-350 мг/кг через 1-3 минуты у всех животных наблюдалась гиподинамия, одышка и проходящая параплегия (в течение первого дня наблюдения мыши при передвижении тянули задние лапки). На вторые сутки состояние нормализовалось. На меньших дозах признаки интоксикации не отмечались. На протяжении оставшихся 12 дней наблюдения животные экспериментальных групп по поведению и внешнему виду не отличались от контрольных. Местно-раздражающего действия не зарегистрировано.
Крысы опытных групп по поведению и внешнему виду не отличались от контрольных. Гибель крыс при подкожном введении ММ^37К отсутствует. На 3-5 день после введения в месте инъекции подкожно у всех животных образуется уплотнение. На 7 день в месте введения ММ^37К появляется изъязвление. Половых различий не зарегистрировано. Животные из контрольной и опытных групп потребляли воду и корм одинаково в течение всего времени наблюдения. Различий между самками и самцами в действии исследуемого препарата не зарегистрировано. Вес животных, получавших исследуемую субстанцию, имел тенденцию к равномерному увеличению на протяжении всего срока исследования, как в контрольной, так и в опытных группах. Различий между самками и самцами в действии исследуемого препарата не зарегистрировано.
На 14 сутки эксперимента животных подвергали некропсии, проводили гематологический и биохимический анализы крови, гистологические исследования состояния внутренних органов. Гематологическое исследование включало оценку следующих показателей: лейкоциты, лимфоциты, гранулоциты, гемоглобин, эритроциты,
гематокрит, средний объем эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, тромбоциты, средний объем тромбоцита. По результатам гематологических исследований достоверных отличий исследуемых параметров у крыс контрольной группы от экспериментальных не зарегистрировано, патологических сдвигов не отмечено. Различий между самками и самцами в действии исследуемого препарата внутри групп не зарегистрировано.
Биохимическое исследование сыворотки крови животных включало анализ следующих показателей: общий белок, АСТ, АЛТ, ЛДГ, щелочная фосфатаза, мочевина, креатинин, глюкоза, общие липиды, холестерин, билирубин общий, азот мочевины, альбумины, глобулины, соотношение альбумины/глобулины. По результатам биохимических исследований достоверных отличий исследуемых параметров у крыс и мышей контрольных групп от опытных, как и патологических сдвигов не наблюдалось. Различий между самками и самцами в действии исследуемого препарата не зарегистрировано.
Проведенное вскрытие и гистологическое исследование у животных, получавших ММИ37К, не выявило у них каких-либо заметных патологических изменений внутренних органов. В Таблицах 3 и 4 приведены данные изменения масс внутренних органов крыс при различных способах введения препарата ММ-037К в дозе 100 мг/кг. Значимых отличий от контроля зарегистрировано не было (Р > 0.05).
Таблица 3. Массовые коэффициенты внутренних органов белых крыс-самцов после введения препарата MM-D37K в дозе 100 мг/кг
Орган Экспериментальная группа
Контроль Рег оя введение в/б введение в/в введение п/к введение
Головной мозг 4,8±0,4 5,1±0,4 5,2±0,5 5,3±0,6 4,7±0,6
Легкие с трахеей 5,6±0,5 5,2±0,5 4,4±0,3 4,8±0,6 5,1±0,2
Печень 30,1±1,9 29,8±0,4 26,7±1,4 26,8±1,9 27,6±1,2
Сердце 3,2±0,2 3,6±0,1 3,2±0,2 3,2±0,1 3,1±0,1
Тимус 1,0±0,2 1,0±0,1 1,1±0,2 0,99±0,1 1,0±0,1
Селезенка 4,7±0,5 5,0±0,6 4,7±0,3 4,7±0,2 4,5±0,1
Почки (левая) 3,3±0,2 3,8±0,09 3,3±0,3 3,1±0,3 3,0±0,1
Надпочечники (левый) 0,10±0,01 0,10±0,01 0,10±0,01 0,10±0,01 0,10±0,01
Яички 6,8±0,1 6,5±0,1 6,3±0,2 6,5±0,3 6,6±0,2
Таблица 4. Массовые коэффициенты внутренних органов белых крыс-самок после введения препарата MM-D37K в дозе 100 мг/кг
Орган Экспериментальная группа
Контроль Рег оя введение в/б введение в/в введение п/к введение
Головной мозг 4,4±0,3 4,8±0,6 5,1±0,7 5,2±0,7 4,8±0,6
Легкие с трахеей 4,5±0,8 4,3±0,1 4,6±0,4 4,8±0, 3 5,0±0,5
Печень 31,1±1,3 30,08±1,5 32,9±1,3 30,63±1,1 29,93±1,3
Сердце 3,1±0,1 3,2±0,3 3,5±0,1 3,4±0,2 3,1±0,1
Тимус 1,1±0,1 0,9±0,1 1,2±0,1 1,3±0,1 1,2±0,1
Селезенка 4,5±0,3 4,57±0,1 4,49±0,9 4,8±0,2 4,5±0,2
Почки (левая) 3,1±0,09 2,8±0,1 3,1±0,2 2,9±0,09 3,1±0,1
Надпочечники (левый) 0,10±0,1 0,09±0,09 0,10±0,09 0,09±0,09 0,10±0,09
Яичники 0,10±0,01 0,10±0,02 0,11±0,01 0,12±0,01 0,11±0,01
При патологоанатомическом исследовании были отмечены признаки местно-раздражающего действия при внутрибрюшинном и подкожном введении доз более 100 мг/кг. При внутривенном и пероральном введении местно-раздражающего действия не зарегистрировано. Различий между самками и самцами в действии исследуемого препарата не зарегистрировано. Заключение
Результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней после острого введения, а также данные лабораторных исследований и некропсии, позволяют отнести MM-D37K к 4 классу малотоксичных лекарственных веществ (ГОСТ 12.1.007-76) [11]. Вес животных, получавших исследуемый препарат, имел
тенденцию к равномерному увеличению на протяжении всего срока исследования, как в контрольной, так и в опытных группах. Различий между самками и самцами в действии исследуемого препарата не зарегистрировано. Проведенное вскрытие не выявило у них каких-либо заметных патологических изменений внутренних органов. Раздражающего действия в месте введения не зарегистрировано. Различий между самками и самцами в действии исследуемого препарата не зарегистрировано.
Помимо этого, результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными, а также данные некропсии, показали, что MM-D37K у половозрелых мышей и крыс обоих полов при введении однократно не влияет на потребление воды и корма, не оказывает влияния на гематологические и биохимические параметры крови.
Зарегистрировано местно-раздражающее действие при внутрибрюшинном и подкожном введении. При внутривенном и пероральном введении местно-раздражающего действия не зарегистрировано. Несмотря на возникновение одышки у некоторых животных, следует отметить, что данное явление было обратимо, а гистологическое исследование тканей легких не выявило каких-либо отличий от контроля.
Проведенное исследование позволило установить токсические концентрации MM-D37K, которые существенно выше действующих терапевтических доз разрабатываемого ЛС, что позволяет планирование дальнейших исследований и выход на клинические исследования предлагаемого нового противоопухолевого препарата. Список литературы
1. Кулинич Т.М., Шишкин А.М., Иванов А.В. и др. Исследование противоопухолевых свойств пептидных последовательностей, ингибиторов взаимодействия циклина D1 и циклинзависимых киназ 4/6. Российский биотерапевтический журнал. 2018. Т. 17. № S. С. 38-40.
2. Боженко В.К., Кулинич Т.М., Кудинова Е.А. и др. Исследование цитостатических и
цитотоксических свойств модифицированных пептидных ингибиторов CDK4/6,
функциональных аналогов p16INK4a (90-97). Успехи молекулярной онкологии. 2020. Т. 7. № 4. С. 37-45. DOI: 10.17650/2313-805X-2020-7-4-37-45.
3. Боженко В.К., Кулинич Т.М., Иванов А.В. и др. Исследование влияния интернализуемого пептида p16ink4a на краткосрочные культуры опухолей человека. Вопросы онкологии. 2009. Т. 55. № 4. С. 451-454.
4. Харченко В.П., Боженко В.К., Кулинич Т.М., Кудинова Е.А.. Патент № 2369402 C1 Российская Федерация, МПК A61K 38/17, A61K 39/385, A61P 35/00. Химерный пептид для лечения эпителиальных и мезенхимальных злокачественных новообразований: № 2008114594/15: заявл. 17.04.2008: опубл. 10.10.2009. Заявитель Федеральное государственное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи".
5. Уханова Е.М., Кулинич Т.М., Кудинова Е.А. и др. Терапевтические дозовые характеристики химерного пептида MM-D37K при парентеральном введении мышам Balb/с nude с колоректальным раком человека НСТ-116. Российский биотерапевтический журнал. 2017. Т. 16. № 2. С. 36-41. DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-2-36-41.
6. Федеральный закон "Об обращении лекарственных средств" от 12.04.2010 N 61-ФЗ.
7. ГОСТ 53434-2009 от 02.12.2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики (GLP)».
8. Методические указания по изучению общетоксического действия противоопухолевых фармакологических средств. В кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Р.У. Хабриева. М.: Медицина. 2005. C. 170-204.
9. Приложение № 4 «Порядок проведения эвтаназии (умерщвления животного)» к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных приказа Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755.
10. Close B., Banister K., Baumans V., et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 1. DGXI of the European Commission. Lab Anim. 1997. V. 31. No. 1. P. 1-32. DOI: 10.1258/002367797780600297.
11. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. ГОСТ 12.1.007-76. Дата введения в действие 01.01.1977.
